豬丁型冠狀病毒熒光定量RT-PCR與S1蛋白間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用

王經(jīng)緯，雷喜梅，覃盼，趙鵬偉，王斌，王逸雯，李懿婷，金顥蕊，李龍，黃耀偉

1 浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江 杭州 310058 2 杭州貝爾塔生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310004

豬丁型冠狀病毒熒光定量RT-PCR與S1蛋白間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用

王經(jīng)緯1，雷喜梅1，覃盼1，趙鵬偉1，王斌1，王逸雯1，李懿婷1，金顥蕊1，李龍2，黃耀偉1

1 浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江 杭州 310058 2 杭州貝爾塔生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310004

王經(jīng)緯, 雷喜梅, 覃盼, 等. 豬丁型冠狀病毒熒光定量RT-PCR與S1蛋白間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào),2017, 33(8): 1265-1275.

Wang JW, Lei XM, Qin P, et al. Development and application of real-time RT-PCR and S1 protein-based indirect ELISA for porcine deltacoronavirus. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1265-1275.

最近，新發(fā)現(xiàn)的豬丁型冠狀病毒 (Porcine deltacoronavirus，PDCoV) 可導(dǎo)致仔豬腹瀉，亟待建立有效準(zhǔn)確的核酸及血清學(xué)檢測方法并調(diào)查豬場的 PDCoV感染情況。本研究采用針對病毒 M基因的探針熒光定量RT-PCR檢測方法，對2014-2015年間收集的河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龍江、江蘇、山東和上海等10個(gè)省市收集的共254份腹瀉仔豬小腸勻漿或糞便樣本進(jìn)行檢測，共檢出11份PDCoV陽性樣本，總陽性率為4.33%。采用在昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化的PDCoV囊膜S1蛋白為包被抗原，建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 方法，檢測2015-2016年間收集的來自江蘇、湖南、浙江等7個(gè)省份的609份具有腹瀉癥狀的豬血清樣品，抗PDCoV S1抗體檢出率為44.17% (269/609)。上述建立的兩種方法分別針對病毒的RNA或抗體對PDCoV進(jìn)行特異性檢測，可以應(yīng)用于PDCoV流行情況的監(jiān)控。

豬丁型冠狀病毒，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，間接ELISA，S1基因

丁型冠狀病毒 (Deltacoronavirus) 屬冠狀病毒科 (Coronaviridae) 冠狀病毒亞科(Coronavirinae)，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類冠狀病毒[1]，能夠感染鳥類和哺乳動(dòng)物。2009年，中國香港學(xué)者首次從豬的直腸拭子中分離到豬丁型冠狀病毒 (Porcine deltacoronavirus, PDCoV)。2014年，美國俄亥俄州出現(xiàn)PDCoV疫情。通過分析得到的PDCoV基因組序列發(fā)現(xiàn)美國俄亥俄州分離的毒株與中國香港發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)HKU15毒株序列相似度高達(dá)99%[2]。隨后美國其他17個(gè)州相繼報(bào)道了PDCoV的存在。2014年，韓國首次在本土發(fā)現(xiàn)了 PDCoV毒株 KOR/KNU14-04/2014并進(jìn)行了全長測序[3]。2015年9月，Song等以及本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了我國內(nèi)地發(fā)現(xiàn)的PDCoV/CHJXNI2/2015和CH/Sichuan/S27/2012毒株全長序列[4-5]。2015年10月，Chen等公布了CH/SXD1/2015的全長序列[6]，Dong等也公布了3株中國毒株全長序列并進(jìn)行了進(jìn)化分析[7]。值得注意的是，Dong等分離到 CHN-AH-2004毒株的樣本采集于2004年，說明PDCoV在我國的存在可能早于2004年，限于之前技術(shù)條件或者認(rèn)知局限而未能發(fā)現(xiàn)。此后，世界范圍內(nèi)不同國家和地區(qū)都有關(guān)于PDCoV的報(bào)道[8-12]。PDCoV能感染各年齡段的豬群，引起與豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎相似的腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀[13-14]。PDCoV基因組結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒類似，全長約為 25.4 kb，從 5′-3′端依次編碼復(fù)制酶ORF1ab、S糖蛋白 (S)、小分子膜蛋白 (E)、膜蛋白 (M) 以及核衣殼蛋白 (N)[15-16]。

