動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中牙周致病菌的關(guān)系研究

張國明，何麗蕓，阿扎瑪提·阿扎提，馬松峰

·論著·

動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中牙周致病菌的關(guān)系研究

張國明1，何麗蕓2，阿扎瑪提·阿扎提1，馬松峰1

目的 分析動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中牙周致病菌的關(guān)系。方法 選取2014年8月—2015年10月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科行冠狀動脈旁路移植術(shù)的冠心病并牙周炎患者86例，收集其動脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑。采用Chelex-100法及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)提取動脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑中福賽斯坦納菌(Tf)DNA，計算動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf DNA拷貝數(shù)，動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf占比的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果 動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf陽性檢出率分別為60.71%、80.21%。動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf DNA測序結(jié)果符合Genbank數(shù)據(jù)庫相應(yīng)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)序列，同源性達(dá)99%。動脈粥樣硬化斑塊中Tf DNA拷貝數(shù)為(2.24×102±1.52×102)拷貝/μl，Tf占比為(0.28±0.13)%；齦下菌斑中Tf DNA拷貝數(shù)為(2.06×103±1.18×104)拷貝/μl，Tf占比為(0.35±0.22)%；動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf占比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf占比呈正相關(guān)(r=0.498，P<0.05)。結(jié)論 動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf陽性檢出率均較高，動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf具有同源性，且動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf相關(guān)。

冠狀動脈疾病；斑塊，動脈粥樣硬化；慢性牙周炎；牙菌斑；福賽斯坦納菌

張國明，何麗蕓，阿扎瑪提·阿扎提，等.動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中牙周致病菌的關(guān)系研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25(7)：13-17.[www.syxnf.net]

