檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)系統(tǒng)中鈉離子影響機(jī)制的探究及其去除

鮑家偉，徐健，蘇先峰，張宏建，毛忠貴

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)系統(tǒng)中鈉離子影響機(jī)制的探究及其去除

鮑家偉，徐健，蘇先峰，張宏建，毛忠貴

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

為解決檸檬酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢水問題，提出了檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，檸檬酸發(fā)酵廢水經(jīng)中溫厭氧消化和水資源化處理后作為配料水回用于下一批次檸檬酸發(fā)酵，從而實(shí)現(xiàn)廢水零排放。厭氧消化出水中的主要抑制物質(zhì)是Na+，在回用過程中其質(zhì)量濃度最高達(dá)到1 000 mg/L，會嚴(yán)重抑制檸檬酸發(fā)酵。采用電滲析法對厭氧消化出水中的高濃度Na+進(jìn)行去除，循環(huán)回用10批后，平均檸檬酸產(chǎn)量為142.4±2.1 g/L，達(dá)到去離子水發(fā)酵水平(141.5 g/L)。1 000 mg/L Na+會造成檸檬酸發(fā)酵前期培養(yǎng)基pH快速下降，黑曲霉細(xì)胞分泌的糖化酶和異麥芽糖酶活力降低，部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，檸檬酸產(chǎn)量顯著下降。在檸檬酸發(fā)酵開始時(shí)添加18 g/L CaCO3可以延緩發(fā)酵初期培養(yǎng)基pH的下降速率，促進(jìn)部分糊精和異麥芽糖的水解，從而使可利用糖濃度增加，減輕高濃度 Na+對檸檬酸發(fā)酵的抑制作用。但是，CaCO3會造成發(fā)酵前期培養(yǎng)基pH較高，副產(chǎn)物草酸大量積累，檸檬酸產(chǎn)量為139.2 g/L，仍低于去離子水發(fā)酵水平。

檸檬酸；厭氧消化；碳酸鈣；Na+；異麥芽糖酶；糖化酶

檸檬酸(2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸)是一種重要的有機(jī)酸，主要用于食品、醫(yī)藥和化學(xué)工業(yè)，并且在石油、建筑、陶瓷、鑄造和紡織等工業(yè)領(lǐng)域中也有很廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前，檸檬酸主要是以木薯和玉米淀粉為原料，黑曲霉為生產(chǎn)菌株進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)的[3-4]。在該生產(chǎn)模式下，會產(chǎn)生大量的發(fā)酵性廢水。這些廢水具有高化學(xué)需氧量(15 000～20 000 mg/L)和低pH值(4.5～4.8)等特點(diǎn)，不經(jīng)過處理直接排放會對環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[5-6]?，F(xiàn)今，檸檬酸廢水主要通過“厭氧-好氧”這一工藝進(jìn)行處理，達(dá)到二級排放標(biāo)準(zhǔn)后排入附近水體[7]。厭氧消化單元在高濃度有機(jī)廢水處理方面具有高效率、低能耗等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)生的沼氣和厭氧污泥具有一定的經(jīng)濟(jì)效益[8]；但好氧消化單元存在著設(shè)備占地廣，投資及運(yùn)行費(fèi)用高等問題，是一個(gè)高能耗、純投入的過程。隨著國家工業(yè)廢水排放標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格，如何高效處理檸檬酸廢水成為制約當(dāng)前檸檬酸行業(yè)健康發(fā)展的瓶頸[9]。

為解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)室提出了“檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)系統(tǒng)”，如圖1所示。黑曲霉以木薯和玉米淀粉為原料生產(chǎn)檸檬酸，經(jīng)提取后發(fā)酵液中不能被黑曲霉利用的纖維素、果膠等物質(zhì)以及黑曲霉本身的代謝副產(chǎn)物則通過中溫厭氧消化轉(zhuǎn)化成沼氣；所得沼氣經(jīng)脫硫處理后通過熱電聯(lián)產(chǎn)技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)殡姾蜔幔粎捬跸鏊?jīng)過水資源化處理后，作為配料水回用到下一批次檸檬酸發(fā)酵過程中，從而解決檸檬酸廢水排放問題并節(jié)約水資源[10]。

