3種點(diǎn)樣方法對(duì)血清蛋白醋酸纖維膜電泳結(jié)果影響的對(duì)比研究

耿少輝 , 陳宇坤, 包 宇, 陳偉姣, 張穎茜, 王 蕾

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州 450008;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 河南 鄭州 450008)

3種點(diǎn)樣方法對(duì)血清蛋白醋酸纖維膜電泳結(jié)果影響的對(duì)比研究

耿少輝1, 陳宇坤1, 包 宇1, 陳偉姣1, 張穎茜1, 王 蕾2

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州 450008;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 河南 鄭州 450008)

研究用蓋玻片、濾紙和蓋玻片+擦鏡紙3種血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳點(diǎn)樣方法對(duì)電泳結(jié)果的影響,評(píng)價(jià)蓋玻片與擦鏡紙相結(jié)合的新型點(diǎn)樣方法在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果,并分析3組的蛋白質(zhì)相對(duì)含量有無(wú)差異。結(jié)果表明：在相同實(shí)驗(yàn)條件下,蓋玻片+擦鏡紙組的電泳結(jié)果優(yōu)于其他2種,3組的蛋白質(zhì)相對(duì)含量無(wú)明顯差異；蓋玻片與擦鏡紙相結(jié)合的點(diǎn)樣方法較單純使用蓋玻片或?yàn)V紙的點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣成功率有很大提高,出現(xiàn)的不良結(jié)果較少,能有效解決學(xué)生在電泳實(shí)驗(yàn)操作中的點(diǎn)樣問(wèn)題,可在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中推廣。

血清蛋白； 醋酸纖維薄膜； 電泳圖譜； 點(diǎn)樣方法

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常開(kāi)設(shè)的基本實(shí)驗(yàn)之一[1-2]。電泳實(shí)驗(yàn)步驟繁多,諸多因素可直接影響電泳所得蛋白質(zhì)條帶結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[3]。點(diǎn)樣作為其中的一個(gè)關(guān)鍵步驟,點(diǎn)樣的成功與否直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4]。點(diǎn)樣操作的失敗,一方面是因?yàn)辄c(diǎn)樣器的自身缺陷；另一方面同時(shí)也是主要方面是點(diǎn)樣人員的熟練度不夠[5]。故選用一種高效且簡(jiǎn)單易操作的點(diǎn)樣方法十分必要。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間教學(xué)實(shí)踐與經(jīng)驗(yàn)總結(jié),王蕾副教授發(fā)明了蓋玻片與擦鏡紙相結(jié)合的點(diǎn)樣方法,教學(xué)實(shí)踐效果較好。本文通過(guò)對(duì)比蓋玻片、濾紙和蓋玻片+擦鏡紙3種點(diǎn)樣方法對(duì)電泳結(jié)果的影響,評(píng)估3種點(diǎn)樣方法在教學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用效果,以提供一種更加有效實(shí)用的醋酸纖維素薄膜電泳點(diǎn)樣方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

北京六一DYY-8C型電泳儀電源,DYCP-38C型臥式水平電泳槽,7200型分光光度計(jì),醋酸纖維素薄膜(2 cm×8 cm),染液缸,漂洗缸,鑷子,濾紙,蓋玻片,擦鏡紙和培養(yǎng)皿等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和材料

試劑:巴比妥緩沖液:pH8.6,本實(shí)驗(yàn)用離子強(qiáng)度為0.07;染色液:氨基黑10B 0.5 g,溶于50 mL甲醇中,再加入冰醋酸10 mL,蒸餾水40 mL,混勻;漂洗液:冰醋酸5 mL,95%乙醇45 mL,蒸餾水50 mL,混勻;洗脫液:0.4 mol/L NaOH溶液[6]。

實(shí)驗(yàn)材料:人血清。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)課開(kāi)始之前,將醋酸纖維素薄膜浸于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中30 min左右,使其充分浸透,濕度均勻無(wú)白點(diǎn)[7],以便于學(xué)生操作。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)選取600名學(xué)習(xí)過(guò)基本實(shí)驗(yàn)操作技能的中西醫(yī)臨床大二學(xué)生,學(xué)生以班級(jí)為單位平均分為3大組,分別采用蓋玻片、濾紙、蓋玻片+擦鏡紙點(diǎn)樣方法進(jìn)行電泳操作。不告知學(xué)生3種同點(diǎn)樣方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.3 點(diǎn)樣