目前，PDCoV受到各國學(xué)者的廣泛關(guān)注，研究多集中于新分離PDCoV毒株基因組序列及其基因功能研究，也有少數(shù)針對部分地區(qū)PDCoV流行病學(xué)檢測的報(bào)道。Marthaler等先后嘗試針對ORF1、S、M基因設(shè)計(jì)引物采用熒光定量RT-PCR (qRT-PCR) 對美國不同州的近300份腹瀉糞樣和疫病豬場飼料及環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，基于M基因建立的檢測方法效果最好，利用該方法檢測出的 PDCoV陽性率高達(dá)30%[17]。Song等建立了針對PDCoV N基因的套式PCR檢測方法，并對2012年11月到2015年3月從我國江西省采集的356份腹瀉豬樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn) PDCoV感染率達(dá) 33.71%，與豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) 共感染率為19.66%[4]。Chen等對湖北、廣東、山西等省6個(gè)豬場收集的64份腹瀉豬糞便和小腸樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，檢出樣品PDCoV陽性率達(dá)23.4%[6]。血清學(xué)檢測方面，Thachil與本文通訊作者等合作建立了以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的截短S蛋白 (S1)為檢測抗原的間接ELISA方法，對美國范圍內(nèi)的968份豬血清樣本進(jìn)行檢測，PDCoV抗體檢出率為8.7%[18]。Su等建立了以N蛋白為包被抗原的間接ELISA方法，并對黑龍江地區(qū)319份腹瀉豬血清樣品進(jìn)行檢測，其中 37份樣品PDCoV抗體陽性[19]。

本研究優(yōu)化了一步法qRT-PCR檢測方法及以PDCoV S1蛋白為包被抗原的間接ELISA方法，并對來自我國多個(gè)省份的病料進(jìn)行檢測，初步掌握了豬群中PDCoV感染和流行情況，為PDCoV的診斷和防控提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

小腸、糞便及血清樣本由本實(shí)驗(yàn)室從江蘇、湖南、河南、浙江、江西、河北、安徽、黑龍江、山東和上海 10個(gè)省份收集。TRIzol、SuperScript?Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；Q5高保真酶購自NEB公司；核酸電泳凝膠回收試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；T7 High Efficiency Transcription Kit、TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒購自北京全式金公司；引物及探針由華大基因生物工程有限公司合成；羊抗豬 IgG-Fc-HRP抗體購自Abcam公司；TMB單組分顯色液購自北京索萊寶公司，脫脂奶粉為國產(chǎn)分析純；豬流行性腹瀉病毒 ELISA試劑盒、豬傳染性胃腸炎病毒ELISA試劑盒 (內(nèi)含PEDV和TGEV的陽性標(biāo)準(zhǔn)血清用作以下 ELISA實(shí)驗(yàn)) 購自上海繁旌生物科技有限公司。

1.2 qRT-PCR檢測方法的建立

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

優(yōu)化了 Marthaler等針對 M 基因設(shè)計(jì)的qRT-PCR檢測引物和探針，交由華大基因生物有限公司合成。所設(shè)計(jì)的特異性引物為：SDCV-M-F：5′-ATCGACCACATGCGCTCAA-3′，SDCV-M-R ： 5′-CAGCTCTTGCCCATGATCGT C-3′；探針為 SDCV–M-PROBE：FAM-5′-CAC ACCAGTCGTTAAGCATGCGAGATT-3′-TAMRA。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

設(shè)計(jì)一對引物：PDCoV-TEMPLE-T7-F：5′-TAATACGACTCACTATAGGG ATGTCTGACG CAGAAGAGTG-3′； PDCoV-TEMPLE-T7-R ：5′-CTACGCTGCTGATT CCTGC-3′ (下劃線區(qū)為T7啟動(dòng)子序列)，在正向引物的5′端引入T7啟動(dòng)子序列，用于擴(kuò)增體外轉(zhuǎn)錄模板。從全長PDCoV cDNA擴(kuò)增出含 M 基因的目的片段(1 988 bp) 作為體外轉(zhuǎn)錄模板。采用全式金T7 High Efficiency Transcription Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后經(jīng) DNaseⅠ作用 15 min去除DNA模板后TRIzol法純化體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并經(jīng)過核酸凝膠電泳驗(yàn)證體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果。采用體外轉(zhuǎn)錄的方法將模板體外轉(zhuǎn)錄成RNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品，測量濃度后分裝保存。將驗(yàn)證正確的RNA模板進(jìn)行 10倍梯度稀釋，采用全式金TransScript Probe One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，以DNA拷貝循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)、以 Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)設(shè)置陰性對照。

