轉(zhuǎn)錄組學(xué)在抑菌機(jī)制中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙圣明，趙巖巖，馬漢軍，別小妹

1(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京，210095)

綜述與專(zhuān)題評(píng)論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在抑菌機(jī)制中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙圣明1，趙巖巖1，馬漢軍1，別小妹2*

1(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京，210095)

微生物是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)和引起食源性疾病的主要因素，如何抑制微生物的生長(zhǎng)是食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，因此，對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌機(jī)制的研究也已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可以從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示各種抑菌物質(zhì)抑制微生物生長(zhǎng)的分子機(jī)制。文中綜述了轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要的研究方法，介紹了目前應(yīng)用最多的RNA測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-seq)的技術(shù)特點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)在抑菌機(jī)制研究中的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在抑菌機(jī)制研究中將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

微生物；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；RNA-seq技術(shù)；抑菌機(jī)制

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)簡(jiǎn)介

轉(zhuǎn)錄組是一個(gè)細(xì)胞或者組織在特定的發(fā)展階段或生長(zhǎng)條件下所有的轉(zhuǎn)錄和它們的轉(zhuǎn)錄數(shù)量的全部集合。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的理解是闡明基因組功能元件所必須的，同時(shí)還能夠揭示細(xì)胞和組織的分子構(gòu)成以及疾病的發(fā)生機(jī)制[1]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的關(guān)鍵目標(biāo)包括以下幾個(gè)方面：編錄轉(zhuǎn)錄所有個(gè)體，包括信使RNA，非編碼RNA和小RNA；就其5，和3，末端而言，可以確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)、剪切模式和其他的轉(zhuǎn)錄后修飾；在不同的生長(zhǎng)條件下定量每個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化[2]。目前已經(jīng)有多種方法被用于推斷和定量轉(zhuǎn)錄組，主要分為2大類(lèi)：一類(lèi)是基于雜交的方法，主要是指基因芯片技術(shù)(Microarray)；另一類(lèi)是基于測(cè)序的方法，主要包括表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(Expression Sequence Tags Technology，EST)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)、基因表達(dá)加冒分析技術(shù)(Cap Analysis of Gene Expression，CAGE)、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)和RNA測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-seq)。

基于雜交的方法主要是將熒光標(biāo)記的cDNA集成到定制的微矩陣芯片或者商業(yè)化高密度寡核苷酸微陣列芯片上。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些商業(yè)化芯片，例如帶有跨越外顯子結(jié)合點(diǎn)探針的芯片已經(jīng)被應(yīng)用于檢測(cè)和定量不同的剪切體[3]。基因組嵌合芯片代表基因組已經(jīng)被高密度的構(gòu)建并且允許繪制高分辨率的可轉(zhuǎn)錄區(qū)，從幾個(gè)堿基對(duì)到100個(gè)堿基對(duì)?；陔s交的方法具有高通量且費(fèi)用相對(duì)較低的優(yōu)點(diǎn)，但是用于研究大基因組的高分辨率嵌合芯片除外[4]。然而，這些方法也有一些限制性缺點(diǎn)，例如，必須依賴(lài)已知的基因組序列，由于交叉雜交導(dǎo)致較高的背景值，由于背景和信號(hào)飽和導(dǎo)致檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍有一定的限制[5]。此外，不同試驗(yàn)條件下基因表達(dá)水平的比較通常很難實(shí)現(xiàn)且需要非常復(fù)雜的規(guī)范化方法。

與基于雜交的芯片方法相比，基于測(cè)序的方法能夠直接確定cDNA序列。早期，主要使用Sanger測(cè)序和EST數(shù)據(jù)庫(kù)，但是這兩種方法的缺點(diǎn)是低通量、價(jià)格昂貴且一般不能定量[6]。后來(lái)基于標(biāo)簽方法的發(fā)展解決了這些缺點(diǎn)，包括基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)、基因表達(dá)加冒分析技術(shù)(CAGE)和大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(MPSS)。這些基于標(biāo)簽的測(cè)序方法能夠高通量快速精確的分析基因的表達(dá)水平。然而這些方法大多數(shù)都是基于價(jià)錢(qián)昂貴的Sanger測(cè)序方法且不能夠繪制特異性短標(biāo)簽的重要部分到參考基因組上；此外，只能分析轉(zhuǎn)錄的一部分；還不能夠區(qū)分基因的不同亞型。這些不利條件限制了傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋中的應(yīng)用。

