小麥淀粉加工廢水中阿拉伯木聚糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性研究

田貝貝,陳 潔,王遠(yuǎn)輝

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

小麥淀粉加工廢水中阿拉伯木聚糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性研究

田貝貝,陳 潔,王遠(yuǎn)輝

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)

從小麥淀粉加工廢水中制備阿拉伯木聚糖(AX),通過(guò)激光光散射法和離子色譜法(IC)對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組分等理化性質(zhì)進(jìn)行分析,并采用體外實(shí)驗(yàn)研究AX的抗氧化性。研究表明:源自小麥淀粉廢水的AX具有較強(qiáng)的還原能力和DPPH自由基清除能力,對(duì)羥基自由基清除作用則相對(duì)較弱。分級(jí)醇沉可以有效分離具有不同分支結(jié)構(gòu)、單糖比例、相對(duì)分子質(zhì)量的AX,其中60%乙醇醇沉AXE純度較高,純度為86.81%。分級(jí)醇沉AX,隨乙醇濃度的增加,目標(biāo)AX的平均相對(duì)分子質(zhì)量減小,其Ara/Xyl比值及半乳糖(Gal)含量增加。具有不同相對(duì)分子質(zhì)量、分支結(jié)構(gòu)及單糖比例的AX,其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基清除作用以及還原力不同,分子質(zhì)量較大且具有較小分支結(jié)構(gòu)的AX具有較強(qiáng)的供氫能力,而絡(luò)合游離金屬離子的能力相對(duì)較弱。

小麥淀粉廢水,阿拉伯木聚糖,相對(duì)分子質(zhì)量,抗氧化性

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植最廣泛的糧食作物,小麥的傳統(tǒng)加工主要是制粉(小麥淀粉和谷朊粉)。小麥淀粉加工工藝主要有面團(tuán)洗面筋法和三相臥螺分離法,這兩種工藝為濕法分離,均會(huì)產(chǎn)生高黏度加工廢水(戊聚糖漿)。其副產(chǎn)物主要作為動(dòng)物飼料、肥料、生產(chǎn)酒精的原料或在不能及時(shí)銷(xiāo)售的情況下進(jìn)入污水處理系統(tǒng),既影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益又污染環(huán)境。最新發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物戊聚糖漿中的阿拉伯木聚糖(AX)有特定的營(yíng)養(yǎng)功能。AX是非淀粉膠粘性多糖,主要由木糖(Xyl)和阿拉伯糖(Ara)組成,具有腸道益生活性[1-3]、免疫調(diào)節(jié)活性[4-5]、抗氧化活性[6-8]、降血糖功能[9-10]等,其生物活性與AX相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān),且低分子質(zhì)量AX免疫增強(qiáng)活性較好[5,11]。已有研究表明乙醇分級(jí)醇沉具有不同相對(duì)分子質(zhì)量、Ara/Xyl比率及木糖殘基取代度的AX是一個(gè)非常有效的方法,且Ara/Xyl比率和木糖殘基取代度隨著乙醇濃度的增加而增加,分級(jí)醇沉是基于不同分子質(zhì)量和分支結(jié)構(gòu)的AX在乙醇中的溶解度不同[12-14]。

氧自由基可進(jìn)攻生物膜脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)等重要生物大分子,可加速機(jī)體衰老,造成機(jī)體的損傷和病變。天然抗氧化劑可以清除細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧自由基從而提高機(jī)體的免疫功能[15-16]。因此,天然抗氧化劑的研究愈來(lái)愈受到重視,如茶多酚、大豆異黃酮、大豆肽、枸杞多糖等。多糖能清除活性氧自由基,其抗氧化活性已引起人們的關(guān)注,相關(guān)研究正逐步展開(kāi)。目前,對(duì)AX的研究主要側(cè)重于麩皮多糖的生物活性探索,對(duì)小麥淀粉加工廢液中分離出的AX相關(guān)研究較少,且不夠深入,因此本文以其為研究對(duì)象,采用激光光散射法和離子色譜法(IC)分析AX的理化性質(zhì),通過(guò)檢測(cè)AX對(duì)羥基自由基、DPPH自由基的清除能力以及還原能力,對(duì)不同分子質(zhì)量AX的體外抗氧化活性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有抗氧化活性的多糖資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥淀粉加工廢水 鄲城財(cái)鑫糖業(yè)有限責(zé)任公司;木聚糖內(nèi)切酶 諾維信公司;二苯代苦味酰肼、葡萄糖、間苯三酚、鹽酸、冰醋酸、無(wú)水乙醇、檸檬酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、乙醇、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、重蒸酚、濃硫酸 均為分析純化學(xué)試劑。

TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DL-5000B-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DIONEX ICS-3000 USA離子色譜儀 美國(guó)戴安公司;多角度激光光散射儀 Wyatt Technology DAWN EOS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AX產(chǎn)品的制備 小麥淀粉加工廢水(固形物含量為10%)→調(diào)節(jié)酸度4.0～6.0→添加戊聚糖酶(酶與料液中固形物的質(zhì)量比為0.1%)→ 50 ℃恒溫水浴攪拌1.5 h→離心(4500 r/min,20 min)→上清液→ 90～95 ℃保持25 min→離心→上清液→濃縮醇沉→沉淀物經(jīng)乙醇洗滌后加水復(fù)溶→二次離心(4500 r/min,20 min)→濃縮醇沉→沉淀物冷凍干燥→酶解阿拉伯木聚糖產(chǎn)品。

操作要點(diǎn):參考Izydorczyk[13]、張曉娜[11]等的方法。初次醇沉?xí)r,控制乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為80%以上,得AXE;初次濃縮醇沉?xí)r為分級(jí)醇沉,依次調(diào)整乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為60%和80%,分別得AXE(60%)和AXE(80%)。

小麥淀粉加工廢水→二次離心→上清液→濃縮醇沉→沉淀物復(fù)溶→離心→上清液→濃縮醇沉→沉淀物冷凍干燥→未酶解阿拉伯木聚糖產(chǎn)品(未酶解AX)。

1.2.2 水分的測(cè)定 按GB/T21305-2007谷物及谷物制品水分的測(cè)定常規(guī)法執(zhí)行。

1.2.3 戊聚糖含量的測(cè)定 間苯三酚法[17]。

1.2.4 總糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法[11]。

1.2.5 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 色譜柱:TSK Gel G4000PWxl;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:200 μL;樣品濃度:1 mg/mL。

1.2.6 單糖組成分析 色譜柱:分析柱:Carbo PacTMPA20,3 mm×150 mm Analytical。淋洗液:250 mmol/L NaOH和1mol/L NaAC;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:35 ℃;檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器,金電極。梯度洗脫條件:A為超純水,B為250 mmol/L NaOH,C為1 mol/L NaAC。0～20 min:94% A,6% B,0% C。20～20.1 min:89% A,6% B,5% C。20.1～35 min:74% A,6% B,20% C。35.1～45 min:20% A,80% B。45.1～55 min:94% A,6% B。

樣品前處理:精確稱(chēng)量試樣10 mg于水解管中,加入4 mL三氟乙酸(4 mol/L),充氮1 min排出管內(nèi)空氣,旋緊螺旋蓋,于120 ℃水解2 h,待冷卻后氮?dú)獯蹈伤庖?除去過(guò)量的三氟乙酸,加超純水定容至10 mL。稀釋后,0.2 μm濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣。

1.2.7 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 參照DPPH比色法[18],于離心管中加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH-95%乙醇,3 mL樣品,搖勻后放置0.5 h,離心(4500 r/min,2 min),取上清液在517 nm下測(cè)其吸光度A0、A1、A2。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

式(1)中A0:DPPH+蒸餾水;A1:DPPH+樣品;A2:95%乙醇+樣品。

1.2.8 清除羥自由基能力的測(cè)定 參照水楊酸比色法[19]。于離心管中依次先加入0.5 mL 9.1 mmol/L乙醇-水楊酸,0.5 mL樣品,0.5 mL 9.1 mmol/L FeSO4,3.5 mL蒸餾水,再加入5 mL 8.8 mmol/L H2O2后搖勻,37 ℃水浴加熱15 min,離心(4500 r/min,2 min),取上清液在510 nm下測(cè)其吸光度A0、A樣。

羥自由基清除率(%)=(A0-A樣)/A0×100

式(2)

式(2)中A0:以水代替樣品,為空白樣測(cè)定值;A樣:樣品測(cè)定值。

1.2.9 多糖還原力的測(cè)定 精確稱(chēng)量AX樣品,以蒸餾水為溶劑,制備不同濃度的多糖溶液。參照文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定多糖的還原力,以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以p<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn),利用Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 相對(duì)分子質(zhì)量分布

小麥淀粉加工廢水(戊聚糖漿)受其高黏度的限制,難以分離、提純具有抗氧化活性的阿拉伯木聚糖(AX),因此,木聚糖內(nèi)切酶用于降低戊聚糖漿的黏度[21]。表1可知,未酶解AX、酶解AX(AXE)、AXE(60%)、AXE(80%)四種AX產(chǎn)品的平均相對(duì)分子質(zhì)量依次減小。由于AX由主鏈木聚糖和側(cè)鏈阿拉伯糖連接而成,木糖殘基、阿拉伯糖分別經(jīng)β-(1,4)糖苷鍵連接形成AX的主、側(cè)鏈。木聚糖內(nèi)切酶可以攻擊木聚糖主鏈,隨機(jī)切斷β-(1,4)糖苷鍵,使AX解聚,生成可以取代低聚木糖的混合物,相對(duì)分子質(zhì)量降低[12,22]。因此,未酶解AX平均相對(duì)分子質(zhì)量大于酶解AX產(chǎn)品。乙醇分級(jí)沉淀AXE,由于不同分子質(zhì)量的AX在乙醇中的溶解度不同,隨乙醇濃度的增加,所得AX的平均分子質(zhì)量減小,故80%乙醇醇沉AXE的平均相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小。