圖1 檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)工藝流程圖Fig.1 Flow chart of the integrated citric acid-methane fermentation process

厭氧消化出水中的主要抑制物質(zhì)是Na+，在回用過程中其濃度最高可達(dá)到1 000 mg/L，會嚴(yán)重抑制檸檬酸發(fā)酵[11]。當(dāng)培養(yǎng)基中添加的Na+濃度超過200 mg/L時(shí)，黑曲霉細(xì)胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶的活力開始受到抑制，殘總糖濃度升高，檸檬酸產(chǎn)量顯著下降[12]。本文采用電滲析法去除厭氧消化出水中的Na+，并對耦聯(lián)系統(tǒng)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，考察了培養(yǎng)基中1 000 mg/L Na+對檸檬酸發(fā)酵的影響機(jī)理，并通過添加碳酸鈣以消除高濃度Na+對檸檬酸發(fā)酵的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌種：黑曲霉(Aspergillusniger)MZ-11，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，MgSO41.5，KH2PO43，瓊脂20，pH調(diào)至6.0，115 ℃條件下滅菌20 min。用于黑曲霉菌株的培養(yǎng)和保藏。

1.1.2 試劑

木薯：河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司提供；玉米：市售玉米粉；(NH4)2SO4、CaCO3、NaOH、Na2SO4：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液體耐高溫α-淀粉酶(酶活力20 000 U/mL，最適溫度為95～105 ℃，pH 5.5～6.0)：無錫杰能科生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

5 L自控發(fā)酵罐(LiFlus GX)，韓國生物反應(yīng)器有限公司；SBA-40B型葡萄糖生物傳感器，山東省科學(xué)院生物研究所；電滲析儀，上海大名教育儀器有限公司；組合搖床(HYL-C)，太倉強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(Ulti Mate 3000)，美國Dionex公司；分析柱為美國Bio-Rad公司HPX-87 H型離子交換柱；示差折光檢測器(RI-101)，日本Shodex公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基：將木薯粉碎并過40目篩，得到木薯粉(淀粉含量為68%～73%，直徑約0.43 mm)，按料水質(zhì)量比1∶3.6加入去離子水混勻，用體積分?jǐn)?shù)為30%的H2SO4或2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.0，加入10 U/g液化酶，沸水浴條件下保溫2 h，液化結(jié)束冷卻后用去離子水補(bǔ)充液化過程中蒸發(fā)的水分，pH調(diào)至5.5，加入質(zhì)量濃度為1 g/L的(NH4)2SO4顆粒作為黑曲霉孢子萌發(fā)所需的氮源，按70 mL/L裝液量分裝至1 L錐形瓶中[13]。115 ℃，滅菌20 min。

種子培養(yǎng)方法：將黑曲霉孢子用無菌水洗下，制成濃度為6.0×106個(gè)/mL的孢子懸液，混勻后取10 mL孢子懸液接入含有70 mL無菌培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中。(36±1)℃，200 r/min條件下，培養(yǎng)21 h。

1.2.2 檸檬酸發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基：過40目篩的木薯粉和玉米粉(淀粉含量為65%～72%，直徑約0.42 mm)按質(zhì)量比4∶1混合，并按料水質(zhì)量比1∶4.5加入工藝用水進(jìn)行配料，液化操作同種子培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.5，控制總糖濃度在160 g/L。搖瓶發(fā)酵按34 mL裝液量分裝至500 mL錐形瓶中，115 ℃，滅菌20 min。按體積比為15%的接種量接種，發(fā)酵條件為(37.5±1)℃、260 r/min，培養(yǎng)92 h。所有搖瓶實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5 L自控發(fā)酵罐發(fā)酵裝液量為2 550 mL，添加適量的消泡劑，115 ℃，滅菌20 min。種子液按體積比為15%的接種量接種，循環(huán)水浴恒溫裝置保持72 h發(fā)酵過程，(37.5±1)℃，600 r/min，通氣量為2 L/min。每隔4 h取樣測定相關(guān)參數(shù)。