目前，用于繪制和定量轉(zhuǎn)錄組的新的高通量DNA測(cè)序方法已經(jīng)發(fā)展起來(lái)。2008年6月NAGALAKSHM等[7]和WILHEL等[8]分別報(bào)道了利用RNA-Seq技術(shù)分析釀酒酵母、裂殖酵母轉(zhuǎn)錄組，這標(biāo)志著RNA-Seq技術(shù)成功的應(yīng)用于科學(xué)研究中。RNA-Seq技術(shù)與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比具有很多的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)也被認(rèn)為是真核轉(zhuǎn)錄組分析方法的革新。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到老鼠、人類(lèi)細(xì)胞、植物、微生物等研究領(lǐng)域。

2 RNA測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-Seq)

RNA-Seq技術(shù)是目前最新發(fā)展的深度測(cè)序技術(shù)，由于其具有高通量、結(jié)果精確、重現(xiàn)性好及成本低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為目前轉(zhuǎn)錄組研究中使用最多的方法。通常，RNA-Seq技術(shù)試驗(yàn)流程如下[9]：(1)從動(dòng)植物、微生物組織或細(xì)胞中提取總RNA，然后采用oligo(dT)磁珠法或者試劑盒方法從總RNA中分離純化得到mRNA；(2)將mRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA片段文庫(kù)，并對(duì)末端進(jìn)行末端補(bǔ)平和磷酸化得到合適的末端；(3)構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)通過(guò)合適的高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。從理論上講，任何一種高通量測(cè)序技術(shù)都可以應(yīng)用到RNA-Seq上，例如Illumina IG[10]、ABI SOLID[11]、Roche 454 Life Science[12]、Hiseq 2000[13]等測(cè)序系統(tǒng)都已經(jīng)被成功的應(yīng)用，但是還未見(jiàn)Helicos Biosciences tSMS應(yīng)用到RNA-Seq中的報(bào)道，但該技術(shù)也是一種非常適合的測(cè)序方法。根據(jù)測(cè)序結(jié)果獲得的reads或者與參考基因組或者與參考轉(zhuǎn)錄本或者與沒(méi)有基因組序列的從頭組裝對(duì)齊，繪制一個(gè)包括每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的基因組轉(zhuǎn)錄圖譜。

圖1 典型的RNA-Seq試驗(yàn)流程圖[2]Fig.1 The typical experimental procedure of RNA-Seq

首先，長(zhǎng)鏈RNAs通過(guò)RNA片段化或者DNA片段化被轉(zhuǎn)變成一個(gè)cDNA片段文庫(kù)；測(cè)序接頭隨后被添加到每一個(gè)cDNA片段，然后利用高通量測(cè)序技術(shù)從每一個(gè)cDNA獲得一個(gè)短的序列；最終讀取的序列與參考基因組或者轉(zhuǎn)錄組比對(duì)并被分類(lèi)為3種類(lèi)型：exonic reads， junction reads和poly(A)end-reads。這3種類(lèi)型被用于對(duì)每個(gè)基因生成一個(gè)基本分辨率的表達(dá)文件，圖1展示了帶有內(nèi)含子的酵母ORF RNA-Seq測(cè)序流程。

雖然RNA-Seq還是一個(gè)正在發(fā)展中的技術(shù)，但是與其他技術(shù)相比它具有許多優(yōu)勢(shì)(表1)。與基于雜交的方法不同，RNA-Seq不僅局限于檢測(cè)已知基因組序列的轉(zhuǎn)錄組，還可以用于全基因組序列未知的非模式生物的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。例如：基于454的RNA-Seq技術(shù)已經(jīng)被用于格蘭維爾貝母蝴蝶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究[12]。此外，RNA-Seq技術(shù)能夠在單堿基分辨率水平上揭示轉(zhuǎn)錄的精確位點(diǎn)，通過(guò)30 bp短序列讀取能夠揭示2個(gè)外顯子的連接方式，長(zhǎng)鏈序列讀取或者雙末端短鏈序列讀取能夠揭示多個(gè)外顯子的連通性，同時(shí)，RNA-Seq技術(shù)還能夠揭示轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列變異(如，SNPs)[11]。以上優(yōu)點(diǎn)使RNA-Seq技術(shù)在復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用更加廣泛。