表1 AX相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 1 Mw distribution of AX

表2 AX單糖組成分析Table 2 Monosaccharide compositions of AX

注：各指標(biāo)的測(cè)定均取三次測(cè)定的平均值。)

2.2 單糖組成分析

由表2可知,四種AX產(chǎn)品的組成基本相似,AXE(60%)純度較高,蛋白質(zhì)含量為5.68%,而AXE(80%)的純度相對(duì)較低。除AXE(60%)外其它三種AX產(chǎn)品均含有大量蛋白質(zhì),尤其是AXE(80%)蛋白質(zhì)含量更高。從AX的單糖組成分析可知,AX主要由阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)組成,含有部分葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal),而AXE(60%)與AXE(80%)的單糖組分之間的比例有很大差異,AXE(80%)中含有較多的Gal,而AXE(60%)中Gal的比例則很小。Jelaca[23]指出,阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯木聚糖是面粉中水溶性戊聚糖的主要組成成分,這說(shuō)明小麥淀粉加工廢水中可能也含有阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯木聚糖兩種多糖。而在AXE(60%)中阿拉伯半乳聚糖的含量較少,且其Ara/Xyl比值較AXE(80%)小。另外,通過(guò)乙醇分級(jí)沉淀AXE,隨乙醇濃度的增加,Ara/Xyl和木糖殘基取代度隨之增加。這是由于分級(jí)醇沉是基于不同分子量和分支結(jié)構(gòu)的AX在乙醇中的溶解度不同及阿拉伯糖殘基在木糖主鏈上的取代度不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)60%乙醇和80%乙醇分級(jí)沉淀AXE,可以有效分離具有不同相對(duì)分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)及單糖比例的AX。

2.3 AX抗氧化活性研究

2.3.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 圖1表明,源自小麥淀粉加工廢水的酶解AX與未酶解AX對(duì)DPPH自由基都具有一定的清除作用,且清除率與AX濃度之間存在一定的劑量關(guān)系,AX濃度越大,其對(duì)DPPH自由基的清除作用越強(qiáng)。由表3可以看出,4種AX產(chǎn)品對(duì)DPPH自由基的清除能力由低到高依次為未酶解AX、AXE(60%)、AXE、AXE(80%)(平均相對(duì)分子質(zhì)量依次減小),其IC50分別為4.18、3.33、2.85、1.85 mg/mL。AXE(80%)清除DPPH自由基的能力最強(qiáng),其平均相對(duì)分子質(zhì)量較小且具有較高的分支結(jié)構(gòu)(Ara/Xyl為0.88)。張曉娜[11]研究表明,麩皮酶解AX產(chǎn)品中以AXE(80%)對(duì)DPPH自由基的清除效果最好,其IC50為0.58 mg/mL,與本研究結(jié)果相似。由此可知,DPPH自由基的清除能力與AX的平均相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān),也可能與AX的分支結(jié)構(gòu)和木糖殘基取代度有關(guān),由于多糖的分支結(jié)構(gòu)、取代基及相對(duì)分子質(zhì)量都會(huì)影響其活性[24]。

圖1 AX對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging capacity of DPPH free radicals by AX注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖2、圖3同。

抗氧化能力IC50值(mg/mL)未酶解AXAXEAXE(60%)AXE(80%)DPPH自由基4.182.853.331.85羥基自由基18.2139.9432.1765.45

2.3.2 清除羥自由基能力的測(cè)定 生物體內(nèi)存在游離金屬離子,如鐵離子,能夠催化H2O2生成羥自由基,導(dǎo)致相鄰分子損傷,而抗氧化劑能夠絡(luò)合Fe3+減少羥自由基的產(chǎn)生[25-26]。圖2可見(jiàn),AX對(duì)羥自由基的清除作用隨其濃度的增加呈緩慢上升趨勢(shì)。由表3可知,未酶解AX對(duì)羥自由基的清除能力相對(duì)較強(qiáng),其IC50為18.21 mg/mL;AXE(60%)、AXE、AXE(80%)對(duì)羥自由基的清除作用依次降低,IC50分別為32.17、39.94、65.45 mg/mL。AXE(60%)與AXE對(duì)羥自由基的清除能力接近的原因在于當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí),除極少量小分子質(zhì)量AX外,大量AX可以析出,即AXE(60%)在AXE中所占比例較大。AXE(80%)對(duì)羥自由基的清除作用較低,原因可能還在于其雜質(zhì)(蛋白質(zhì)26.77%)的干擾,影響吸光度測(cè)定,導(dǎo)致吸光值偏大,清除率偏低。