將完全浸透后的醋酸纖維素薄膜用鑷子輕輕取出,夾于濾紙中輕壓,吸去多余的溶液。

蓋玻片組:手持蓋玻片一端,使其蘸樣端與血清平面平行沒(méi)入血清樣品中,使血清均勻分布在蓋玻片點(diǎn)樣端后迅速取出，隨后將點(diǎn)樣端垂直印于薄膜上無(wú)光澤面一端2.0 cm處,動(dòng)作迅速,力度適中[8]。

濾紙組:將濾紙剪成比醋酸纖維薄膜略窄的長(zhǎng)條狀,從中間進(jìn)行對(duì)折,使用對(duì)折端,與液面平行伸入血清樣品,蘸取適量血清,待濾紙折痕端沒(méi)入液面時(shí)迅速取出；將濾紙蘸有樣品的折痕端垂直印于薄膜上無(wú)光澤一端約2.0cm處,動(dòng)作迅速,力度適中[8]。

蓋玻片+擦鏡紙組:將擦鏡紙剪成長(zhǎng)約10 cm寬為4 cm的長(zhǎng)條狀,將蓋玻片放置于擦鏡紙中間,使擦鏡紙完全包裹蓋玻片一端；將點(diǎn)樣端與血清樣品液面平行伸入蘸取樣品,迅速取出；將點(diǎn)樣端垂直印于薄膜無(wú)光澤面的一端2.0 cm處,動(dòng)作要迅速,力度要適中[8]。

2.4 電泳

待血清滲入薄膜后,以點(diǎn)樣的無(wú)光澤面向下,薄膜兩端放于電泳槽支架的紗布鹽橋上,點(diǎn)樣端放于電泳槽的負(fù)極,薄膜緊貼紗布并繃直。電泳槽同時(shí)放置的膜片之間互相間隔一小段距離,蓋上電泳槽的蓋子,接通電源進(jìn)行電泳。室溫下調(diào)節(jié)電壓至110～140 V,電流約0.4～0.6 mA/cm,通電時(shí)間夏季為40～50 min,冬季為60 min左右[9]。本實(shí)驗(yàn)在冬季,通電60 min。

2.5 染色及漂洗

關(guān)閉電源后立即將薄膜取出,放入染色液中浸染3～5 min；然后依次移入放有漂洗液的3個(gè)培養(yǎng)皿中漂洗數(shù)次,至蛋白質(zhì)條帶清晰,背景無(wú)色為止；將電泳條帶放在濾紙上,吸去多余的溶液,自然風(fēng)干。

2.6 數(shù)據(jù)記錄及定量

記錄3種點(diǎn)樣方法電泳結(jié)果的成功次數(shù)與失敗次數(shù),以及出現(xiàn)不良結(jié)果的次數(shù)。對(duì)比3種點(diǎn)樣方法所得電泳條帶的寬度與顏色。分別取3組中效果較好的電泳條帶各6條，將蛋白質(zhì)條帶與一條空白帶分別剪開(kāi),裝入6支試管中,各管中加入0.4 mol/L NaOH溶液4 mL,振搖數(shù)次,使顏料色澤浸出。30 min后,使用7200型分光光度計(jì)在650 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色,測(cè)各組分蛋白百分含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:3組電泳成功率與出現(xiàn)不良結(jié)果的次數(shù)采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；3組血清蛋白相對(duì)含量比較時(shí)采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)成功率對(duì)比

以電泳所得蛋白質(zhì)條帶中5條蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)、易于辨識(shí)、圖譜整齊、無(wú)拖尾或過(guò)于緊密為依據(jù)作為成功的標(biāo)準(zhǔn)[10]。3種點(diǎn)樣方法所對(duì)應(yīng)成功率的具體結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出：濾紙組的實(shí)驗(yàn)成功率比蓋玻片組高,P<0.01；蓋玻片+擦鏡紙組成功率為90.5%與濾紙組的72.0%相比,P<0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)比可得,3種點(diǎn)樣方法中采用蓋玻片+擦鏡紙相結(jié)合的方式進(jìn)行點(diǎn)樣在提高實(shí)驗(yàn)成功率方面具有最好的效果。

