山楂葉提取物中牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷對照品的制備

文蕾, 林云良, 高紅梅, 李峰, 姜姣姣, 宋祥云, 付瑞明, 王岱杰*

(1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

山楂葉提取物中牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷對照品的制備

文蕾1, 林云良2, 高紅梅2, 李峰2, 姜姣姣1, 宋祥云2, 付瑞明2, 王岱杰2*

(1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

采用高速逆流色譜結合半制備液相色譜技術快速分離山楂葉中低含量的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷單體。以氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)為溶劑系統(tǒng)，流速為5.0 mL/min，轉速為850 r/min，檢測波長為254 nm，從山楂葉黃酮提取物中富集得到含牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種化合物的混合組分，經半制備液相進行二次分離純化，得到純度大于98%的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷單體。研究結果表明，該技術對山楂葉中低含量黃酮類化合物的分離快速、高效，且純度高。

山楂葉；牡荊素；金絲桃苷；異槲皮苷；高速逆流色譜；半制備液相色譜

山楂葉(Crataegi Folium)為薔薇科(Rosaceae)植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN. E. Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂等多種功效，在我國山東、陜西、山西等地均廣泛分布[1]。山楂葉作為山楂果實的副產物，資源豐富、產量高，具有廣泛的開發(fā)價值?，F(xiàn)代藥理研究表明，山楂葉具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎和鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2-5]，已廣泛地應用于山玫膠囊、益心酮片等多種中成藥中。牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷為黃酮類化合物，是《中國藥典》中規(guī)定的山楂葉、山楂葉提取物及相關制劑的檢測指標[6]。這3種成分在山楂葉中含量較低，采用聚酰胺柱聚酰胺色譜、硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜等傳統(tǒng)制備方法，具有分離時間長、重現(xiàn)性差、死吸附嚴重、溶劑消耗量大等問題[7-14]。

為了克服上述缺點，我們運用高速逆流色譜結合半制備液相色譜技術，對山楂葉中含量較低的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分進行分離純化，得到高純度的單體，為進一步開發(fā)山楂葉資源提供了技術支持。3種化合物化學結構式見圖1。

圖1 山楂葉中3種黃酮類化合物的結構式Fig.1 Chemical structures of 3 flavonoids from leaves of Crataegi Folium

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

TBE-300C高速逆流色譜儀(上海同田生物技術股份有限公司)；8823A紫外檢測器(北京艾美林科技有限公司)；TBP-5002輸液泵(上海同田生物技術股份有限公司)；3057便攜式記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)；DC-0506恒溫水浴槽(上海同田生物技術股份有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters)；半制備用儀器采用LC-3000液相色譜系統(tǒng)(北京普源精電科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

實驗用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇為分析純(國藥集團藥業(yè)股份有限公司)；高效液相色譜儀用乙腈為色譜純(美國Fisher)，水為娃哈哈純凈水。

山楂葉黃酮提取物(陜西昊辰生物科技有限公司)，黃酮質量分數(shù)為80%。

1.2 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實驗中高速逆流色譜所用溶劑體系為氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)，按比例將4種溶劑置于2 L分液漏斗中，充分震蕩，靜置分層，上相為固定相，下相為流動相，使用前超聲波脫氣。

取山楂葉黃酮提取物800 mg，用上下相各15 mL溶解。

1.3 分配系數(shù)KD值的測定

取2 mg山楂葉總黃酮樣品置于2 mL試管中，加入2 mL下相，取5 μL溶液注入HPLC檢測，記錄相應峰的峰面積為A1。加入2 mL上相于試管中，充分震蕩，靜置分層，取下相溶液5 μL注入HPLC，記錄相應的峰面積為A2，KD= (A1-A2)/A2[15]。

1.4 高速逆流色譜分離

將高速逆流色譜溶劑體系的上相以30 mL/min注入儀器的分離柱聚四氟乙烯管中，啟動儀器至850 r/min，以5.0 mL/min泵入流動相，當達到流體動力學平衡，即流動相從出口流出，無固定相流出時，將樣品溶液注入儀器的進樣圈，開啟記錄儀和檢測器，檢測波長設為254 nm，依據(jù)檢測器的色譜圖手動收集流出液。