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近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人口老齡化進(jìn)程加劇，人們生活水平和生活方式發(fā)生改變，冠心病發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究表明，動脈粥樣硬化(AS)是導(dǎo)致冠心病的主要危險因素[1]。AS是一種長期且復(fù)雜的血管病變，是以血管內(nèi)皮功能障礙、血管內(nèi)膜過度纖維化、平滑肌細(xì)胞增殖及脂質(zhì)斑塊形成為主的慢性炎性反應(yīng)，也是由于遺傳因素、血管內(nèi)皮功能損傷及相關(guān)炎性反應(yīng)等共同作用的結(jié)果[2]。研究表明，炎性反應(yīng)參與了AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊形成和破裂的整個過程[3]；炎性疾病或慢性感染可能與AS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。也有研究表明，牙周炎與AS有共同的危險因素，如遺傳、吸煙、年齡、糖尿病及精神壓力等[5-6]。本研究對動脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑中的牙周致病菌進(jìn)行檢測，旨在探討動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中牙周致病菌的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年8月—2015年10月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科行冠狀動脈旁路移植術(shù)的冠心病并牙周炎患者86例，其中男66例，女20例；年齡42～76歲，平均年齡(58.5±17.7)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有其他全身系統(tǒng)性疾病者；(2)近3個月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、抗生素、性激素及避孕藥者。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動脈造影檢查顯示≥1支冠狀動脈直徑狹窄率≥50%。(2)牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[7]中的牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，冠狀動脈旁路移植術(shù)前1周內(nèi)由牙周?？漆t(yī)生測量全口牙周袋深度(PD)和臨床附著喪失(CAL)。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 主要試劑 5%Chelex-100由美國Sigma公司提供；蛋白酶K和2×Power Tap PCR MasterMix由上海生工生物工程有限公司提供；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京百泰克生物技術(shù)有限公司提供；高純質(zhì)粒小量制備試劑盒(離心柱型)，新型pUM-T快速克隆試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由大連寶生物工程有限公司提供；福賽斯坦納菌(Tf)標(biāo)準(zhǔn)菌株由新疆醫(yī)科大學(xué)重點實驗室提供；Tf的16SrRNA特異性引物序列按照引物設(shè)計原則由北京六合華大基因科技有限公司合成(上游引物序列為5′-GTCGGACTAATACCTCATAAAACA-3′，下游引物序列為5′-TCGCCCATTGACCAATATT-3′，擴(kuò)增的目的片段長度為222 bp)，上、下游引物序列均與基因庫相比較以確保其特異性，內(nèi)參基因引物為總細(xì)菌的通用引物，根據(jù)細(xì)菌16SrDNA的特異性保守序列設(shè)計，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 主要儀器 Gel Doc2000型凝膠成像儀和實時熒光定量PCR儀由美國Bio-Rad公司提供；-80 ℃超低溫冰箱由美國Thermo公司提供；低溫高速臺式離心機(jī)由美國Thermo公司提供；DYY-7C型核酸電泳儀由北京六一儀器廠提供；TU-1901型紫外分光光度計由北京普析通用儀器有限公司提供；GAP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科學(xué)儀器有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集 (1)醫(yī)師在冠狀動脈旁路移植術(shù)中通過冠狀動脈內(nèi)膜切除術(shù)收集動脈粥樣硬化斑塊，動脈粥樣硬化斑塊取出后迅速放入無菌試管中，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。(2)齦下菌斑標(biāo)本：冠狀動脈旁路移植術(shù)前1周，由牙周?？漆t(yī)師進(jìn)行牙周檢查，選取患者4個PD≥5 mm位點，用無菌齦上刮治器去除取樣牙齒的齦上菌斑，棉卷隔濕干燥后，用另一無菌齦下刮治器插入齦溝底采集齦下菌斑，置入無菌EP管中，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4.2 DNA提取 將標(biāo)本取出后于室溫下解凍，取齦下菌斑和經(jīng)充分剪碎研磨的動脈粥樣硬化斑塊100 mg，置入無菌EP管中，分別加入5%Chelex-100 150 μl和蛋白酶K 4 μl，用旋渦混合器混勻10 min，于100 ℃水浴箱中水浴10 min，冰上放置1 min，室溫下以12 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法 (1)PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系40 μl，2×Power Tap PCR MasterMix 20 μl，DNA模板8 μl，上下游引物各1.0 μl(10 pmol/μl)，無菌去離子水補(bǔ)足總體積至40 μl。(2)PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入主循環(huán)，其中95 ℃預(yù)變性30 s、退火30 s、72 ℃延伸40 s(經(jīng)34個循環(huán))，末次72 ℃延伸5 min終止反應(yīng)。(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μl，加2 μl載樣緩沖液點樣于2%瓊脂糖凝膠中，以Tf標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，以加入無菌去離子水為模板的反應(yīng)體系為空白對照；電壓100 V，電泳30 min，在Gel Doc2000型凝膠成像儀下觀察擴(kuò)增情況。將動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中測到的牙周致病菌基因的PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果應(yīng)用Blast軟件與Genbank數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，確定序列來源。(4)實時熒光定量PCR：采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，后置于-20 ℃冰箱保存待測；利用新型pUM-T快速克隆試劑盒使pUM-T與目的DNA片段連接，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落并將其挑至含培養(yǎng)基的試管中，置入37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)，200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：將構(gòu)建好的Tf重組質(zhì)粒和內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋5個濃度梯度；以不出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增效率為90%～105%；每份標(biāo)本上機(jī)時需并行5份：Tf和內(nèi)參基因梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中的Tf，內(nèi)參基因分別擴(kuò)增，均做復(fù)管。(6)根據(jù)拷貝數(shù)公式計算動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf DNA拷貝數(shù)，Tf DNA拷貝數(shù)=(mol數(shù)/μl)×6.02×1023=〔質(zhì)量(g)/分子量〕/μl×6.02×1023=〔質(zhì)量(ng)×10-9/分子量〕/μl×6.02×1023=濃度(ng/μl)×6.02×1014/分子量。

2 結(jié)果

2.1 動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf的檢出情況 動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf陽性檢出率分別為60.71%、80.21%。動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1；動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf DNA測序結(jié)果符合Genbank數(shù)據(jù)庫相應(yīng)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)序列，同源性達(dá)99%(見圖2)。