表1 3種點(diǎn)樣方法實(shí)驗(yàn)成功率對(duì)比

注：與蓋玻片組相比,△：P<0.01；與“濾紙”組相比,▲：P<0.01

3.2 不良結(jié)果出現(xiàn)次數(shù)對(duì)比

記錄所得的每組出現(xiàn)不良結(jié)果——拖尾、電泳圖譜不整齊、蛋白條帶分離不清的次數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明：在出現(xiàn)拖尾與蛋白條帶分離不清的不良結(jié)果的次數(shù)上,濾紙組與蓋玻片組差異不明顯,P>0.05,蓋玻片+擦鏡紙組出現(xiàn)次數(shù)較少,P<0.01；電泳圖譜不整齊這一不良結(jié)果出現(xiàn)的次數(shù)上,濾紙組與蓋玻片+擦鏡紙組差異不明顯,P>0.05,兩組均比蓋玻片組的次數(shù)明顯減少,P<0.01。以上結(jié)果說(shuō)明,使用濾紙進(jìn)行點(diǎn)樣與使用蓋玻片點(diǎn)樣相比可以減少電泳圖譜不整齊這一不良結(jié)果的出現(xiàn),但在拖尾和蛋白條帶分離不清出現(xiàn)的次數(shù)上效果不明顯。使用改進(jìn)后的蓋玻片+擦鏡紙結(jié)合的方法進(jìn)行點(diǎn)樣與單獨(dú)使用蓋玻片相比可以有效減少拖尾、電泳圖譜不整齊、蛋白條帶分離不清3種不良結(jié)果的出現(xiàn)。3種點(diǎn)樣方法中蓋玻片+擦鏡紙的點(diǎn)樣方法在減少不良結(jié)果出現(xiàn)次數(shù)上效果最好。

表2 3種點(diǎn)樣方法不良結(jié)果出現(xiàn)次數(shù)對(duì)比

注：與蓋玻片組相比,△：P<0.01；與濾紙組相比,▲：P<0.01

3.3 電泳條帶寬度與顏色深淺對(duì)比

3種點(diǎn)樣方法均可獲得5條清晰蛋白條帶,但蛋白條帶寬度與顏色深淺略有差異,3種點(diǎn)樣方法所得的具有代表性的電泳條帶見(jiàn)圖1。由圖1對(duì)比可知：蓋玻片組蛋白條帶最窄,顏色也最淺；濾紙組蛋白條帶最寬,顏色也最深；蓋玻片+擦鏡紙組顏色與寬度介于兩者之間。蓋玻片+擦鏡紙組各蛋白條帶寬度均勻、顏色適中、易于辨識(shí)。

圖1 電泳圖譜

3.4 各組分蛋白質(zhì)相對(duì)含量對(duì)比

3種點(diǎn)樣方法都證明了血清中各組分蛋白的相對(duì)含量排序:清蛋白>γ球蛋白>β球蛋白>α2-球蛋白>α1-球蛋白,即清蛋白占總蛋白比例最大,α1-球蛋白總蛋白比例最小[11]。使用分光光度計(jì)測(cè)得的3種點(diǎn)樣方法各組分蛋白質(zhì)相對(duì)含量(每種方法測(cè)6次,每組的平均值)見(jiàn)表3。采用單因素方差分析,3種點(diǎn)樣方法在分離各組分蛋白含量方面差異沒(méi)有顯著性。

表3 3種點(diǎn)樣方法各組分蛋白質(zhì)相對(duì)含量對(duì)比 %

4 討論

電泳實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科研中應(yīng)用廣泛,點(diǎn)樣是電泳實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵一步,點(diǎn)樣的成功與否直接影響著電泳的結(jié)果[4],選擇高效且簡(jiǎn)單實(shí)用的點(diǎn)樣方法來(lái)提高學(xué)生的點(diǎn)樣成功率是十分必要的。

