甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響作用

滕 楊,王易男,劉冰雪,耿玉亭,李永吉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040; 2.佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154007)

甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響作用

滕 楊1,2,王易男2,劉冰雪2,耿玉亭2,李永吉1,*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040; 2.佳木斯大學(xué),黑龍江佳木斯 154007)

目的:探討甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的影響作用。方法:采用CCl4建立小鼠急性肝損傷模型,通過測(cè)定各組小鼠血清中TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT的含量及肝組織勻漿中 MDA、GPX水平,并結(jié)合病理學(xué)HE染色,表明甘草硒多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的影響。結(jié)果:中、高劑量甘草硒多糖與模型組比較可明顯降低急性肝損傷小鼠血清中的AST(p<0.05)、ALP(p<0.05)及肝組織中的MDA(p<0.05)和GSH-Px(p<0.05)水平,高劑量組還可明顯降低ALT(p<0.05)含量,改善CCl4所致的病理組織損傷。結(jié)論:甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過清除自由基而達(dá)到防治肝細(xì)胞損害的療效。

甘草硒多糖,四氯化碳,急性肝損傷

甘草(Glycyrrhiza)屬豆科(Leguminosae)多年生草本植物,又名烏拉爾甘草、甜草、甜根子等[1],其多糖(簡(jiǎn)稱GP),主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成[2],含有大量的還原結(jié)構(gòu),決定其還原性強(qiáng)[3],從而阻止氧化損傷[4]。硒為谷胱甘肽過氧化物酶的核心組成成分,此酶催化還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽,同時(shí)使有毒性的過氧化物還原為無害的羥基化合物[5],同時(shí)對(duì)肝炎病毒的突變有控制作用[6-7]。本文旨在將甘草多糖硒化后,通過對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型血清中特異酶指標(biāo)測(cè)定和HE染色結(jié)果,考察中藥甘草硒多糖(glycyrrhiza selenium polysaccharide,GSPS)的肝臟保護(hù)作用,為甘草的進(jìn)一步開發(fā)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)昆明種小鼠 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);聯(lián)苯雙酯滴丸 北京協(xié)和藥廠;四氯化碳 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)試劑盒 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;牛血清蛋白A-9647(BSA) Sigma;亞硒酸鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250 沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司;還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;甘草多糖 純度≥98%,本實(shí)驗(yàn)室提取并純化;其他試劑 均為分析純。

表1 小鼠血清中ALT、AST、ALP、ALB、γ-GT、TP的含量Table 1 The values of ALT,AST,ALP,ALB,γ-GT,TP in serum of mice(±s,n=3)

注：＊:p<0.05,與模型組組比較;*:p<0.05,與聯(lián)苯雙酯組比較;★:p<0.05,與空白組比較，表2同，肝重指數(shù)(%)=肝重/體重×100。

PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀 普朗醫(yī)療設(shè)備公司;AX224ZH/E天電子平 奧豪斯儀器常州有限公司;MYP11-2恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;UV-1100紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;OXM1200C光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司;F6/10型手動(dòng)勻漿機(jī) 上海凈信科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草硒多糖的制備 制備方法同先前發(fā)表的山藥硒多糖的制備方法[8]相同。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 昆明種小鼠(SPF級(jí)),隨機(jī)分為空白組,模型組,聯(lián)苯雙酯組,甘草硒多糖組、高、中、低甘草硒多糖組7組,每組8只,正常飼養(yǎng)一周后,空白組和模型組灌胃等量生理鹽水,聯(lián)苯雙酯組灌聯(lián)苯雙酯組2 g·kg-1,甘草多糖組灌胃給藥2 g·kg-1,高劑量組給藥6 g·kg-1,中劑量組給藥4 g·kg-1,低劑量組2 g·kg-1,連續(xù)灌胃給藥7 d;第7 d給藥1 h后,除空白組外,均腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液10 mL·kg-1;繼續(xù)同上喂養(yǎng)7 d。

1.2.2 肝損傷指標(biāo)的檢測(cè) 第14 d灌胃給藥4 h后,眼球法取血,離心15 min(3000 r·min-1),分離血清。按試劑盒說明利用PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT含量;取相同部位肝臟0.2 g,用生理鹽水漂洗,除去殘留血液并用生理鹽水配制成10%的組織勻漿液,手動(dòng)勻漿,離心,取上清,按試劑盒說明的方法測(cè)定肝組織中GPx、MDA的含量。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察 取肝大葉用10%的甲醛固定,按常規(guī)方法制備切片,進(jìn)行HE染色,光鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以x±s表示,組間比較采用One way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草硒多糖的得率與硒含量

