脂環(huán)酸芽胞桿菌對(duì)果汁危害的研究

丁金英， 葛含靜， 吳永娟 ， 楊苗苗*， 王 力， 南小寧

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.西安丹若爾石榴酒業(yè)有限公司，陜西 臨潼 710611；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西 西安 710100)

脂環(huán)酸芽胞桿菌對(duì)果汁危害的研究

丁金英1， 葛含靜4， 吳永娟4， 楊苗苗4*， 王 力2*， 南小寧3

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.西安丹若爾石榴酒業(yè)有限公司，陜西 臨潼 710611；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；4.陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西 西安 710100)

概述了脂環(huán)酸芽胞桿菌的種類、特點(diǎn)、性質(zhì)、全基因組測(cè)序狀況、果汁中脂環(huán)酸芽胞桿菌的來(lái)源、傳播途徑、對(duì)果汁的危害、鑒定檢測(cè)方法等，并就該菌的研究意義、目前果汁生產(chǎn)中存在的問(wèn)題等進(jìn)行了分析，旨在為控制脂環(huán)酸芽胞桿菌的污染提供理論依據(jù)。

脂環(huán)酸芽胞桿菌；嗜酸耐熱菌；果汁；酸敗

脂環(huán)酸芽胞桿菌(Alicylobacillusspp.)，又稱嗜酸耐熱菌或耐熱菌，中度嗜酸(pH 2.0～6.0)、耐熱(45～45 ℃)、革蘭陽(yáng)性或少數(shù)生長(zhǎng)后期可變?yōu)楦锾m陰性、嚴(yán)格需氧、桿狀、產(chǎn)芽胞。脂環(huán)酸芽胞桿菌均具二級(jí)結(jié)構(gòu)且其相似性極高，研究發(fā)現(xiàn)，Alicylobacilluspomorum細(xì)胞膜中不含有ω-環(huán)狀脂肪酸，因此該屬菌的顯著特征已不再是胞膜中是否具有 ω-環(huán)狀結(jié)構(gòu)[1]。目前果汁生產(chǎn)中所采用的巴氏滅菌法無(wú)法消除脂環(huán)酸芽胞桿菌，該菌可引起酸性果汁腐敗、后渾濁、產(chǎn)生白色沉淀并伴有不愉快氣味等危害，嚴(yán)重影響到我國(guó)果汁，尤其是濃縮蘋(píng)果汁的國(guó)際化發(fā)展[1-3]。本文概述了脂環(huán)酸芽胞桿菌種類、特性、快速檢測(cè)、質(zhì)量控制及目前果汁生產(chǎn)過(guò)程中存在的問(wèn)題，并提出了控制該菌的建議，以期為減少果汁的危害提供理論依據(jù)。

1 脂環(huán)酸芽胞桿菌種類、全基因組序列情況、特點(diǎn)及性質(zhì)

1.1 脂環(huán)酸芽胞桿菌的種類

Cerny于1982年首次從酸敗的蘋(píng)果汁中分離到嗜酸耐熱菌并命名為脂環(huán)酸芽胞桿菌，Wisotzkey于1992年根據(jù)該菌細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的種類，將其劃分為一個(gè)獨(dú)立的屬，目前，該菌現(xiàn)已增至 20個(gè)種、2個(gè)亞種和2個(gè)暫定種，主要包括A.acidocaldarius、A.acidiphilus、A.contaminans、A.cycloheptanicus、A.disulfidooxidans、A.fastidiosus、A.genomicspecis1、A.genomicspecis2、A.sendaiensis、A.herbarius、A.hespridum、A.mali、A.tolerans、A.pomorum、A.vulcanalis等[4-7]，Goto等構(gòu)建了菌株之間的進(jìn)化關(guān)系(圖1)。

圖1 脂環(huán)酸芽胞桿菌屬部分菌株基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[4]Fig.1 Phylogenetic distance tree derived from coMParison of the 16S rRNA gene sequences of Alicyclobacillus species[4]