RNA-Seq技術(shù)與DNA芯片技術(shù)相比，RNA-Seq技術(shù)可以將DNA測(cè)序結(jié)果清楚地繪制到基因組的特定區(qū)域，因此其顯著的優(yōu)點(diǎn)是背景信號(hào)低；同時(shí)，RNA-Seq技術(shù)定量獲得的序列數(shù)量沒(méi)有上限限制，因此，它對(duì)于可以檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平具有一個(gè)較大的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。在分析一項(xiàng)釀酒酵母繪制出的4千萬(wàn)序列讀取數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其檢測(cè)范圍約是DNA芯片分析結(jié)果的9 000倍[7]。與熒光定量PCR(qPCR)[12]和已知濃度spike-in RNA[14]對(duì)照的方法相比，RNA-Seq技術(shù)在定量分析表達(dá)水平方面表現(xiàn)出了更高的精確性。除此之外，RNA-Seq的試驗(yàn)結(jié)果還表現(xiàn)出高水平的重現(xiàn)性，包括技術(shù)上和生物學(xué)上的重復(fù)[7, 11]；由于檢測(cè)過(guò)程不需要克隆并且使用Helicos技術(shù)也無(wú)需經(jīng)過(guò)擴(kuò)增這一步驟，因此RNA-Seq只需要很少的RNA樣本就可以完成對(duì)樣品的檢測(cè)。

綜上所述，RNA-Seq技術(shù)是第一個(gè)基于測(cè)序的方法實(shí)現(xiàn)高通量和定量全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的技術(shù)。該技術(shù)提供單堿基分辨率的注釋和基因組規(guī)模的數(shù)字化基因表達(dá)水平，相對(duì)于之前常用的嵌合芯片和Sanger EST測(cè)序技術(shù)，它的試驗(yàn)成本要相對(duì)較低。

表1 RNA-Seq技術(shù)與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)

3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在抑菌機(jī)制中的應(yīng)用研究進(jìn)展

由于轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以高通量地從分子水平上分析微生物體內(nèi)基因的變化情況，隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越成熟，且試驗(yàn)成本也越來(lái)越低，因此近年來(lái)已逐漸地被應(yīng)用于抗菌物質(zhì)抑菌機(jī)制研究中。

3.1轉(zhuǎn)錄組學(xué)在食品加工中常見(jiàn)有害微生物抑菌機(jī)制研究中的應(yīng)用

芽孢桿菌是食品中常見(jiàn)的腐敗細(xì)菌，由于其可以產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢，對(duì)食品工業(yè)的危害較大[15]。有機(jī)酸及其鹽類(lèi)是食品中常用的防腐保鮮劑，能顯著的抑制細(xì)菌、酵母和霉菌的生長(zhǎng)，因此研究有機(jī)酸對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制能夠?yàn)橛袡C(jī)酸在食品保鮮中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論支撐。MAARTEN等[16]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了有機(jī)酸對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制機(jī)理，其轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明經(jīng)有機(jī)酸處理后的蠟樣芽孢桿菌氨基酸代謝，脂肪酸代謝以及電子轉(zhuǎn)移鏈等都發(fā)生變化，說(shuō)明有機(jī)酸對(duì)菌體的正常生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生了抑制效果。Beek等[17]研究了山梨酸和醋酸對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果表明弱有機(jī)酸主要是通過(guò)影響營(yíng)養(yǎng)代謝、導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化和細(xì)胞膜組成發(fā)生變化最終破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體的死亡。