檸檬酸發(fā)酵前期pH的調(diào)控：在檸檬酸發(fā)酵初期(4～24 h)采用蠕動泵勻速自動流加，流速7.5 mL/h，流加的NaOH或H2SO4溶液濃度為2 mol/L，流加總體積為150 mL。在發(fā)酵初期將發(fā)酵培養(yǎng)基的初總糖濃度提高到170 g/L，以保證流加結(jié)束時(shí)初總糖濃度與不流加時(shí)的總糖濃度(160 g/L)一致。

1.2.3 中溫厭氧消化處理?xiàng)l件

實(shí)驗(yàn)過程是在5 L上流式厭氧污泥床反應(yīng)器中進(jìn)行的，反應(yīng)器溫度控制在(35±1)℃，污泥接種量的體積比為30%，平均COD去除率達(dá)到(92.4±2.0)%，平均有機(jī)容積負(fù)荷和水力停留時(shí)間分別為(2.2±0.2) kg/(m3·d)和(8.7±0.9) d。

1.2.4 電滲析處理厭氧消化出水條件

厭氧消化出水在室溫常壓下進(jìn)行電滲析處理。厭氧消化出水通過進(jìn)料泵進(jìn)入電滲析系統(tǒng)，將產(chǎn)生的濃水與進(jìn)料水混合，以保證淡水的回收率；淡水則收集檢測后回用到檸檬酸發(fā)酵。電滲析設(shè)備運(yùn)行條件：電壓15 V，進(jìn)料水流速50 mL/min；每隔5 min記錄1次系統(tǒng)電流，每隔10 min檢測淡水的電導(dǎo)率和體積；淡水的回收率達(dá)到進(jìn)料水的95%作為實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)，電滲析系統(tǒng)淡水的Na+濃度根據(jù)溶液的電導(dǎo)率獲得[14]。

1.3分析方法

總糖測定：樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的HCl于沸水浴中水解2 h，冷卻并調(diào)pH后通過SBA-40B型葡萄糖生物傳感器測定[15]。

檸檬酸、葡萄糖和異麥芽糖含量測定：利用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，操作條件為：流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫60 ℃。

異麥芽糖酶活力測定[16]：酶活定義為50 ℃，pH為4.5條件下每分鐘消耗1 mg異麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，表示為U/mL。

糖化酶活力測定[17]：酶活定義為50 ℃，pH為4.5條件下每分鐘生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，表示為U/mL。

2 結(jié)果與討論

2.15L發(fā)酵罐循環(huán)過程中檸檬酸發(fā)酵參數(shù)變化

厭氧消化出水在回用過程中會嚴(yán)重抑制檸檬酸發(fā)酵，Na+是其中主要的抑制物質(zhì)。將去離子水作為配料水進(jìn)行第1批次的檸檬酸發(fā)酵，并作為空白對照組。產(chǎn)生的檸檬酸發(fā)酵廢水經(jīng)過中溫厭氧消化系統(tǒng)和電滲析法處理后作為配料水回用。5 L發(fā)酵罐中循環(huán)實(shí)驗(yàn)一共進(jìn)行了10批，發(fā)酵參數(shù)如圖2所示。

圖2 循環(huán)過程中檸檬酸發(fā)酵參數(shù)變化Fig.2 Changes of citric acid fermentation parameters in different recycling batches