1.2 脂環(huán)酸芽胞桿菌全基因組序列研究

目前有16株脂環(huán)酸芽胞桿菌完成了全基因組序列的測(cè)序，測(cè)序菌種名錄見(jiàn)表1。詳細(xì)信息見(jiàn)網(wǎng)址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=29330。

1.3 脂環(huán)酸芽胞桿菌的特性及對(duì)果汁的危害

大多數(shù)脂環(huán)酸芽胞桿菌呈革蘭陽(yáng)性，Alicyclobacillusendaiensis為革蘭陰性，A.fastidiosus生長(zhǎng)后期呈革蘭陰性，pH 2.5～6.0的酸性環(huán)境下生長(zhǎng)，能在接近端點(diǎn)或終端產(chǎn)生芽胞，其中接近端點(diǎn)部位的芽胞結(jié)構(gòu)有或沒(méi)有腫脹芽胞囊。菌落(在BAM 培養(yǎng)上)呈白色，乳脂狀，扁平，圓形，直徑0.8～5.0 mm，中心稍凸起，有同心圓，不易挑起，半透明，不產(chǎn)生色素，無(wú)味[5-7]。大多數(shù)脂環(huán)酸芽胞桿菌細(xì)胞膜含有ω-環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂肪酸，Kannan等證明該結(jié)構(gòu)的脂肪酸在細(xì)胞膜上緊密排列成環(huán)狀，形成保護(hù)膜，耐受高溫，這種性質(zhì)為微生物在高溫和低pH 的環(huán)境中生長(zhǎng)提供了保障[1，8]。研究發(fā)現(xiàn)不同的脂環(huán)酸芽胞桿菌芽胞耐熱性與關(guān)聯(lián)的環(huán)境不同，A.cidoterrestris與熱穩(wěn)定蛋白、二吡啶酸的含量及礦質(zhì)離子等有關(guān)，與pH無(wú)關(guān)；低酸條件下,A.cidoterrestris與Mn2+和Ca2+的結(jié)合能力比其他脂環(huán)酸芽胞桿菌強(qiáng)，此外，去礦物質(zhì)化利于芽胞耐熱[9]。

表1 16株全基因組測(cè)序的脂環(huán)酸芽胞桿菌

脂環(huán)酸芽胞桿菌Alicyclobacillus不危害濃縮酸性果汁，但當(dāng)濃縮酸性果汁稀釋成飲用果汁時(shí)，該菌就會(huì)繁殖代謝，常溫下代謝產(chǎn)生具有難聞氣味的2，6-二溴苯酚、2，6-二氯苯酚和愈創(chuàng)木酚(圖2)，并產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致果汁后混濁，品質(zhì)降低。

圖2 脂環(huán)酸芽胞桿菌的主要代謝產(chǎn)物Fig.2 The main metabolites of Alicylobacillus spp.A:愈創(chuàng)木酚;B:2，6-二溴苯酚;C:2，6-二氯苯酚A:guaiacol;B:2,6-dibromophenol;C:2,6-dichlorophenol

2 果汁中的脂環(huán)酸芽胞桿菌來(lái)源、鑒定及其他分子生物學(xué)研究

2.1 脂環(huán)酸芽胞桿菌的來(lái)源

大量研究表明，土壤、溫泉、肥料、硫磺礦、有機(jī)物、火山噴氣孔濕土等環(huán)境均有脂環(huán)酸芽胞桿菌的分布，而其最根本的來(lái)源是土壤[4-7，10]。近年來(lái)，土壤、火山、溫泉、有機(jī)物、礦物質(zhì)、果園、果汁加工車間中空氣、車間加工水、巴氏滅菌酸性果汁、熱加工食品、蘋(píng)果、梨、檸檬、橘子、蔓越橘、香蕉、櫻桃、黑醋栗、藍(lán)莓、葡萄柚、芒果、菠蘿、番茄、西瓜等及其水果加工制品中分離到了脂環(huán)酸芽胞桿菌[11-19]。作者從陜西渭南蘋(píng)果園土壤及落果中分離到了脂環(huán)酸芽胞桿菌[20]。