1.2.3 臨床樣本檢測

對我國江蘇、湖南和浙江等 10個(gè)省份2014-2015年間收集的 254份小腸或糞便樣本進(jìn)行研磨，重懸后離心，提取上清液核酸后，應(yīng)用建立的qRT-PCR方法對其進(jìn)行檢測。

1.3 間接ELISA檢測方法建立

1.3.1 PDCoV S1蛋白表達(dá)和純化

通過PCR擴(kuò)增截短的S1基因 (aa1-571)，并在S1基因后加上His tag序列以便于后續(xù)純化工作。將重組基因克隆到pFast-Bac載體上，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)化至 DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得重組的桿狀病毒，繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，得到高滴度P2代病毒 (108TCID50/mL)，再感染Sf9細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞上清。用Ni-NTA層析柱純化S1重組蛋白，利用SDS-PAGE和Western blotting檢驗(yàn)純化效果。

1.3.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用棋盤滴定法，倍比稀釋抗原和抗體，以確定最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度以及二抗稀釋度。用碳酸鹽包被緩沖液 (pH 9.6)2倍梯度稀釋S1蛋白，然后包被不同稀釋度的S1蛋白，4 ℃包被過夜，每孔用300 μL PBST洗滌緩沖液 (0.01 mol/L PBS，0.05% Tween-20，pH 7.4) 洗滌3次后再用PBST配制的5%脫脂乳37 ℃封閉2 h。將PDCoV陽性豬血清按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 稀釋后每孔加入100 μL，每組6個(gè)重復(fù)，并在37 ℃下孵育 1 h。PBST洗滌緩沖液洗滌 3次。將按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶10 000等6個(gè)梯度稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG以100 μL/孔的量分別加入上述孔中，37 ℃下孵育30 min。PBST洗滌緩沖液洗滌3次。向每個(gè)孔加入100 μL TMB單組分顯色液，并于室溫孵育15 min。通過加入50 μL/孔的2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，OD450讀數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次以確定最佳反應(yīng)條件。研究中陽性血清樣本由本實(shí)驗(yàn)室之前利用 Western blotting方法[20]篩選確定，陰性血清是本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)參考文獻(xiàn)[18]中已經(jīng)確定的PDCoV陰性血清作為標(biāo)準(zhǔn)對照，采用上述間接ELISA方法篩選得到。

1.3.3 臨床樣品的檢測

應(yīng)用建立的ELISA檢測方法，對收集自江蘇、湖南、江西、河南、浙江、黑龍江和山東等地的 609份表現(xiàn)腹瀉癥狀的豬血清樣品進(jìn)行檢測，用本實(shí)驗(yàn)室保存的已確定PDCoV陽性和陰性血清作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 qRT- PCR檢測方法的建立

體外轉(zhuǎn)錄得到的 RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為40.72 ng/μL，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取6個(gè)稀釋梯度，進(jìn)行qRT-PCR。擴(kuò)增曲線 (圖1) 顯示，不同稀釋度的擴(kuò)增曲線之間間距均勻。相關(guān)系數(shù)R2=0.998表明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有優(yōu)良的線性關(guān)系；擴(kuò)增效率為 87.3% (圖 2)。繼續(xù)將 RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，最后獲得最低檢測濃度為 4.07×10–8ng/μL，即最低檢測拷貝數(shù)為1.12×101GE (Genome Equivalent) /μL。陰性對照組和PEDV、TGEV陽性樣品均未獲得陽性信號(hào)(文中未顯示)，說明該 qRT-PCR檢測方法特異性好。同時(shí)進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品的組間變異系數(shù)為0.20%-0.70%，組間變異系數(shù)為0.30%-0.93%。將qRT-PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示為預(yù)期擴(kuò)增的PDCoV M基因特異性目的片段 (72 bp)，說明所建立的qRT-PCR檢測方法可靠、準(zhǔn)確。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線Fig. 1 The kinetic curve of the standard samples.