循環(huán)過程中(2～10批)，平均檸檬酸產(chǎn)量為142.4±2.1 g/L，達(dá)到去離子水發(fā)酵水平(141.5 g/L)。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中的葡萄糖基本被消耗完全，平均殘總糖和殘異麥芽糖質(zhì)量濃度分別為13.7±0.7 g/L和1.1±0.5 g/L，都低于去離子水發(fā)酵水平(分別為17.0 g/L和2.1 g/L)。這表明，采用電滲析方法可以有效去除厭氧消化出水中的高濃度Na+，檸檬酸發(fā)酵達(dá)到空白對照水平。厭氧消化出水成分較復(fù)雜，其中含有色素以及鈣鎂離子等物質(zhì)，這些物質(zhì)會吸附或沉淀在電滲析膜表面，造成膜污染，導(dǎo)致處理效果下降[6]。之前的研究中鈣鎂離子可通過空氣吹脫預(yù)處理得以去除，但空氣吹脫處理成本較高[18]；此外，采用電滲析法操作復(fù)雜同時(shí)產(chǎn)生大量二次廢水，不適合大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。因此，需要尋找成本較低、操作簡單的方法，消除厭氧消化出水中的高濃度Na+對檸檬酸發(fā)酵的抑制作用。

2.2Na+對檸檬酸發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH的影響

1 000 mg/L Na+對檸檬酸發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH的影響如圖3所示。去離子水為配料水進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵前24 h快速下降至3.0以下，之后緩慢下降至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)培養(yǎng)基中含有1 000 mg/L Na+時(shí)，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵過程中前24 h同樣快速下降，但下降速率比去離子水發(fā)酵更快，pH最大差值達(dá)到0.5。

圖3 Na+對檸檬酸發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH的影響Fig. 3 Effect of Na+ on medium pH in citric acid fermentation

2.2.1 不同pH對異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響

考察了不同pH對檸檬酸發(fā)酵過程中黑曲霉細(xì)胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 pH對黑曲霉細(xì)胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響

異麥芽糖酶和糖化酶的最適pH值分別為5.5和5.0，此時(shí)其活力達(dá)到最高，分別為212.69 U/mL和11 702.67 U/mL。隨著pH逐漸下降，異麥芽糖酶和糖化酶的活力顯著降低。結(jié)合圖3和表1可知，可能是高濃度Na+的加入導(dǎo)致培養(yǎng)基pH快速下降，造成檸檬酸發(fā)酵過程中糖化酶和異麥芽糖酶活力受到抑制，部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，從而檸檬酸產(chǎn)量下降。

2.2.2 流加硫酸溶液對檸檬酸發(fā)酵的影響

為驗(yàn)證上述推論，在去離子水發(fā)酵初期(4～24 h)流加2 mol/L H2SO4溶液，結(jié)果如圖4所示。在去離子水發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基pH在前24 h快速下降至3.0以下，之后下降速率變緩。流加2 mol/L H2SO4溶液，培養(yǎng)基pH同樣快速下降，且下降趨勢較空白對照的快，檸檬酸產(chǎn)量為117.3 g/L，較空白對照(141.5 g/L)低(圖4 A和D)。同時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘總糖和殘異麥芽糖質(zhì)量濃度分別為35 g/L和13.3 g/L，與培養(yǎng)基中含有1 000 mg/L Na+時(shí)的發(fā)酵情況基本相同(圖4 B和C)。綜上所述，檸檬酸發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH下降過快，確實(shí)會導(dǎo)致糊精和異麥芽糖的水解受到抑制，檸檬酸產(chǎn)量大幅度下降。

A- 檸檬酸產(chǎn)量；B - 殘總糖質(zhì)量濃度；C - 殘異麥芽糖質(zhì)量濃度；D - 殘葡萄糖質(zhì)量濃度圖4 在去離子水發(fā)酵初期流加硫酸溶液對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of sulfuric acid feeding in early stage on citric acid fermentation using deionized water as cooking water