研究認(rèn)為脂環(huán)酸芽胞桿菌是導(dǎo)致果汁酸敗的主要原因，而果汁中該菌的最初來(lái)源為土壤，然后通過(guò)落果、爛果、果皮、已感染的加工車間設(shè)備及空氣等途徑進(jìn)入果汁[1,7，21]。

2.2 脂環(huán)酸芽胞桿菌的鑒定研究方法

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定法 脂環(huán)酸芽胞桿菌呈桿狀，菌落乳白色不透明，菌落直徑0.8～5 mm，表面較光滑或有同心圓，扁平或中心凸起，隨著菌齡的增長(zhǎng)，菌落顏色逐漸加深直至褐色，無(wú)味，營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞(3.0～5.0)μm×(0.7～1.0)μm，芽胞中生、端生或次端生，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞隨著芽胞的萌發(fā)逐漸膨大[22]。

2.2.2 基于16S rDNA的同源性分析法 近年來(lái)，16S rDNA序列分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物同源性分析。我國(guó)已成功建立了基于16SrDNA-PCR-RFLP技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速分類和鑒定蘋(píng)果濃縮汁全產(chǎn)業(yè)鏈中嗜酸耐熱菌的方法[23]。Goto等[5]和 Mignard等[24]通過(guò)分析16S rDNA可變區(qū)實(shí)現(xiàn)了不同脂環(huán)酸芽胞桿菌之間的區(qū)分，研究發(fā)現(xiàn)利用該菌屬高度可變區(qū)5′端進(jìn)行不同菌種鑒定時(shí)，其序列相似性為82.3%～98.1%。

2.2.3 代謝產(chǎn)物分析法 引起酸性果汁酸敗的主要物質(zhì)是脂環(huán)酸芽胞桿菌的3種代謝產(chǎn)物，愈創(chuàng)木酚、2，6-二氯苯酚和 2，6-二溴苯酚(圖2)[5，25]。其中，代表性的代謝產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚，該物質(zhì)在果汁中的含量很高，具有很強(qiáng)的揮發(fā)性。因此，可以利用果汁中愈創(chuàng)木酚的檢測(cè)結(jié)果判斷果汁是否被脂環(huán)酸芽胞桿菌所污染[26-28]。目前愈創(chuàng)木酚的主要檢測(cè)方法是定量檢測(cè)試劑盒[29]和氣相質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(GC-MS)[30]。Zierler等、楊康[31]和袁亞宏[10]分別在GC-MS基礎(chǔ)上建立了基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(SPME-GC-MS法)的愈創(chuàng)木酚快速檢測(cè)方法。此外Orr等[32]構(gòu)建了氣相色譜嗅覺(jué)器-氣相色譜-質(zhì)譜儀串聯(lián)法和感官評(píng)價(jià)與氣相色譜結(jié)合法。

2.2.4 API-50 CHB系統(tǒng)鑒定方法 API鑒定系統(tǒng)被譽(yù)為細(xì)菌鑒定的“國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)”。劉曉柯[33]將 API-50 CHB試劑條與微量pH計(jì)結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建的脂環(huán)酸芽胞桿菌的快速鑒定方法，實(shí)現(xiàn)了微生物快速鑒定與分型。

2.2.5 其他快速分離與檢測(cè)技術(shù) 近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、傅里葉變換近紅外光譜(FT-IR)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、電子鼻、免疫磁性微球及與其他檢測(cè)方法聯(lián)用等方法也應(yīng)用于脂環(huán)酸芽胞桿菌的檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的脂環(huán)酸芽胞桿菌檢測(cè)方法及分離技術(shù)體系大大提高了該菌分離和檢測(cè)的效率，脂環(huán)酸芽胞桿菌快速檢測(cè)試劑盒更是具有快速、便捷、準(zhǔn)確、靈敏等快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)[34-35]。