1.5 半制備液相色譜制備

將含有牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分的樣品使用流動相溶解，YMC采用YMC C18色譜柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)進行二次制備，流動相為乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，檢測波長254 nm。

1.6 HPLC分析和結構鑒定

山楂葉提取物、高速逆流色譜及半制備液相色譜所得各組分均采用HPLC進行分析。色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱(100 mm × 4.6 mm, 2.5 μm)，檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min；洗脫溶劑為乙腈和水，梯度條件為：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈。

2 結果與分析

2.1 HPLC條件優(yōu)化

本文分別考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，梯度和等度液相條件洗脫對樣品分離的效果。研究結果表明，當采用乙腈-水進行梯度洗脫，梯度條件為：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈時，各組分可以得到良好的分離。

2.2 HSCCC分離條件的優(yōu)化及上樣量的考察

本文分別考察了不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)、氯仿-甲醇-水(4∶3∶2，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)體系對高速逆流色譜分離的影響。結果表明，當采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇V水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)體系時， 牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷主要集中于下相，3種化合物被快速洗脫出，未能實現(xiàn)有效的分離。當采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)體系時，3種化合物洗脫時間過長，分離效率較低。增加正丁醇的含量，洗脫時間縮短，當正丁醇增至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)時，溶液不能分層，無法進行分離。當正丁醇降至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)時，3種化合物可以與其他色譜峰實現(xiàn)良好的分離，但由于3種化合物的KD值接近，即使調整逆流色譜分離的流速或者轉速，3種化合物色譜峰均被同時洗脫出出來，見圖2。因此，本文采用半制備液相色譜對3種化合物進行二次分離制備。

圖2 山楂葉總黃酮的高速逆流色譜圖Fig.2 Chromatogram of total flavonoids from Crataegi Folium by HSCCC

本文基于分離效率考察了不同上樣量的山楂葉總黃酮提取物對逆流色譜分離的影響，結果表明，上樣量增加至800 mg時，仍可以實現(xiàn)牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3個峰與其他色譜峰的逆流色譜分離，得到含有上述3種化合物的混合物98.6 mg。

2.3 半制備液相色譜分離

本實驗考察了不同比例的乙腈-水體系對牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種化合物分離效率的影響，結果表明，當采用YMC C18色譜柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)進行二次制備，流動相為乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，檢測波長254 nm時，3種化合物可以實現(xiàn)基線分離，最終制備得到3種化合物的純度均高于98%。制備圖見圖3，液相色譜圖見圖4。

圖3 逆流色譜粗分物的半制備液相分離色譜圖Fig.3 Chromatogram of pre-HPLC of total flavonoids separated by HSCCC

圖4 山楂葉中黃酮類化合物的HPLC分析圖Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoids from Crataegi Folium

2.4 結構鑒定

化合物1：ESI-MS,m/z433.3 [M+H]+, 431.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 13.16( 1H, s, 5-OH), 6.90 (2H, d,J=6.4 Hz, H-3′, 5′), 6.77 (1H, s, H-3), 6.26 (1H, s, H-6), 4.69 (1H, d,J=9.9 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 181.7 (C-4), 163.7 (C-2), 162.7 (C-7), 161.0 (C-5), 160.3 (C-4′), 156.5 (C-9), 129.6 (C-2′), 128.8 (C-6′), 121.5 (C-1′), 115.7 (C-3′), 115.7 (C-5′), 104.7 (C-8), 104.1 (C-10), 102.4 (C-3), 98.2 (C-6), 81.7 (C-5″), 78.5 (C-3″), 73.3 (C-1″), 70.8 (C-2″), 70.4 (C-4″), 61.1 (C-6″)。與文獻[16]的數(shù)據(jù)進行比對，鑒定為牡荊素。