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve of the standard samples.

2.2 臨床樣本檢測結(jié)果

對來自河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龍江、江蘇、山東和上海10個(gè)省份總共254份小腸或糞便樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，共檢出了 11份 PDCoV陽性樣本 (其中糞便樣本 7份，小腸樣本 4份)，總陽性率為4.33%。從樣本來源來看，如表2所示，檢測結(jié)果呈陽性的樣品主要來自湖南和江蘇，其中湖南 4份和江蘇7份，且全部為保育豬樣品。陽性樣本Ct值范圍在22±5之間，病毒拷貝數(shù)范圍在 2.81×103-1.48×106GE/μL 之間。同時(shí)對這11份陽性樣本進(jìn)行PEDV檢測，結(jié)果如表3所示，發(fā)現(xiàn)共有8份樣本PEDV陽性，陽性率高達(dá)72.73%。

表1 病料樣本中PDCoV RNA檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Results of PDCoV RNA detected in specimen

表2 病料樣本來源Table 2 The sources of the clinical specimens

表3 PDCoV RNA陽性樣本中PEDV RNA檢測為陽性的樣本信息Table 3 Information about the PDCoV RNA positive specimen samples which are also positive of PEDV RNA

2.3 PDCoV S1蛋白表達(dá)與純化

將測序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞，獲得重組的桿狀病毒，用高滴度的 P2病毒再感染Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，對細(xì)胞上清進(jìn)行Ni+柱親和層析純化，得到較純的PDCoV S1蛋白；圖 3B是用抗 His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western blotting分析，可以檢測到單一的、分子量與蛋白電泳一致的條帶；圖 3C是用PDCoV陽性血清和陰性血清作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，陽性血清對照組同樣可以檢測到相應(yīng)的條帶，而陰性血清對照組則無條帶 (有部分非特異性反應(yīng))，ZS是含空載體的重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白作為樣品，PDCoV陽性血清作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，無條帶顯示。利用BCA蛋白試劑盒測得蛋白濃度為0.41 mg/mL。

圖3 重組S1蛋白純化結(jié)果與Western blotting檢測結(jié)果Fig. 3 Purification and identification of the recombinant S1 protein expressed in insect cells. (A)SDS-PAGE result of the purified recombinant S1 protein. (B) Detection of purified recombinant S1 using anti-His antibody by Western blotting. (C) Detection of purified recombinant S1 using PDCoV positive serum by Western blotting. M: protein marker (25-100 kDa);S1: purified recombinant S1 protein; Neg: the negative control (normal cell lysates); T: supernatants of infected-cell lysates; PS: the positive control (PDCoV positive serum); NS: the negative control (PDCoV negative serum); ZS: the negative control (The Bacmid without S1 sequences).

2.4 間接ELISA方法的建立及臨床樣本檢測

通過棋盤滴定測定抗原的最佳包被量為1.25 ng/孔，通過使用1∶100稀釋的血清樣品和1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗豬IgG能獲得最佳ELISA結(jié)果。應(yīng)用上述確定的最佳條件檢測72份PDCoV抗體陰性血清樣品。經(jīng)生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析為0.133，s為0.078，則臨界值為+3s=0.367，即OD450≥0.367判定為陽性。同時(shí)，確定可疑區(qū)間+s=0.211，即當(dāng)OD450值在0.211和0.367之間為疑似陽性，需重測；當(dāng)重測值仍大于0.211時(shí)判為陽性，否則為陰性。本實(shí)驗(yàn)室合作者Thachil已證實(shí)，PDCoV S1蛋白與PEDV、TGEV等病毒無交叉反應(yīng)性；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室利用購買檢測豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的ELISA試劑盒內(nèi)含的PEDV和TGEV陽性標(biāo)準(zhǔn)血清作為檢測一抗檢測S1蛋白的交叉反應(yīng)性，結(jié)果OD450均小于0.1，說明S1蛋白與PEDV和TGEV無交叉反應(yīng)性。對所建立的間接ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn)，當(dāng)血清稀釋至 3 200倍時(shí)，顯色后根據(jù)酶標(biāo)儀讀數(shù)OD450=0.371，判定仍為陽性，證明所建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性。進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，批內(nèi)變異系數(shù)為1.46%-4.91%，批間變異系數(shù)為2.01%-5.80%，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，表明本研究建立的間接 ELISA檢測方法具有較好的重復(fù)性。分別比對用昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的S1蛋白作為包被抗原一對一隨機(jī)檢測53份臨床血清樣品，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示相關(guān)性較高 (R2=0.9415)，說明本研究建立的間接ELISA方法與前面建立的標(biāo)準(zhǔn)方法精準(zhǔn)一致(結(jié)果未顯示)，可靠性較高。本實(shí)驗(yàn)室利用建立的間接ELISA方法對全國7個(gè)省份收集的609份不同日齡的表現(xiàn)腹瀉癥狀的豬血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示，共檢出269份PDCoV陽性血清，陽性率為44.17%。如圖4所示，經(jīng)產(chǎn)母豬血清中PDCoV抗體水平高于后備母豬；仔豬出生后1-3周齡，血清PDCoV抗體水平逐漸降低，3周齡豬血清樣品 OD450平均值為0.206±0.229達(dá)到最低，這可能與仔豬體內(nèi)母源抗體衰減有關(guān)。到5周齡時(shí)，豬血清樣品OD450平均值為1.129±0.520達(dá)到最高，表明出生后仔豬感染 PDCoV產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，PDCoV抗體水平達(dá)到峰值，隨后回復(fù)均值，趨于穩(wěn)定。