注：M為DNA Marker；1為陽性對照，福賽斯坦菌(Tf)標(biāo)準(zhǔn)菌株；2、3、4為動脈粥樣硬化斑塊中擴(kuò)增的Tf；5、6、7為齦下菌斑中擴(kuò)增的Tf；8為空白對照，無菌去離子水

圖1 Tf PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 1 Electrophoretogram of PCR amplified product of Tf

注：Tf：CACCCCGCTCGCATGTGGCTATTTGTTAAGTTTATTGGTTGCGGATGGGCAT GCGTA CCATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGCCATCGATGGTTAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGA

圖2 Tf PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基因測序結(jié)果

Figure 2 Gene sequencing results of PCR amplified product of Tf

2.2 實時熒光定量PCR結(jié)果 內(nèi)參基因溶解曲線無雜峰，產(chǎn)物單一(見圖3A)；內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為100.2%，決定系數(shù)r2=0.999(見圖3B)；目的基因Tf溶解曲線見圖3C；目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為113.6%，決定系數(shù)r2=0.999(見圖3D)。內(nèi)參基因和目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系及擴(kuò)增效率較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建成功。

2.3 Tf DNA拷貝數(shù)和Tf占比 動脈粥樣硬化斑塊中Tf DNA拷貝數(shù)為(2.24×102±1.52×102)拷貝/μl，齦下菌斑中Tf DNA拷貝數(shù)為(2.06×103±1.18×104)拷貝/μl；動脈粥樣硬化斑塊中Tf占比為(0.28±0.13)%，齦下菌斑中Tf占比為(0.35±0.22)%，動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf占比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.717，P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf占比呈正相關(guān)(r=0.498，P<0.05，見圖4)。

圖4 動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf關(guān)系的散點圖

Figure 4 Scatter diagram for correlation of Tf between atherosclerotic plaque and subgingival plaque

注：A為內(nèi)參基因溶解曲線，B為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，C為目的基因溶解曲線，D為目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 Tf實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Figure 3 Real-time fluorescence quantification PCR amplification curve for Tf

3 討論

冠心病是臨床常見的心血管疾病，其主要病理改變?yōu)檫M(jìn)行性AS及血栓形成，嚴(yán)重危及人們的生命健康及生活質(zhì)量。近年研究表明，局部或系統(tǒng)慢性炎癥可能導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子及免疫反應(yīng)，包括炎性細(xì)胞浸潤、炎性因子過度表達(dá)等，同時炎性因子可參與細(xì)胞調(diào)節(jié)、血管重塑并在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，會增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險[1-8]。

牙周炎是常見的感染性疾病之一，也是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因，是口腔健康的“頭號殺手”。牙周病原菌微生物可刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性遞質(zhì)，促進(jìn)血小板聚集，破壞血管上皮細(xì)胞完整性；同時還可促使炎性細(xì)胞浸潤、膽固醇及膽固醇脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞聚集、吞噬脂類形成泡沫細(xì)胞、纖維蛋白沉積，進(jìn)而形成斑塊。研究表明，牙周炎可能是冠心病的潛在危險因素[9]；牙周致病菌及其代謝產(chǎn)物脂多糖會激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)而釋放多種炎性因子，導(dǎo)致AS的發(fā)生風(fēng)險增加25%[10-11]。

目前，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，AS的發(fā)生機(jī)制研究已深入到分子生物學(xué)領(lǐng)域，通過檢測發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊中存在多種常見口腔微生物DNA，包括牙齦卟啉單胞菌、Tf、中間普氏菌、伴放線桿菌等[12-13]。CHIU[14]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化斑塊中測出的牙齦卟啉單胞菌、Tf、中間普氏菌等常存在于斑塊不穩(wěn)定部位，并伴有潰瘍及血栓形成，其周圍鄰近血管壁細(xì)胞常富含凋亡小體，提示牙周的常見致病菌可能參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展。TUOMAINEN等[15]研究表明，牙周致病菌可通過引發(fā)炎性反應(yīng)、脂蛋白代謝紊亂、血管基質(zhì)重塑而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)研究表明，冠心病合并重度牙周炎患者動脈粥樣硬化斑塊及齦下菌斑中的牙周致病菌檢出率高于冠心病合并輕度牙周炎患者，提示牙周致病菌與AS間存在相關(guān)性[16-17]。動物實驗研究表明，牙周炎兔的動脈血管壁上存在較多脂質(zhì)沉積，且沉積程度與牙周炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18]。Tf是目前公認(rèn)的牙周炎三大主要致病菌之一，檢出率較高[19-21]。