化合物2：ESI-MS,m/z465.2 [M+H]-, 463.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.64 (1H, s, 5-OH), 10.84 (1H, s, 7-OH), 7.67 (1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.54 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.82 (1H, d,J=8.4 Hz, H-6′), 6.41 (1H, d,J=1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,J=1.6 Hz, H-6), 5.38 (1H, d,J=8.0 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.3 (C-4), 164.5 (C-7), 161.1 (C-5), 156.2 (C-9),156.1 (C-2), 148.4 (C-4′), 144.7 (C-3′), 133.4 (C-3),121.9 (C-6′), 121.0 (C-1′), 115.8 (C-5′), 115.1 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.8 (C-1″), 98.7 (C-6), 93.5 (C-8), 75.7 (C-5″), 73.1 (C-3″), 71.1 (C-2″), 67.8 (C-4″), 60.0 (C-6″)。與文獻[17]的數(shù)據(jù)進行比對，鑒定為金絲桃苷。

化合物3：ESI-MS,m/z463.2 [M-H]-.1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.75 (1H, s, 4′-OH), 7.58 (1H, dd,J= 6.0, 2.0 Hz, H-6′), 7.57 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.46 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.8 (C-4), 164.7 (C-7), 161.7 (C-5), 156.8 (C-9), 156.5 (C-2), 148.9 (C-4′), 145.3 (C-3′), 133.7 (C-3), 122.0 (C-6′), 121.6 (C-1′), 116.6 (C-5′), 115.7 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.4 (C-1″), 99.2 (C-6), 94.0 (C-8), 77.9 (C-5″), 76.8 (C-3″), 74.5 (C-2″), 70.3 (C-4″), 61.3 (C-6″)。與文獻[18]的數(shù)據(jù)進行比對，鑒定為異槲皮苷。

3 討論

本文采用高速逆流色譜結合半制備液相色譜技術，對山楂葉中含量較低的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分進行分離純化，得到高純度的單體。研究結果表明，高速逆流色譜具有樣品無損失、無污染、高效、快速、粗提物進樣、大制備量分離和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合于復雜組分樣品的前處理和富集。制備液相色譜具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，而對組分較雜的樣品，該方法分離效率較低，樣品前處理嚴格。在本研究中將逆流色譜作為富集手段，增大了樣品上樣量，極大提高了富集效率。同時，結合制備液相色譜技術，實現(xiàn)了低含量化合物的快速制備。采用高速逆流色譜與制備液相色譜技術結合，可發(fā)揮二者的優(yōu)勢，為復雜樣品中高純度化合物的分離提供參考。

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Preparation of reference substances of vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium extract

WEN Lei1, LIN Yun-liang2, GAO Hong-mei2, LI Feng2, JIANG Jiao-jiao1, SONG Xiang-yun2, FU Rui-ming2, WANG Dai-jie2*

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Shandong Analysis and Test Center,Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control, Jinan 250014 China)

∶Three low content flavonoids, such as vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium were rapidly separated and purified by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) combined with pre-HPLC. The total flavonoids from Crataegi Folium were firstly separated by HSCCC, with a solvent system of chloroform/methanol/water/n-butanol (4∶3∶2∶1.5,V/V), flow-rate of 5.0 mL/min, rotation speed of 850 r/min, detection wavelength of 254 nm. A mixed component was separated from crude flavonoids, containing vitexin, hyperoside, and isoquercitrin. Then, the mixture was separated by pre-HPLC and vitexin, hyperoside, and isoquercitrin were obtained, with the purity over 98%, respectively, as determined by HPLC. Experimental results show that it is an efficient method for separation of low content flavonoids with high purities from Crataegi Folium by HSCCC combined with pre-HPLC.

∶Crataegi Folium; vitexin; hyperoside; isoquercitrin; HSCCC; pre-HPLC

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.003

2017-03-21

國家自然科學基金((81473298, 21506119)；山東省科技發(fā)展計劃(2014GZX219003)；山東省三院聯(lián)合基金(ZR2016YL006)

文蕾 (1992—)，女，碩士研究生，研究方向為天然產物分離純化與活性研究。

*通信作者，王岱杰。E-mail: wangdaijie@126.com

R284.2

A

1002-4026(2017)04-0013-06