表4 各年齡豬中 抗PDCoV抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical data of anti-PDCoV antibodies from pigs of different ages

圖4 不同年齡豬血清抗PDCoV抗體的分布情況Fig. 4 Distribution of serum anti-PDCoV antibodies obtained from pigs of different ages. The purified PDCoV S1 protein was used as the coating antigen and the indirect ELISA method was used to detect the OD450of 609 specific antibodies in porcine sera of different ages, the dotted line represents the cut-off value of ELISA. The graph was generated by GraphPad software. The solid line is the average of the OD450values for pigs of the same age.

3 討論

仔豬腹瀉一直是困擾我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，對于引起仔豬腹瀉病原體的研究一直是一大熱點(diǎn)。之前的研究認(rèn)為，引起豬腹瀉主要的致病原是PEDV、TGEV以及其他細(xì)菌性病原體。但是很多已經(jīng)進(jìn)行上述病原疫苗免疫的豬場依然發(fā)生大規(guī)模仔豬腹瀉。因此，很多專家學(xué)者認(rèn)為，還有其他的未知病原單獨(dú)感染或與上述病原共感染導(dǎo)致仔豬腹瀉，PDCoV的發(fā)現(xiàn)也印證了這個(gè)猜測。研究發(fā)現(xiàn)，PDCoV引起的仔豬臨床癥狀與PEDV、TGEV等病原相似，并且PDCoV常常與PEDV共感染，因此人們常忽視PDCoV的存在及危害。而目前已有的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，PDCoV的流行范圍比較廣，對養(yǎng)殖行業(yè)的威脅不容忽視，而目前尚未有成熟的檢測方法用于檢測樣本中的病毒和抗體，因此從核酸水平以及抗體水平建立高效、靈敏的檢測方法對于監(jiān)視和預(yù)防該病的傳播和流行有著十分重要的意義。

本研究中優(yōu)化的一步法qRT-PCR檢測方法具有高靈敏、高特異性等特點(diǎn)，并且實(shí)驗(yàn)步驟簡潔，從而減少了實(shí)驗(yàn)操作污染的可能性[21-22]。本研究選用PEDV、TGEV陽性樣品進(jìn)行交叉檢測，未發(fā)現(xiàn)起峰，說明本檢測方法特異性較好。本實(shí)驗(yàn)室之前已建立了普通RT-PCR檢測方法，相對于本研究建立的qRT-PCR方法，檢測結(jié)果大致相符，但該方法檢測靈敏度很低，難以檢出微量病毒的存在，同時(shí)操作步驟繁瑣，耗時(shí)長，加大了樣本污染的可能性。