本研究結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中均檢出Tf的DNA，陽性檢出率分別為60.71%、80.21%；動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf的DNA測序與Tf標(biāo)準(zhǔn)序列同源性達(dá)99%；動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf占總菌的比值間存在差異；動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中的Tf呈正相關(guān)，提示動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中均存在Tf，動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中的Tf有相關(guān)性。

綜上所述，動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf陽性檢出率均較高，動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中Tf具有同源性，且動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf相關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：張國明、馬松峰進(jìn)行試驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；何麗蕓、阿扎瑪提·阿扎提進(jìn)行試驗實施、評估、資料收集；馬松峰進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

Correlation of Periodontal Pathogen between Atherosclerotic Plaque and Subgingival Plaque

ZHANGGuo-ming1，HELi-yun2，AZHAMATI·Azhati1，MASong-feng1

1.TheFirstDepartmentofPediatricSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China2.CentralOperatingRoom，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，ChinaCorrespondingauthor：MASong-feng，E-mail：quellasweet@163.com

Objective To analyze the correlation of periodontal pathogen between atherosclerotic plaque and subgingival plaque.Methods From August 2014 to October 2015，a total of 86 coronary heart disease patients complicated with periodontitis were selected in the Department of Cardiac Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，all of them

coronary artery bypass grafting，atherosclerotic plaque and subgingival plaque were collected.Chelex-100 method and PCR were used to extract DNA of Tannerella forsythensis(Tf)in atherosclerotic plaque and subgingival plaque，copies of Tf DNA was calculated in therosclerotic plaque and subgingival plaque，respectively，and Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation of Tf ratio beween atherosclerotic plaque and subgingival plaque.Results Positive detection rate of Tf was 60.71% and 80.21% in atherosclerotic plaque and subgingival plaque，respectively.Sequencing analysis results showed that，Tf DNA sequence in atherosclerotic plaque and subgingival plaque was accord with the standard sequence in Genbank，the homologous rate was 99%.Copies of Tf DNA was(2.24×102±1.52×102)copies/μl〔accounting for (0.28±0.13)%〕 in atherosclerotic plaque，copies of Tf DNA was(2.06×103±1.18×104)copies/μl〔accounting for(0.35±0.22)%〕；the difference of Tf ratio was statistically significantly different between atherosclerotic plaque and subgingival plaque(P<0.05).Pearson correlation analysis results showed that，Tf ratio in atherosclerotic plaque was positively correlated with that in subgingival plaque(r=0.498，P<0.05).Conclusion Positive detection rate of Tf is relatively high in atherosclerotic plaque and subgingival plaque，respectively，Tf in atherosclerotic plaque and in subgingival plaque homologous and correlative.

Coronary disease；Plaque，atherosclerotic；Chronic periodontitis；Dental plaque；Tannerella forsythensis

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(2016D01C336)

馬松峰，E-mail：quellasweet@163.com

R 541.4

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.07.004

2017-03-27；

2017-07-09)

1.830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒外一病區(qū)

2.830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心手術(shù)室

【編者按】 牙周炎是一種以菌斑微生物感染為始動因素的慢性炎性疾病，大量流行病學(xué)和動物實驗證實，牙周炎與心血管疾病有關(guān)，但牙周炎與心血管疾病的相關(guān)作用機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚缺乏統(tǒng)一認(rèn)識。張國明所在課題組通過Chelex-100法及聚合酶鏈反應(yīng)提取動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中福賽斯坦納菌(Tf)DNA，初步探討了牙周炎與動脈粥樣硬化間的關(guān)系，提示動脈粥樣硬化斑塊與齦下菌斑中Tf有關(guān)。敬請關(guān)注！