2.3 分子生物學(xué)研究

在全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，脂環(huán)酸芽胞桿菌的遺傳特征、環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)理及代謝途徑、耐熱、耐酸、耐氧化等基因克隆及其生物學(xué)信息的研究也成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[36]。如，在分子水平上解析脂環(huán)酸芽胞桿菌耐熱、酸、氧化等環(huán)境脅迫適應(yīng)性機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi)發(fā)耐高溫、耐酸或耐其他環(huán)境脅迫的高效發(fā)酵微生物，為發(fā)酵業(yè)開(kāi)發(fā)新的發(fā)酵菌株提供了理論基礎(chǔ)[37]。

3 脂環(huán)酸芽胞桿菌對(duì)果汁的危害

迄今為止沒(méi)有脂環(huán)酸芽胞桿菌對(duì)人類健康產(chǎn)生影響的報(bào)道[5]。但脂環(huán)酸芽胞桿菌對(duì)酸性果汁尤其是蘋(píng)果濃縮汁及其加工產(chǎn)業(yè)卻造成了嚴(yán)重的威脅。當(dāng)蘋(píng)果汁飲料中可溶性固形物含量小于 18 °Brix 時(shí)，脂環(huán)酸芽胞桿菌可大量繁殖并代謝產(chǎn)生伴有消毒水氣味的愈創(chuàng)木酚、2-6-二溴苯酚和 2-6-二氯苯酚等物質(zhì)導(dǎo)致果汁酸敗，飲料容器底部產(chǎn)生不溶性白色沉淀，果汁酸敗濁度升高、顏色變深，嚴(yán)重影響果汁的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。

4 脂環(huán)酸芽胞桿菌研究意義、存在問(wèn)題及展望

自二十世紀(jì)末在歐美、日本先后發(fā)生蘋(píng)果汁酸敗事件以來(lái)，脂環(huán)酸芽胞桿菌引起了世界高度關(guān)注。目前，中國(guó)已成為世界最大的蘋(píng)果濃縮汁生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，果汁生產(chǎn)中采用的巴氏殺菌方法無(wú)法消除脂環(huán)酸芽胞桿菌，該菌已成為嚴(yán)重影響中國(guó)濃縮蘋(píng)果汁國(guó)際化發(fā)展的“綠色技術(shù)壁壘”之一[2，32]。因此，建立精確、高效、便捷的脂環(huán)酸芽胞桿菌鑒定檢測(cè)方法、安全質(zhì)量控制體系及受污染產(chǎn)品的處理方法對(duì)保證和促進(jìn)中國(guó)蘋(píng)果汁產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有十分重要的社會(huì)意義。

大量研究表明，脂環(huán)酸芽胞桿菌是導(dǎo)致果汁酸敗的主要原因之一，其最初來(lái)源于果園土壤，然后通過(guò)落果、爛果、果皮、已感染的加工車間設(shè)備、車間空氣等途徑傳播[1，6-7，22]。近年來(lái)，中國(guó)濃縮汁蘋(píng)果產(chǎn)量及出口量在國(guó)際貿(mào)易中占據(jù)重要比例，但俄羅斯、美國(guó)、加拿大、日本等濃縮汁蘋(píng)果的主要進(jìn)口國(guó)對(duì)蘋(píng)果汁產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性提出了高標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)，蘋(píng)果汁需求國(guó)政府為了保護(hù)本國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)，進(jìn)一步提高了進(jìn)口蘋(píng)果產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。而目前中國(guó)眾多的果汁企業(yè)為了降低成本，以落果、爛果為果汁的主要加工原料，由此生產(chǎn)的蘋(píng)果汁存在脂環(huán)酸芽胞桿菌污染是不可避免的，在進(jìn)口國(guó)高標(biāo)準(zhǔn)的要求下，中國(guó)的蘋(píng)果濃縮汁產(chǎn)業(yè)必定面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前該菌的防治主要集中在原料選擇、剔除爛果，清洗和消毒加工車間設(shè)備，成品中采用抑菌物等措施，一定程度上減少了果汁中脂環(huán)酸芽胞桿菌的污染。但由于該菌生長(zhǎng)的特殊環(huán)境加之其在低濃度和常溫下繁殖速率非?？?，從根本上滿足不了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此，要減少脂肪酸芽胞桿菌對(duì)果汁的危害，須從生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行控制，而最切實(shí)有效的方法是從源頭上控制，避免利用落果、爛果生產(chǎn)果汁，避免儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程造成腐爛。