相較Chen等[6]23.4%和Song等[4]33.71%的糞拭子或腸道樣品PDCoV陽性檢出率，本實(shí)驗(yàn)室的PDCoV檢出率約為4.44%，多見于同一豬場，且檢出該病毒的城市大多集中在南方地區(qū) (江蘇和四川)，這可能與該病毒的生存條件和傳播途徑有關(guān)。此外，統(tǒng)計(jì)樣本量不夠大，樣品采集的豬場養(yǎng)殖管理和衛(wèi)生條件狀況不同等因素也影響了檢出率。從檢出的陽性病料中，本實(shí)驗(yàn)室成功克隆了1株P(guān)DCoV的全長基因組[5]。另一個(gè)值得注意的是，本次檢出PDCoV陽性的樣本中，高達(dá)72.73%的樣本PEDV檢測同樣陽性，說明這些豬只同時(shí)感染了PEDV和PDCoV，即PDCoV與其他病毒共感染現(xiàn)象比較普遍。

目前僅有少數(shù)關(guān)于豬血清中PDCoV抗體的血清學(xué)檢測方法的報(bào)道。Su等利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PDCoV N蛋白作為包被蛋白檢測血清中抗體水平[19]；本實(shí)驗(yàn)室建立的間接 ELISA檢測方法是以PDCoV S蛋白的截短部分S1作為包被抗原。S蛋白位于病毒粒子表面[23]，介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞，含有主要的中和性抗原表位[24]，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大量針對S蛋白抗原表位的抗體，同時(shí)PDCoV S蛋白具有比較高的序列保守性和相較其他冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性[25]，因此本實(shí)驗(yàn)室建立的間接ELISA檢測方法能夠更靈敏更特異性地檢測豬血清中的 PDCoV抗體水平。Ma等則建立了以PDCoV全病毒為包被抗原的間接 ELISA[26]，全病毒的純度直接影響了檢測結(jié)果的可靠性，而PDCoV病毒粒子純化的操作要求和費(fèi)用均較高，該檢測方法的敏感性和特異性并沒有得到證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)室合作者Thachil等首次建立了基于截短S1蛋白的間接ELISA檢測方法，但其S1蛋白是通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，相對于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)步驟復(fù)雜、成本高。昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能高水平分泌表達(dá)外源基因，表達(dá)的重組蛋白具有較高的生物學(xué)活性，且易分離純化。本實(shí)驗(yàn)室參照Thachil等報(bào)道的S1蛋白序列截取方案，S1基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得高滴度的重組桿狀病毒，再感染Sf9細(xì)胞，對目的蛋白進(jìn)行純化，分別用抗His標(biāo)簽的抗體和PDCoV陽性血清2種檢測抗體對其進(jìn)行 Western blotting，可以檢測到單一的、分子量與蛋白電泳一致的條帶，而PDCoV陰性血清對照組則無條帶。使用空載體的重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白作為陰性對照，PDCoV陽性血清作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，無條帶顯示，說明本研究表達(dá)的 PDCoV S1蛋白是正確無誤的，可用于后續(xù)研究。

本實(shí)驗(yàn)室檢測的609份樣品來自于我國7個(gè)省份，包含不同日齡的豬，覆蓋面較廣。其中269份血清樣品血清學(xué)檢測呈陽性，陽性率為44.17%。Thachil等報(bào)道968份美國血清樣本檢出PDCoV抗體陽性率為8.7%[18]。Su等對黑龍江省收集的319份血清樣品進(jìn)行檢測，陽性率為11.59%[19]。這可能與采樣的區(qū)域有關(guān)，南方區(qū)域相較北方的外界環(huán)境更有利于病毒的傳播。

當(dāng)前，國內(nèi)對PDCoV感染后刺激宿主抗體特異性免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體水平監(jiān)測的報(bào)道相對較少。Hu等報(bào)道了感染PDCoV的豬血清中PDCoV特異性抗體產(chǎn)生的時(shí)間及趨勢[27]，該研究使用細(xì)胞傳代的PDCoV人工感染仔豬，不能準(zhǔn)確反映臨床感染PDCoV的豬只特異性抗體消長規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)室采用建立的間接ELISA檢測方法檢測全國各省豬場的臨床血清樣品。仔豬出生后，隨著日齡增長，仔豬血清的抗體水平呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，到 3周齡時(shí)，抗體水平消減到最低并趨于穩(wěn)定。一般來說，母源IgG抗體能夠通過胎盤使初生仔豬獲得較高的抗PDCoV的母源抗體，隨后母源抗體水平逐漸降低。此后，若仔豬再次感染PDCoV，其機(jī)體免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生大量PDCoV抗體。本研究檢測結(jié)果顯示，5周齡豬只抗體水平迅速上升，超過平均抗體水平，達(dá)到最高。這可能由于豬只在此前已感染PDCoV，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生大量特異性抗體。隨后抗體水平再次逐漸降低穩(wěn)定在平均水平伴隨終生。各個(gè)階段樣品陽性率以及平均 OD450值顯示，PDCoV在各地豬場廣泛流行。本試驗(yàn)結(jié)果反映了養(yǎng)殖場豬群PDCoV抗體情況和動(dòng)態(tài)變化，但是更準(zhǔn)確的相關(guān)性關(guān)系還需要通過檢測更長時(shí)間段內(nèi)更多豬場的樣本才能確定。