2.2.3 Na+存在條件下流加NaOH溶液對檸檬酸發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推論，考察了1 000 mg/L Na+存在條件下，在發(fā)酵初期(4～24 h)流加2 mol/L NaOH溶液對檸檬酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵液中含有1 000 mg/L Na+時(shí)，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵前24 h下降較快；流加NaOH溶液后，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵初期下降速率相對較緩慢，發(fā)酵結(jié)束檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到140.3 g/L，接近空白對照(141.5 g/L)水平(圖5A和E)。同時(shí)，殘總糖和殘異麥芽糖質(zhì)量濃度分別為12 g/L和0.1 g/L，都低于空白對照(分別為17 g/L和1.9 g/L)水平(圖5B和C)。此外，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖基本消耗完全(圖5D)。這表明，在檸檬酸發(fā)酵初期流加NaOH溶液，延緩了培養(yǎng)基pH的下降速率，可以有效促進(jìn)異麥芽糖和糊精的水解，總的可利用糖濃度上升，檸檬酸產(chǎn)量顯著提高。對NaOH溶液流加過程中的糖濃度進(jìn)行衡算，結(jié)果表明殘總糖濃度顯著下降，但檸檬酸產(chǎn)量并沒有相應(yīng)的增加。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)在檸檬酸發(fā)酵前24 h草酰乙酸水解酶的活力較高，產(chǎn)生了3.7 g/L副產(chǎn)物草酸，較空白對照(0.97 g/L)高。這可能是因?yàn)榱骷覰aOH溶液造成發(fā)酵初期培養(yǎng)基pH偏高，產(chǎn)生大量草酸。

綜上所述，檸檬酸發(fā)酵過程中加入1 000 mg/L Na+會造成培養(yǎng)基pH快速下降，黑曲霉細(xì)胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶的活力受到影響，導(dǎo)致異麥芽糖和部分糊精不能有效水解，檸檬酸產(chǎn)量顯著降低。在檸檬酸發(fā)酵初期(4～24 h)流加NaOH溶液能基本消除高濃度Na+對檸檬酸發(fā)酵的抑制作用，但是，流加NaOH溶液操作較復(fù)雜，需要消耗大量的無機(jī)試劑，成本較高。此外，該方法會引入大量的Na+，而Na+在循環(huán)過程中沒有去除途徑，因此會不斷的積累，影響整個(gè)檸檬酸耦聯(lián)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

A-檸檬酸產(chǎn)量；B-殘總糖質(zhì)量濃度；C-殘異麥芽糖質(zhì)量濃度；D-殘葡萄糖質(zhì)量濃度；E-pH圖5 Na+存在條件下在發(fā)酵初期流加NaOH溶液對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of sodium hydroxide solution feeding in early stage on citric acid fermentation when Na+ existed

2.3Na+存在條件下添加CaCO3對檸檬酸搖瓶發(fā)酵的影響

CaCO3是一種常見的、廉價(jià)化工原料，成本比NaOH低，且同樣具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH的作用。檸檬酸發(fā)酵過程中采用CaCO3調(diào)控培養(yǎng)基的pH，引入的Ca2+可以在后期的鈣鹽法提取操作中與檸檬酸形成檸檬酸鈣沉淀，從而被去除，因此不會在循環(huán)體系中大量積累，影響耦聯(lián)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1 000 mg/L Na+存在條件下，添加不同質(zhì)量濃度CaCO3對檸檬酸發(fā)酵的影響如圖6所示。當(dāng)培養(yǎng)基中含有1 000 mg/L Na+時(shí)，檸檬酸發(fā)酵受到嚴(yán)重抑制，檸檬酸產(chǎn)量僅為117.7 g/L。添加CaCO3的質(zhì)量濃度小于16 g/L時(shí)，隨著CaCO3添加量的增大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，檸檬酸產(chǎn)量逐漸提高，培養(yǎng)基pH逐漸上升，葡萄糖基本消耗完全，殘總糖和殘異麥芽糖濃度逐漸降低。CaCO3添加質(zhì)量濃度大于20 g/L時(shí)，殘總糖、殘異麥芽糖和殘葡萄糖濃度都逐漸上升，檸檬酸產(chǎn)量大幅度下降。當(dāng)CaCO3添加質(zhì)量濃度在16～20 g/L時(shí)，檸檬酸發(fā)酵效果較好，平均檸檬酸產(chǎn)量為139.3±0.1 g/L，較不添加CaCO3時(shí)的117.7 g/L提高了18.4%，接近去離子水(空白)發(fā)酵水平(141.0 g/L)。同時(shí)，平均殘總糖質(zhì)量濃度為12.8±0.8 g/L，較不添加CaCO3時(shí)的33.5 g/L低。此外，殘異麥芽糖和殘葡萄糖基本消耗完全。