脂環(huán)酸芽胞桿菌作為影響蘋(píng)果濃縮汁產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵安全因子之一，嚴(yán)重制約了中國(guó)蘋(píng)果及其加工產(chǎn)業(yè)的國(guó)際化發(fā)展。因此，控制果汁中脂環(huán)酸芽胞桿菌的污染，提高蘋(píng)果汁品質(zhì)具有非常重要的社會(huì)意義。針對(duì)目前蘋(píng)果汁脂環(huán)酸芽胞桿菌的研究現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題，有以下幾點(diǎn)建議：① 健全果汁質(zhì)量監(jiān)管體系，借鑒目前美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛應(yīng)用于食品企業(yè)的國(guó)際通用質(zhì)量保證體系——“危害分析及關(guān)鍵控制點(diǎn)(HACCP)”來(lái)規(guī)范我國(guó)果汁質(zhì)量安全監(jiān)管，并將該體系完善規(guī)范化延伸于整個(gè)食品安全管理。② 在濃縮蘋(píng)果汁的生產(chǎn)上要從原料抓起，避免采用落果、爛果進(jìn)行果汁加工，對(duì)各個(gè)生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)。③ 將已建立的快速檢測(cè)手段運(yùn)用于果汁生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，如抽檢加工原料，建立該菌污染的應(yīng)急措施，避免造成后期損失等。④ 目前脂肪酸芽胞桿菌的分離、鑒定和果汁生產(chǎn)過(guò)程中的防控研究較多，而對(duì)土壤中該菌的萌發(fā)、繁殖和有效控制方法研究較少，以期從源頭上控制該菌的研究尚處于空白，相比之下在植物病害防控方面，致病菌孢子的萌發(fā)條件、生物防治等已有大量研究。因此，如何控制土壤中脂肪酸芽胞桿菌，從源頭上控制該菌有待進(jìn)一步研究。

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[31]楊康. 源于蘋(píng)果汁的嗜酸耐熱菌生長(zhǎng)代謝動(dòng)力學(xué)及紅外光譜快速檢測(cè)技術(shù)研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

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[36]謝振榮. 脂環(huán)酸芽孢桿菌D-1 全基因組測(cè)序分析及羧酸酯酶的研究[D]. 昆明：云南師范大學(xué)，2014.

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Harm ofAlicylobacillusspp. to Fruit Juice

DING Jin-ying1, GE Han-jing4, WU Yong-juan4, YANG Miao-miao4, WANG Li2, NAN Xiao-ning3

(1.NingxiaColl.ofVocat′lTechnol.,Yinchuan750021; 2.ThecompanyoftheXiaoTanerelPomegranateBrewerg,Lintong710611;3.NWUni.ofAgric, &Forestry,Yangling712100；4.ShaanxiPreschl.NormalColl.,Xi′an710100)

The kinds, features, characteristics, and the status of complete genome sequencing, the source ofAlicylobacillusspp. in fruit juice, its transmission pathway, its harm to fruit juice, and identification and detection method ofAlicylobacillusspp. were outlined. At the same time, the research significance and the existing problems in present juice production were analyzed, aiming to provide the theoretical references to control contamination ofAlicylobacillusspp.

Alicylobacillusacidoterrestris; thermophilous acidophilic bacteria; juice; rancidity

陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(15JK1183)；陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016NY-204,2016JQ3036)

丁金英 女，博士，三級(jí)教授。主要從事生物學(xué)科研及教學(xué)工作。E-mail: djy1958@126.com

* 通訊作者。楊苗苗，女，博士，助理研究員。主要從事植物保護(hù)及其生物制品研究。E-mail: yangmmgg@163.com

2016-12-23；

2017-03-17

Q939.97

A

1005-7021(2017)03-0128-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.021

王力 男，大專，初級(jí)工程師。主要從事果汁加工生產(chǎn)與研究工作。E-mail:489674175@qq.com

楊苗苗為共同通訊作者，貢獻(xiàn)等同于王力。