本研究優(yōu)化了核酸水平的 PDCoV檢測方法，建立了PDCoV血清學(xué)的檢測方法，并對國內(nèi)多個(gè)省份的豬場PDCoV流行情況進(jìn)行了初步調(diào)查分析，為PDCoV的監(jiān)測和防控打下基礎(chǔ)。

REFERENCES:

[1] Woo PC, Lau SK, Lam CS, et al. Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of alphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus. J Virol,2012, 86(7): 3995–4008.

[2] Wang L, Byrum B, Zhang Y. Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs, Ohio, USA, 2014. Emerg Infect Dis, 2014,20(7): 1227–1230.

[4] Song D, Zhou X, Peng Q, et al. Newly emerged porcine deltacoronavirus associated with diarrhoea in swine in China: identification,prevalence and full-length genome sequence analysis. Transbound Emerg Dis, 2015, 62(6):575–580.

[5] Wang YW, Yue H, Fang WH, et al. Complete genome sequence of porcine deltacoronavirus strain CH/Sichuan/S27/2012 from mainland China.Genome Announc, 2015, 3(5): e00945–15.

[6] Chen FZ, Zhu YX, Wu MZ, et al. Full-Length genome characterization of Chinese porcine deltacoronavirus strain CH/SXD1/2015. Genome Announc, 2015, 3(5): e01284–15.

[7] Dong BQ, Liu W, Fan XH, et al. Detection of a novel and highly divergent coronavirus from Asian leopard cats and Chinese ferret badgers in Southern China. J Virol, 2007, 81(13):6920–6926.

文獻(xiàn)[6]中的Dirichlet過程即為DP(α,P0),α為正實(shí)數(shù),記F0(x)=P0{X ≤x}是先驗(yàn)過程的期望(均值函數(shù)).則在樣本為x1,x2,···,xn時(shí),F(x)的貝葉斯估計(jì)為

[8] Curry SM, Gibson KA, Burrough ER, et al.Nursery pig growth performance and tissue accretion modulation due to porcine epidemic diarrhea virus or porcine deltacoronavirus challenge. J Anim Sci, 2017, 95(1): 173–181.

[9] Fang PX, Fang LR, Dong N, et al. Research advances in the porcine deltacoronavirus. Chin J Virol, 2016, 32(2): 243–248.

[10] Janetanakit T, Lumyai M, Bunpapong N, et al.Porcine deltacoronavirus, Thailand, 2015. Emerg Infect Dis, 2016, 22(4): 757–759.

[11] Lee JH, Chung HC, Nguyen VG, et al. Detection and phylogenetic analysis of porcine deltacoronavirus in Korean swine farms, 2015.Transbound Emerg Dis, 2016, 63(3): 248–252.

[12] Lorsirigool A, Saeng-Chuto K, Temeeyasen G, et al. The first detection and full-length genome sequence of porcine deltacoronavirus isolated in Lao PDR. Arch Virol, 2016, 161(10): 2909–2911.

[13] Hu H, Jung K, Vlasova AN, et al. Isolation and characterization of porcine deltacoronavirus from pigs with diarrhea in the United States. J Clin Microbiol, 2015, 53(5): 1537–1548.

[14] Ma Y, Zhang Y, Liang X, et al. Origin, evolution,and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States. MBio, 2015, 6(2): e00064.

[15] Brian DA, Baric RS. Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol, 2005, 287: 1–30.