圖2 AX對(duì)羥自由基的清除率Fig.2 Scavenging capacity of hydroxyl radicals by AX

2.3.3 多糖還原力的測(cè)定 生物體內(nèi)存在游離金屬離子,如鐵離子,通過(guò)Fe3+被抗氧化劑還原成Fe2+來(lái)測(cè)定抗氧化劑的還原力,還原能力愈強(qiáng),其抗氧化活性愈好[27-28]。AX的還原能力如圖3,與清除DPPH自由基和羥基自由基能力相似,隨所測(cè)樣品濃度的增加,AX的還原能力增強(qiáng)。平均分子質(zhì)量相對(duì)較小的AX(80%)具有較強(qiáng)的還原能力,AXE、未酶解AX、AXE(60%)的還原能力依次降低。結(jié)合表1可知,具有較強(qiáng)還原力的AX(80%)的Ara/Xyl比值為0.88,而還原力相對(duì)較弱的AXE(60%)的Ara/Xyl比值為0.77。因此,AX產(chǎn)品的還原能力既與多糖的相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān),也可能受其Ara/Xyl比值和木糖殘基取代度的影響。

圖3 AX還原能力分析Fig.3 Reducing power of AX

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,木聚糖內(nèi)切酶可以用于提取具有較高純度的AXE(60%),另外,乙醇分級(jí)沉淀AX,可以有效分離具有不同相對(duì)分子質(zhì)量、分支結(jié)構(gòu)及單糖比例的AX產(chǎn)品。四種AX產(chǎn)品具有很強(qiáng)的還原能力和DPPH清除能力,對(duì)羥自由基清除作用相對(duì)較弱。原因在于抗氧化劑對(duì)羥自由基清除能力與DPPH自由基清除能力、還原力三者作用機(jī)理不同,DPPH自由基清除能力和還原力的測(cè)定是基于電子轉(zhuǎn)移,抗氧化劑通過(guò)自身的供氫能力給出電子,達(dá)到還原游離金屬離子和自由基的目的,而對(duì)羥自由基的清除作用屬于絡(luò)合機(jī)理[29]。四種AX對(duì)DPPH自由基、羥基自由基清除作用以及還原力不同的原因在于其相對(duì)分子質(zhì)量、分支結(jié)構(gòu)及單糖比例之間的差異,具有較高分支結(jié)構(gòu)且較小相對(duì)分子質(zhì)量的AX具有較強(qiáng)的供氫能力,而絡(luò)合游離金屬離子的能力相對(duì)較弱。因此,分級(jí)醇沉可以有效篩選出具有目標(biāo)抗氧化活性的AX產(chǎn)品。本研究為小麥淀粉加工廢水的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值提供理論參考,為具有抗氧化活性的多糖資源的開(kāi)發(fā)提供新方向。

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Study on physicochemical properties and antioxidant activity of Arabinoxylan from wheat starch wastewater

TIAN Bei-bei,CHEN Jie,WANG Yuan-hui

(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

Arabinoxylan were prepared from wheat starch wastewater. The physicochemical properties and antioxidant activity of AX were analyzed by laser light scattering method,IC andinvitroexperiments. The results showed that the AX from wheat starch wastewater had a strong reducing ability and a scavenging capacity of DPPH free radicals,while the ability of scavenging hydroxyl radical of AX was relatively weak. Ethyl alcohol fractionation precipitation can effectively separate the AX with different degree of branching,monosaccharide ratio and molecular weight. The AXE(60% ethyl alcohol precipitates)had higher purity(86.81%). The galactose(Gal)content and ratio of Ara/Xyl of AX increased with the increasing concentrations of ethanol,while the molecular weight decreased. The molecular weight,branched structure and monosaccharide ratio of AX played an important role in antioxidant activity. The AX with low molecular weight and a higher degree of branching showed a greater capability to provide hydrogen atoms,while the ability to complex free metal ions was relatively weak.

wheat starch wastewater;arabinoxylan;Mw;antioxidant activity

2017-01-17

田貝貝(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與品質(zhì)檢測(cè)，E-mail:15703887555@163.com。

以小麥副產(chǎn)物生產(chǎn)阿拉伯木聚糖的優(yōu)化合作研究項(xiàng)目(2015DFA30380)。

TS249.9

A

1002-0306(2017)15-0040-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.009