按實(shí)驗(yàn)1.2.1方法合成10批甘草硒多糖,獲得的硒多糖的平均產(chǎn)率為33.42%±1.24%,含硒量為3.11 mg·g-1。

2.2 鼠肝重指數(shù)

結(jié)果見表1,聯(lián)苯雙酯組和甘草中、高劑量治療組和空白組比較肝臟指數(shù)無顯著性差異;模型組與空白組比較有顯著性差異(p<0.05),推測(cè)肝功能障礙會(huì)引起肝細(xì)胞破損,組織液流出,蓄積,導(dǎo)致組織腫大。

2.3 血清中各種酶及蛋白含量的測(cè)定結(jié)果

由表1可知,模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT水平較空白組明顯升高,均有顯著性差異(p<0.05);同時(shí)TP、ALB水平明顯低于空白組,有顯著性差異(p<0.05),說明CCl4引起的小鼠急性肝損傷的模型制造成功。聯(lián)苯雙酯組、空白組相比所有檢測(cè)指標(biāo)均無顯著差異(p>0.05),說明聯(lián)苯雙酯滴丸有明顯治療作用。甘草硒多糖低、中劑量治療組較聯(lián)苯雙酯組TP、ALB水平明顯降低,TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT含量升高,均有顯著性差異(p<0.05),說明干預(yù)治療效果不佳,高劑量組與其無顯著性差異,說明高劑量組治療效果與聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)。

2.4 對(duì)肝組織中GSH-Px、MDA的含量測(cè)定結(jié)果

由表2可知,模型組與空白組比較,GSH、MDA含量顯著升高(p<0.05),也表明本實(shí)驗(yàn)造模成功。聯(lián)苯雙酯對(duì)照組與模型組比較,GSH、MDA含量顯著降低,說明聯(lián)苯雙酯組有治療作用。甘草硒多糖中、低劑量組與聯(lián)苯雙酯組相比有顯著性差異(p<0.05),與模型無顯著差異;甘草硒多糖高劑量組與模型組相比可顯著降低肝組織中GSH、MDA水平(p<0.05),表明較高濃度的甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

圖2 肝組織HE染色Fig.2 The results of liver tissue by HE

表2 小鼠肝組織中MDA和GSH-Px含量Table 2 Values of MDA and GSH-Px in liver tissue

2.5 組織病理變化的影響

肝組織HE染色顯示,空白組小鼠肝細(xì)胞束排列整齊,模型組肝細(xì)胞空泡變性,有寬大的纖維間隔,細(xì)胞基本被破壞。甘草硒多糖、聯(lián)苯雙酯滴丸治療組肝細(xì)胞變性壞死較模型組明顯降低,且甘草硒多糖高劑量組干預(yù)治療效果明顯與聯(lián)苯雙酯滴丸組相當(dāng),結(jié)果見圖2。

3 結(jié)論與討論

3.1 甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷血清中酶及蛋白含量的影響

甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用通過血清中各項(xiàng)指標(biāo)TP、ALB、ALT、AST、ALP、γ-GT的變化來表征。肝損傷時(shí)體內(nèi)會(huì)大量釋放ALT、AST,導(dǎo)致兩種轉(zhuǎn)氨酶在小鼠體內(nèi)含量大幅度提高。根據(jù)表1數(shù)據(jù),模型組ALT、AST含量比空白組有顯著增高,表明肝損傷模型造模成功,與前人研究結(jié)果一致[9]。甘草硒多糖高、中、低劑量治療組血清中ALT、AST含量明顯低于模型組?？赡苁歉什菸嗵怯锌棺杂苫饔?從而降低毒性藥物CCl4引發(fā)的自由基大量釋放所致ALT、AST含量升高,其中以高劑量組治療效果最佳。

3.2 甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷肝組織中MDA及GSH-Px含量的影響

MDA和GSH-Px的測(cè)定是治療藥物是否有清除氧自由基,抑制脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)。肝組織中MDA的含量間接反應(yīng)肝細(xì)胞損傷的程度[10]。MDA明顯升高與GSH-Px降低,這兩個(gè)指標(biāo)的變化說明通過加速氧化和自由基的增加,導(dǎo)致大量自由基代謝產(chǎn)物聚集,增加肝細(xì)胞的損傷[11-12]。根據(jù)表2可得知,甘草硒多糖對(duì)CCl4所致肝損傷小鼠MDA的含量明顯降低,高劑量組使GSH-Px含量明顯增加。可推斷出甘草硒多糖可通過清除自由基,降低脂質(zhì)過氧化,達(dá)到治療肝損傷的作用。