酒類(lèi)酒球菌是葡萄酒蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中最重要的乳酸菌，但是在酒發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致酒類(lèi)酒球菌的生長(zhǎng)受到抑制從而導(dǎo)致蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程的失敗。有研究報(bào)道乙醇是影響該菌在葡萄酒中生長(zhǎng)的主要因素，因此揭示乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌的抑制機(jī)制對(duì)于葡萄酒工業(yè)具有重要意義。Olguín等[18]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究了乙醇對(duì)酒類(lèi)酒球菌的抑制機(jī)制，研究結(jié)果表明乙醇主要是通過(guò)影響代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)、破壞細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜的生物合成等抑制該菌的生長(zhǎng)。阪崎克羅諾桿菌是乳粉中主要的致病菌，嬰幼兒是克羅諾桿菌感染的高危人群，感染后會(huì)引起菌血癥、腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等，致死率高達(dá)40%～80%。馮少龍[19]采用轉(zhuǎn)錄組手段研究了大蒜提取物中有機(jī)硫化物阿藿烯和二烯丙基硫醚對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑制機(jī)制，研究結(jié)果表明菌體對(duì)阿藿烯的反應(yīng)與對(duì)二烯丙基硫醚的反應(yīng)具有明顯的差異，阿藿烯主要導(dǎo)致阪崎克羅諾桿菌運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，而二烯丙基硫醚主要引起細(xì)胞壁合成相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，但是最終都是通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)含巰基的蛋白或酶結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌之一，而且在水產(chǎn)品、生食蔬菜、生肉、生牛奶、散裝熟肉制品等的重要細(xì)菌污染監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的污染率最高，因此有效地抑制食品中金黃色葡萄球菌是保證食品安全的一個(gè)重要舉措。趙星辰[20]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了茶樹(shù)油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制機(jī)制，結(jié)果表明有715個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，茶樹(shù)油主要通過(guò)影響菌體的糖酵解途徑、嘌呤及嘧啶代謝途徑、氨基酸生物合成途徑等抑制菌體的生長(zhǎng)代謝。副溶血性弧菌是水產(chǎn)食品中重要的食源性致病菌，能夠定殖于魚(yú)、蝦、蟹和貝類(lèi)等水產(chǎn)食品的表面，形成生物被膜，從而對(duì)食品安全造成威脅。張芳等[21]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析天然可食用植物素白藜蘆醇對(duì)副溶血弧菌的生長(zhǎng)及生物被膜形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制副溶血弧菌生物被膜的形成是一個(gè)多生物過(guò)程協(xié)同調(diào)控的作用，主要是通過(guò)干擾副溶血弧菌的新陳代謝過(guò)程、群體感應(yīng)系統(tǒng)、膜蛋白分泌通路等，最終抑制生物被膜的形成。

多聚磷酸鹽對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑制作用，被FDA列為食品添加劑用于防止食品腐敗。Ji-Hoi等[22]研究了多聚磷酸鹽對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑制機(jī)制，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可知，經(jīng)多聚磷酸鹽處理后，與菌體染色體復(fù)制、能量代謝以及血紅素吸收相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生明顯下調(diào)，說(shuō)明多聚磷酸鹽主要通過(guò)影響牙齦卟啉單胞菌利用血紅素進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，最終導(dǎo)致其死亡。目前人工合成具有抗菌肽相似特征的兩親性復(fù)合物成為開(kāi)發(fā)新型防腐劑的一個(gè)研究熱點(diǎn)，例如人工合成的β-氨基酸螺旋復(fù)合物和抗菌聚合物等。該類(lèi)聚合物毒性低、抑菌活性強(qiáng)，在防腐抗菌領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。因此其抑菌機(jī)制的深入研究將為其進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。Bruk等[23]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了聚芳酰胺對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)聚芳酰胺處理后與細(xì)胞膜相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，掃描電鏡結(jié)果顯示菌體細(xì)胞膜被破壞，說(shuō)明聚芳酰胺通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)殺死大腸桿菌。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致，聚芳酰胺優(yōu)先結(jié)合到細(xì)胞膜脂多糖部分，然后破壞細(xì)胞膜。

3.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)在食品消毒和包裝中常見(jiàn)有害微生物抑菌機(jī)制研究中的應(yīng)用

為防止細(xì)菌可能對(duì)食品造成的污染，在食品加工領(lǐng)域一般采用化學(xué)消毒劑對(duì)食品加工設(shè)備表面進(jìn)行消毒處理。蠟樣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢，且能夠分泌致人嘔吐和腹瀉的腸毒素，因此在食品工業(yè)中對(duì)其采取一定的防治措施尤為重要。MARA等[24]研究了常見(jiàn)的消毒劑對(duì)蠟樣芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組的影響，結(jié)果表明：經(jīng)不同消毒劑處理后蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞膜破裂，而與脂肪酸代謝相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明菌體嘗試合成更多的脂肪酸來(lái)修復(fù)破裂的細(xì)胞膜；另外與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因也發(fā)生明顯的上調(diào)，說(shuō)明經(jīng)消毒劑處理后菌體DNA受到破壞。氯胺雖然已被廣泛的應(yīng)用于飲用水的消毒，但是關(guān)于其抑菌作用方式的研究報(bào)道卻較少。DIANE等[25]研究了低濃度氯胺對(duì)大腸桿菌的抑制機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組分析試驗(yàn)結(jié)果表明與菌體DNA修復(fù)、生物膜形成、細(xì)胞壁修復(fù)以及抗生素抗性相關(guān)的基因都被誘導(dǎo)表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明低濃度氯胺處理激活了大腸桿菌的防御機(jī)制。高夢(mèng)莎[26]研究了食品工業(yè)中常用的殺菌劑臭氧對(duì)副溶血弧菌的滅活機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組研究表明在臭氧脅迫下副溶血性弧菌的細(xì)胞壁膜、胞內(nèi)大分子物質(zhì)以及遺傳物質(zhì)等發(fā)生明顯變化，細(xì)胞膜的通透性受到影響，細(xì)胞內(nèi)活性氧清除酶的活性也受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)氧化產(chǎn)物增加及遺傳物質(zhì)的破壞，最終導(dǎo)致副溶血弧菌死亡。