注：DV(Difference Value)為殘總糖和殘異麥芽糖的質(zhì)量濃度之差圖6 Na+存在條件下不同質(zhì)量濃度CaCO3對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of different mass concentrations of calcium carbonate on citric acid fermentation when Na+ existed

培養(yǎng)基中含有1 000 mg/L Na+時(shí)，殘總糖和殘異麥芽糖質(zhì)量濃度的差值(DV)為19.3 g/L，比空白對照(16.7 g/L)高，表明在檸檬酸發(fā)酵過程中除了異麥芽糖的水解受到抑制之外，部分糊精的水解也受到抑制。在檸檬酸發(fā)酵開始添加CaCO3的質(zhì)量濃度低于16 g/L時(shí)，隨著CaCO3濃度的增加，DV值大幅度下降，說明添加適量的CaCO3促進(jìn)了培養(yǎng)基中部分糊精的水解。當(dāng)CaCO3添加質(zhì)量濃度達(dá)到16～20 g/L時(shí)，平均DV值為12.1±0.4 g/L，此時(shí)培養(yǎng)基中的糊精有效水解為可利用的糖，檸檬酸產(chǎn)量接近空白對照水平。當(dāng)CaCO3添加質(zhì)量濃度大于20 g/L時(shí)，發(fā)酵結(jié)束葡萄糖沒有消耗完全，說明黑曲霉細(xì)胞活力受到影響，檸檬酸產(chǎn)量顯著降低。

2.45L發(fā)酵罐中Na+存在條件下添加CaCO3對檸檬酸發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步分析CaCO3的作用，在5 L發(fā)酵罐中研究了1 000 mg/L Na+存在條件下，添加18 g/L CaCO3對檸檬酸發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖7所示。培養(yǎng)基中含有1 000 mg/L Na+時(shí)，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵前24 h快速下降至3.0以下，之后緩慢下降直到發(fā)酵結(jié)束，檸檬酸產(chǎn)量為120.6 g/L，與空白對照相比降低了16.5%(圖7 A)。同時(shí)，殘總糖和殘異麥芽糖質(zhì)量濃度分別為31 g/L和14.1 g/L(圖7 B和C)。檸檬酸發(fā)酵開始時(shí)添加18 g/LCaCO3，培養(yǎng)基pH在發(fā)酵前24 h下降速率變緩，并維持在5.68～2.28，之后其下降趨勢與不添加CaCO3的一致(圖7 E)。發(fā)酵結(jié)束檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到139.2 g/L，與不添加CaCO3相比提高了15.4%，接近空白對照(140.5 g/L)。殘異麥芽糖質(zhì)量濃度為0.3 g/L，遠(yuǎn)低于空白對照的1.9 g/L，殘葡萄糖基本消耗完全(圖7 D)。對添加CaCO3發(fā)酵過程中的糖濃度進(jìn)行衡算，結(jié)果表明殘總糖濃度下降，但檸檬酸產(chǎn)量沒有相應(yīng)的增加；由于草酸會與CaCO3反應(yīng)生成草酸鈣沉淀，故檢測不到草酸含量。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)添加CaCO3發(fā)酵前24 h的草酰乙酸水解酶活力較空白水平高，說明產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物草酸。

A-檸檬酸產(chǎn)量；B-殘總糖質(zhì)量濃度；C-殘異麥芽糖質(zhì)量濃度；D-殘葡萄糖質(zhì)量濃度；E-pH圖7 Na+存在條件下添加18 g/L CaCO3對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of 18 g/L of calcium carbonate addition on citric acid fermentation when Na+ existed