采用蓋玻片進(jìn)行點(diǎn)樣會(huì)因?yàn)樯w玻片端面不整齊,容易導(dǎo)致蘸取的樣品量在蓋玻片端分布不均勻,從而出現(xiàn)拖尾、電泳圖譜不整齊或蛋白條帶分離不清等不良結(jié)果[12],點(diǎn)樣成功率較低。選用濾紙進(jìn)行點(diǎn)樣,可以通過(guò)濾紙的吸水性來(lái)解決蓋玻片點(diǎn)樣不均的問(wèn)題,故電泳圖譜不整齊出現(xiàn)的次數(shù)較使用蓋玻片點(diǎn)樣有所減少；但因?yàn)V紙吸水性好[13-14],容易蘸取過(guò)多的樣品量,拖尾與蛋白條帶分離不清的問(wèn)題得不到解決。選用蓋玻片+擦鏡紙相結(jié)合的方法進(jìn)行點(diǎn)樣,因?yàn)椴羚R紙的吸水性較濾紙低,蓋玻片又能起到支撐作用,故能有效解決點(diǎn)樣不均勻、點(diǎn)樣量不易控制的問(wèn)題，因此能夠減少不良結(jié)果的出現(xiàn),顯著提高點(diǎn)樣成功率。

電泳條帶中各蛋白組分的寬度與顏色深淺主要與蛋白質(zhì)的含量有關(guān)[15]。所蘸取的樣品量越多,條帶整體顏色越深,各組分蛋白條帶也越寬。選用濾紙進(jìn)行點(diǎn)樣,因其吸水性較好,會(huì)蘸取較多的樣品量,故蛋白條帶整體顏色最深,各組分蛋白條帶最寬。蓋玻片因其點(diǎn)樣面不整齊,蘸取的樣品量多少不均勻,導(dǎo)致整體點(diǎn)樣量偏少,顏色偏淺。選用蓋玻片+擦鏡紙進(jìn)行點(diǎn)樣,因?yàn)椴羚R紙吸取的樣品量小于濾紙而大于蓋玻片,故條帶顏色與各組分寬度介于二者之間。

綜上所述,在相同且適宜的實(shí)驗(yàn)條件下,選用蓋玻片+擦鏡紙相結(jié)合的點(diǎn)樣方法與單純使用蓋玻片或?yàn)V紙的點(diǎn)樣方法相比,具有成功率高、不良結(jié)果出現(xiàn)次數(shù)少、條帶顏色清楚易辨識(shí)等優(yōu)點(diǎn),能有效改善電泳效果。此外該方法操作簡(jiǎn)單、易于重復(fù),是一種十分適合學(xué)生的點(diǎn)樣方法。又因其原料易于獲得,成本低,能源耗費(fèi)少,是一種較為理想的醋酸纖維薄膜電泳點(diǎn)樣方法,可在生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)或科學(xué)實(shí)驗(yàn)中推廣。

致謝:本文承蒙河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院裴蘭英老師與第一臨床醫(yī)學(xué)院李江波同學(xué)在文章修改與數(shù)據(jù)分析方面提供的幫助,《中醫(yī)學(xué)報(bào)》主編程延安老師在圖表方面提供的幫助,藥學(xué)院武慧敏老師在選題方面提出的寶貴意見(jiàn),特此致謝！

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Comparative study of effect of 3 spotting methods on results of serum protein acetate membrane electrophoresis

Geng Shaohui1, Chen Yukun1, Bao Yu1, Chen Weijiao1, Zhang Yingqian1, Wang Lei2

(1. First Clinical Medical College, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China;2. College of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China)

The effect of the serum protein acetate membrane electrophoresis by the three spotting methods of the coverslip, filter paper and coverslip+lens cleaning paper on the electrophoresis results is studied. The application effect of the new spotting method with the combination of the coverslip and the lens cleaning paper is evaluated and the difference of relative protein content of the three groups is analyzed. The results show that under the same experimental conditions, the electrophoresis result of coverslip+lens cleaning paper group is better than that of the other 2 groups, and there is no significant difference in the protein relative content of the 3 groups. The spotting method with the combination of the coverslip with the lens cleaning paper is better than the spotting methods of the coverslip and the filter paper, which greatly improves the successful rate. It can effectively solve the students’ spotting problem in the operation of electrophoresis experiments, and can be popularized in the teaching experiment.

serum protein; acetate membrane; electrophoregram; spotting method

10.16791/j.cnki.sjg.2017.08.016

2017-02-24

河南省教育科學(xué)十二五規(guī)劃課題(2014-JKGHC-0100)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610471013)

耿少輝(1997—),男,河南安陽(yáng),本科生,專(zhuān)業(yè)方向?yàn)橹形麽t(yī)臨床E-mail：shaohuigeng2016@163.com

王蕾(1963—),女,河南許昌,本科,副教授,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)與研究.E-mail：wangl131@sina.com

R446.1

B

1002-4956(2017)08-0060-03