C60目前被應(yīng)用于工程納米材料，由于其具有抗菌性能，因此在包裝領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。研究C60對(duì)微生物的抑制機(jī)制將為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。DAWN等[27]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了C60對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑制機(jī)理，結(jié)果表明經(jīng)C60處理后，與菌體能量代謝、氨基酸合成、DNA代謝等相關(guān)的基因發(fā)生明顯上調(diào)，與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合等相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明C60作用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制可能是因?yàn)榕c關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白作用的結(jié)果?；赥iO2的納米復(fù)合膜具有良好的抗菌性能，因此將其應(yīng)用于包裝材料領(lǐng)域具有較好的市場(chǎng)前景。但是該材料對(duì)微生物的抑制機(jī)制還不是很清楚，因此研究其抑菌機(jī)制有助于更深入的開(kāi)發(fā)其應(yīng)用價(jià)值。ANNA等[28]研究了基于TiO2的納米復(fù)合膜對(duì)銅綠假單胞菌的抑制機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后與細(xì)菌生長(zhǎng)調(diào)控、呼吸代謝及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因發(fā)生了明顯下調(diào)，這些結(jié)果表明基于TiO2的納米復(fù)合膜主要通過(guò)抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)代謝最終導(dǎo)致菌體死亡。

3.3轉(zhuǎn)錄組學(xué)在醫(yī)學(xué)致病菌和農(nóng)業(yè)疫病菌抑菌機(jī)制研究中的應(yīng)用

硝酸銀在醫(yī)學(xué)上多用于抗菌治療，特別是在病原微生物引起的疾病治療方面被廣泛應(yīng)用。Malli等[29]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究硝酸銀對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑制機(jī)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)硝酸銀處理后，與菌體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制及膜蛋白相關(guān)的基因都發(fā)生上調(diào)，說(shuō)明菌體本身在提高抵御能力；與細(xì)菌趨化作用相關(guān)的基因發(fā)生下調(diào)，趨化能力的下降說(shuō)明菌體通過(guò)菌落聚集來(lái)抵御外界不良環(huán)境的能力減弱。俞文榜[30]研究發(fā)現(xiàn)脂環(huán)肽抗生素Fusaricidins作用于枯草桿菌時(shí)有大量的菌體裂解，但是幾小時(shí)后枯草芽孢桿菌會(huì)重新生長(zhǎng)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了脂環(huán)肽抗生素Fusaricidins對(duì)枯草桿菌的抑制機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的鐵代謝與抗生素作用機(jī)制及其耐藥性相關(guān)。葉海青[31]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究了白花丹素對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)經(jīng)白花丹素處理后，結(jié)核分枝桿菌醇二分支菌酸相關(guān)基因(DIM)的表達(dá)下調(diào)，結(jié)核分枝桿菌外膜的通透性增加，從而在一定程度上導(dǎo)致該菌活性變低，同時(shí)甘油三酯(TG)合成酶基因也受到了抑制，促使結(jié)核分支桿菌的應(yīng)激能力降低，最終結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)受到抑制。朱健銘等[32]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段研究黃連對(duì)致病性大腸埃希氏菌抑制作用的分子機(jī)制，結(jié)果表明有1428個(gè)基因發(fā)生明顯的差異表達(dá)，黃連主要通過(guò)引起大腸埃希氏菌的細(xì)胞壁損傷，影響脂肪酸代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯、破壞DNA復(fù)制過(guò)程等多個(gè)方面進(jìn)行作用，最終導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)被抑制甚至死亡。鼠疫耶爾森菌可以引發(fā)鼠疫傳染病的發(fā)生和流行，而目前該菌對(duì)一些常規(guī)的抗生素不敏感，因此需要開(kāi)發(fā)新型的天然抗菌劑。白群華等[33]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究中藥大黃對(duì)鼠疫耶爾森菌的分子作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明大黃主要通過(guò)導(dǎo)致蛋白合成、細(xì)胞膜及轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化最終對(duì)疫耶爾森菌的生長(zhǎng)發(fā)揮抑制作用，從分子水平上揭示了中藥大黃對(duì)疫耶爾森菌主要作用機(jī)制。尖孢鐮孢菌是農(nóng)作物和園藝作物生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的一種土壤傳播病原物之一，該菌可以引起植物枯萎，從而導(dǎo)致作物的大面積減產(chǎn)。目前仍缺乏有效地防治措施，因此揭示有效殺菌劑對(duì)其的抑制機(jī)理為開(kāi)發(fā)新型防治技術(shù)的提供重要的理論基礎(chǔ)。李哲肖[34]研究了萬(wàn)壽菊殺菌劑處理后尖孢鐮孢菌轉(zhuǎn)錄本中的差異基因表達(dá)，結(jié)果表明萬(wàn)壽菊殺菌素對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌作用涉及到多種功能蛋白和代謝通路的多作用位點(diǎn)，尤其是對(duì)幾丁質(zhì)酶具有顯著地競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。