[16] Wang YW, Huang YW. A newly discovered coronavirus genus-deltacoronavirus. Chem Life,2016, 36(4): 514–518 (in Chinese).王逸雯, 黃耀偉. 新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒屬——丁型冠狀病毒. 生命的化學(xué), 2016, 36(4): 514–518.

[17] Marthaler D, Raymond L, Jiang Y, et al. Rapid detection, complete genome sequencing, and phylogenetic analysis of porcine deltacoronavirus.Emerg Infect Dis, 2014, 20(8): 1347–1350.

[18] Thachil A, Gerber PF, Xiao CT, et al.Development and application of an ELISA for the detection of porcine deltacoronavirus IgG antibodies. PLoS ONE, 2015, 10(4): e0124363.

[19] Su MJ, Li CQ, Guo DH, et al. A recombinant nucleocapsid protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against porcine deltacoronavirus. J Vet Med Sci, 2016,78(4): 601–606.

[20] Huang YW, Harrall KK, Dryman BA, et al.Serological profile of torque teno sus virus species 1 (TTSuV1) in pigs and antigenic relationships between two TTSuV1 genotypes (1a and 1b), between two species (TTSuV1 and-2),and between porcine and human anelloviruses. J Virol, 2012, 86(19): 10628–10639.

[21] Narayanan K, Huang C, Lokugamage K, et al.Severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp1 suppresses host gene expression, including that of type I interferon, in infected cells. J Virol,2008, 82(9): 4471–4479.

[22] Neuman BW, Joseph JS, Saikatendu KS, et al.Proteomics analysis unravels the functional repertoire of coronavirus nonstructural protein 3.J Virol, 2008, 82(11): 5279–5294.

[23] Heald-Sargent T, Gallagher T. Ready, set, fuse!The coronavirus spike protein and acquisition of fusion competence. Viruses, 2012, 4(4): 557–580.

[24] Yang JH, Lü J, Wang YY, et al. Replication of murine coronavirus requires multiple cysteines in the endodomain of spike protein. Virology, 2012,427(2): 98–106.

[25] Sun DB, Feng L, Shi HY, et al. Spike protein region (aa 636789) of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies. Acta Virol, 2007, 51(3): 149–156.

[26] Ma YM, Zhang Y, Liang XY, et al. Two-way antigenic cross-reactivity between porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus. Vet Microbiol, 2016, 186: 90–96.

[27] Hu H, Jung K, Vlasova AN, et al. Experimental infection of gnotobiotic pigs with the cell-culture-adapted porcine deltacoronavirus strain OH-FD22. Arch Virol, 2016, 161(12):3421–3434.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Development and application of real-time RT-PCR and S1 protein-based indirect ELISA for porcine deltacoronavirus

Jingwei Wang1, Ximei Lei1, Pan Qin1, Pengwei Zhao1, Bin Wang1, Yiwen Wang1, Yiting Li1,Haorui Jin1, Long Li2, and Yao-Wei Huang1

1 Institute of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058,Zhejiang, China 2 Hangzhou Belta-Biotechnology Co., Ltd., Hangzhou 310004, Zhejiang, China

Porcine deltacoronavirus (PDCoV) has been recently recognized as an emerging viral pathogen that causes diarrhea in newborn piglets. A total of 254 small intestinal or fecal samples collected from 10 provinces including Henan,Hunan, Zhejiang, Jiangxi, Anhui, Hebei, Heilongjiang, Jiangsu, Shandong and Shanghai between 2014 and 2015, were screened by quantitative RT-PCR targeting the viral M gene. Eleven PDCoV positive samples were identified with a total positive rate of 4.33%. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed based on the recombinant S1 protein of PDCoV. This assay was used to test 609 serum samples of pigs with diarrhea symptoms collected from 10 provinces between 2015 and 2016. The positive rate of PDCoV antibody was 44.17% (269/609). The two methods can be used to monitor the PDCoV epidemiology in the levels of PDCoV specific RNA or antibody, helping better prevent and control PDCoV.

porcine deltacoronavirus, real-time RT-PCR, indirect ELISA, S1 gene

March 25, 2017; Accepted: June 9, 2017

Yao-Wei Huang. Tel: +86-571-88982051; E-mail: yhuang@zju.edu.cn

Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0500102).

國家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃 (No. 2016YFD0500102) 資助。