3.3 甘草硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷病理切片的影響

通過肝組織HE染色顯示,正常組小鼠肝細(xì)胞束排列整齊,模型組肝細(xì)胞空泡變性,細(xì)胞基本被破壞,主要原因是CCl4造模導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜被破壞,組織液流出。甘草硒多糖、聯(lián)苯雙酯滴丸治療組肝細(xì)胞變性壞死較模型組有改善,甘草硒多糖低劑量治療組效果不明顯,有較多細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞質(zhì)流出,治療效果不佳;中劑量組織切片可觀察到較多細(xì)胞核,細(xì)胞破裂現(xiàn)象減少;高劑量組效果最佳與聯(lián)苯雙酯滴丸組療效相當(dāng),可清晰觀察到細(xì)胞核,細(xì)胞組織完好。

經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)可知甘草硒多糖對(duì)CCl4所致肝損傷有防治作用,且治療效果與用藥濃度成正比,治療效果甘草硒多糖高劑量組>甘草硒多糖中劑量組>甘草硒多糖低劑量組。在中藥越來越現(xiàn)代化和國際化的大好形勢(shì)下,希望通過此實(shí)驗(yàn)為中藥資源利用和新藥研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社,1998:169.

[2]汲晨鋒,姜薇,王曉晶.甘草多糖的化學(xué)與藥理研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2004(5):515-518.

[3]Tianshui Niu,Jianshe Yang,Long Zhang,et al. Research Advances on Anticancer Effect of Licorice [J].Current Bioactive Compounds,2009(5):234-242.

[4]楊宏斌,溫潔,溫偉業(yè).中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞抗氧化作用及生長(zhǎng)性能的影響[J].中國獸醫(yī)雜志,2008(3):44-45.

[5]張國雄.淺談硒元素在人體中的作用[J].鄂州大學(xué)學(xué)報(bào),2005,12(6):67-69.

[6]和水祥,萇新明,李紅霞,等.補(bǔ)硒治療慢性肝病患者PBMC功能紊亂的臨床價(jià)值[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2003,24(6):621-623.

[7]Cao Y,Ikeda I. Antioxidant activity and antitumor activity(invitro)of xyloglucan selenious ester and sulfated xyloglucan [J].Int J Biol Macromol,2009,45(3):231-235.

[8]滕楊,谷娜,羅時(shí)旋,等.山藥硒多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J]食品工業(yè)技,2015,36(15):362-364.

[9]宋正己,楊晉輝.實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型的建立和研究發(fā)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2004,10(5):278-280.

[10]Dong D,Nelson Y m,L W,et al. Adsorption of Pb and Cd onto metal oxides and organic material in natural surface coating as determinded by selective extractions:new evidence for the importance of Mn and Fe oxides [J].Water Tes,2000,34(2):427-436.

[11]張明華,陳虹,李靈芝.五味子甲素和五味子醇對(duì)四氯化碳所致肝臟損傷的保護(hù)作用[J].武警醫(yī)學(xué),2002,13(7):395-396.

[12]羅時(shí)旋,趙稷,滕楊,等.代謝組學(xué)法考察金銀花醇提物對(duì)模型小鼠肝損傷的預(yù)防作用[J].中國藥房,2016,25(22):3109-3111.

Effect of glycyrrhiza selenium polysaccharide on CCl4-induced injury in mice

TENG Yang1,2,WANG Yi-nan2,LIU Bing-xue2,GENG Yu-ting2,LI Yong-ji1,*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective:To investigate the effect of glycyrrhiza selenium polysaccharide on acute liver injury induced by CCl4in mice. Methods:TP,ALB,ALT,AST,ALP,γ-GT levels in serum and GPX,MDA levels in liver tissues were examined. In addition,pathologic changes were examined by HE staining. Results:Glycyrrhiza selenium polysaccharide of middle and high dose can reduce the degrees of AST(p<0.05),ALP(p<0.05)in serum and MDA and GSH-Px(p<0.05)levels in liver tissue,and the ALT level in serum were decreased in high dose group,which can improve CCl4-induced pathological tissue damage. Conclusion:This study confirms licorice selenium polysaccharide on CCl4-induced acute liver injury has protective effect,the mechanism is likely to be reached by scavenging free radicals and prevent liver damage.

glycyrrhiza selenium polysaccharide;carbon tetrachloride;acute liver injury

2017-02-14

滕楊(1982-),女,在讀博士,講師,主要從事中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾及靶向遞藥系統(tǒng)研究,E-mail:tengyang19820405@163. com。

*通訊作者:李永吉(1957-),男,博士,教授,研究方向:中藥藥劑學(xué)研究,E-mail:liyongji2009@163.com。

佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目(sq2014-030)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0311-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.058