辣椒疫病是導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)和絕收的主要病害，而引起該病的辣椒疫霉極易對(duì)傳統(tǒng)的農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，因此需要開(kāi)發(fā)新型的殺菌劑防治辣椒疫病。高亮等[35]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了具有廣譜抗菌活性的殼聚糖對(duì)引起辣椒疫病的辣椒疫霉的抑制機(jī)制，結(jié)果表明有2322個(gè)基因發(fā)生了差異性表達(dá)，主要是通過(guò)影響與細(xì)胞膜功能、運(yùn)動(dòng)功能及糖代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)而對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。目前采用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防止辣椒疫病已經(jīng)導(dǎo)致了部分辣椒疫霉產(chǎn)生抗藥性，因此通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)從分子水平上研究殼聚糖對(duì)辣椒疫霉的抑制機(jī)制為新型綠色農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)用于抑菌機(jī)制的研究已有數(shù)年，新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為抑菌機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段，特別是RNA-Seq技術(shù)的使用可以通過(guò)比較基因組學(xué)技術(shù)對(duì)未進(jìn)行全基因組測(cè)序的微生物進(jìn)行基因組數(shù)據(jù)注釋?zhuān)貙捔宋⑸锏难芯款I(lǐng)域，有助于對(duì)該物種進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)研究。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的逐漸成熟，微生物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本在降低，測(cè)序結(jié)果也越來(lái)越準(zhǔn)確，可以得到大量的可靠的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法可以精確地在分子水平上解釋抗菌物質(zhì)對(duì)微生物的抑制機(jī)理。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也有其自身的局限性，如轉(zhuǎn)錄豐度與基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含量或者其活性之間沒(méi)有必然的關(guān)聯(lián)，因此通過(guò)與蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等其他分子生物學(xué)技術(shù)以及一些表觀(guān)的抑菌研究結(jié)果相結(jié)合可以更好地闡明抗菌物質(zhì)的抑菌機(jī)制，為抗菌物質(zhì)的進(jìn)一步應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Applicationsoftranscriptomicsinresearchofantimicrobialmechanism

ZHAO Sheng-ming1,ZHAO Yan-yan1,MA Han-jun1,BIE Xiao-mei2*

1(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China) 2(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Since microorganism is one of the most primary factors to cause food spoilage and foodborne disease, the inhibition of the growth of microorganism is an important research direction in food and medical field. Therefore, the study on antimicrobial mechanism is a hot topic in domestic and aboard academe. The utilization of transcriptomics could reveal the molecular mechanism of various antimicrobial substances against microorganism. The main research methods for transcriptomics, especially the technical features of the most widelyused RNA sequencing technology were reviewed in this paper. The research situations of transcriptomics for antimicrobial mechanism at home and aboard were introduced. With the development of high-throughput sequencing technology，transcriptomics will have extensive application prospects in research of antimicrobial mechanism.

microorganism; transcriptomics; RNA-sequencing; antimicrobial mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013619

博士，講師(別小妹教授為通訊作者,E-mail：bxm43@njau.edu.cn)。

河南省重大科技專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(161100110600)；河南科技學(xué)院高層次人才科研活動(dòng)項(xiàng)目(2016018，2016019)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(18B550003)

2016-12-14，改回日期：2017-02-17