綜上可知，在1 000 mg/L Na+存在條件下，于檸檬酸發(fā)酵開始時(shí)添加適量的CaCO3能促進(jìn)部分糊精和異麥芽糖的水解，總的可利用糖濃度增加，有效減輕了高濃度Na+對檸檬酸發(fā)酵的抑制作用，檸檬酸產(chǎn)量大幅度提高。但添加CaCO3會造成培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量副產(chǎn)物草酸，降低了原料利用率。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室提出了“檸檬酸-沼氣雙發(fā)酵耦聯(lián)系統(tǒng)”以解決檸檬酸發(fā)酵行業(yè)的廢水排放問題。然而厭氧消化出水成分復(fù)雜，Na+是其中主要的抑制物質(zhì)，若直接回用會嚴(yán)重抑制黑曲霉發(fā)酵，檸檬酸產(chǎn)量顯著下降。本文采用電滲析法對厭氧消化出水中的高濃度Na+進(jìn)行去除，循環(huán)回用10批后，平均檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到去離子水發(fā)酵水平，驗(yàn)證了耦聯(lián)系統(tǒng)是可行的。研究表明，高濃度Na+會造成發(fā)酵前期培養(yǎng)基pH快速下降，糖化酶和異麥芽糖酶活力受到抑制，導(dǎo)致部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，最終造成檸檬酸產(chǎn)量顯著降低。在檸檬酸發(fā)酵開始時(shí)添加CaCO3可以延緩發(fā)酵初期培養(yǎng)基pH的下降速率，但會造成培養(yǎng)基pH較高，使得草酰乙酸水解酶活力升高，導(dǎo)致副產(chǎn)物草酸大量積累，而檸檬酸產(chǎn)量仍低于去離子水發(fā)酵。因此，在后續(xù)的研究中可通過添加草酰乙酸水解酶抑制劑，或采用基因工程手段，對表達(dá)草酰乙酸水解酶的相關(guān)基因進(jìn)行敲除，從而減少或消除草酸的產(chǎn)生，為實(shí)現(xiàn)耦聯(lián)系統(tǒng)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Explorationofeffectofsodiumionsoncitricacidfermentationwithintegratedcitricacid-methanefermentationsystemanditsremoval

BAO Jia-wei,XU Jian, SU Xian-feng, ZHANG Hong-jian, MAO Zhong-gui*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

To solve the potential extraction wastewater pollution in citric acid production, an integrated citric acid-methane fermentation system was proposed. In this system, the extraction wastewater was treated through mesophilic anaerobic digestion (AD) and then the anaerobic digestion effluent was further treated and recycled to make mash for the next batch of citric acid fermentation, thus the wastewater discharge was eliminated. Excessive Na+contained in AD effluent was confirmed to be the major inhibitor for citric acid fermentation and its concentration could accumulate to 1 000 mg/L in recycling. AD effluent was treated with electrodialysis system to remove sodium and then recycled to make mash for the next batch of the citric acid fermentation. The recycling was performed for 10 batches andthe average citric acid production was 142.4 ±2.1 g/L,which was comparable to that of the fermentation with tap water (141.5 g/L).Effect of high concentration of sodium on the citric acid fermentation was investigated and the results indicated that 1 000 mg/L Na+contained in citric acid fermentation could decline the medium pH sharply at initial stage, which decreased the activity of isomaltase and glucoamylase secreted byAspergillusniger, and influenced the breakdown of isomaltose and part of other dextrins, thus caused the decrease of citric acid production. 18 g/L calcium carbonate was added to medium at the start of the citric acid fermentation,the decline rate of the medium pH slowed down, which could promote the breakdown of isomaltose and part of other dextrins, and thus could increase available sugar concentration and relieve the inhibition caused by 1 000 mg/L Na+.However,as the medium pH maintained at the high level because of the calcium carbonate addition, part of available sugar was converted to by-product oxalic acid and the citric acid production was 139.2 g/L, which was still lower than that of the fermentation with tap water.

citric acid; anaerobic digestion; calcium carbonate; sodium ions; isomaltase; glucoamylase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013727

碩士研究生(毛忠貴教授為通訊作者,E-mail: maozg@jiangnan.edu.cn)。

2016-12-14，改回日期：2017-02-20