膝眼穴針灸對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型以及PGC-1α信號(hào)通路的影響

苗巖松,徐卿榮,李 鶴,姚菊芳,董宇啟

·實(shí)驗(yàn)與臨床·

膝眼穴針灸對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型以及PGC-1α信號(hào)通路的影響

苗巖松,徐卿榮,李 鶴,姚菊芳,董宇啟

目的 研究膝眼穴針灸療法對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型改變及其參與線粒體生成氧自由基(ROS)的過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子1α(PGC-1α)信號(hào)通路變化的影響。方法 通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)膝眼穴針灸后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的主要特征分子指標(biāo) (col 1、col 2、aggrecan)以及 PGC-1α、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、解耦聯(lián)蛋白2(UCP 2)和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)因子的表達(dá)變化。進(jìn)一步檢測(cè)向大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ZN005L(PGC-1α激活劑)激活PGC-1α表達(dá)后大鼠軟骨細(xì)胞表型特征分子指標(biāo)的表達(dá)變化，以及軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的改變。結(jié)果 對(duì)大鼠進(jìn)行膝眼穴針灸后，PGC-1α表達(dá)增加；UCP 2以及軟骨細(xì)胞表型主要指標(biāo)aggrecan表達(dá)下降。激活PGC-1α表達(dá)后，軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量降低，并且軟骨細(xì)胞表型丟失現(xiàn)象被抑制。結(jié)論 膝眼穴針灸療法不能改善大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的功能，相反會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞表型特征分子的丟失，并損害軟骨細(xì)胞功能。

膝眼穴針灸;軟骨細(xì)胞表型;過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子1α；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A；解耦聯(lián)蛋白2

隨著人口老齡化的發(fā)展，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[1-2]。而改善軟骨細(xì)胞表型維持軟骨的正常功能，對(duì)降低骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有重要的影響。Col 1與col 2分別為Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原，正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞含有大量col 2及微量col 1，col 2對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起到防護(hù)支撐的作用。Aggrecan為聚集蛋白聚糖，其主要功能是作為結(jié)締組織的纖維成分，與膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成一個(gè)彈性體，承載壓力，傳導(dǎo)和緩沖應(yīng)力，起著保護(hù)軟骨的作用。軟骨細(xì)胞表型的丟失，主要表現(xiàn)為col 2和aggrecan表達(dá)下降以及col 1表達(dá)升高，并且向纖維細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變[3-5]，導(dǎo)致正常關(guān)節(jié)軟骨功能被破壞。中醫(yī)認(rèn)為通過膝關(guān)節(jié)相關(guān)穴位針刺療法可以使膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉松弛，促進(jìn)血液循環(huán)，進(jìn)而消除膝關(guān)節(jié)炎癥和水腫，使得膝關(guān)節(jié)粘連癥狀得以緩解[6]。在國(guó)外，針灸對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療方式也備受關(guān)注。如在德國(guó)約有30 000個(gè)臨床醫(yī)師應(yīng)用針灸療法緩解骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛感[7], 并且大量研究表明針灸治療骨關(guān)節(jié)炎起到了很好的效果[8]。然而針灸療法對(duì)軟骨細(xì)胞表型的具體影響并不明確。有研究推測(cè)，過氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子1α(PGC-1α)的表達(dá)下降導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)表達(dá)降低和線粒體功能損害是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要機(jī)制之一[9]。解耦聯(lián)蛋白(UCPs)是一類線粒體內(nèi)膜上的載體，屬于線粒體載體超家族，可以將H+從線粒體內(nèi)膜滲漏到線粒體基質(zhì)中，減少ATP的合成并產(chǎn)生熱能，即解耦聯(lián)作用。目前已知的UCP包括 UCP 1、UCP 2、UCP 3、UCP 4、UCP 5等。UCP 2從1997年發(fā)現(xiàn)至今其在代謝方面的作用仍處于研究之中，就目前的研究表明，UCP 2在線粒體質(zhì)子漏調(diào)節(jié)，減少線粒體氧自由基(ROS)產(chǎn)生，糖脂代謝方面都起到了一定的作用[10]。TFAM下游的UCP 2和NADPH氧化酶1/4(NOX 1/4)是細(xì)胞內(nèi)ROS生成的重要信號(hào)因子，而且ROS生成的增加會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型的丟失[11]。因此, 本研究通過對(duì)大鼠體內(nèi)膝眼穴針灸，期望明確針灸對(duì)軟骨細(xì)胞表型變化的影響，了解其參與線粒體生成ROS的PGC-1α信號(hào)通路的改變。

1 材料與方法

1.1 針灸動(dòng)物模型制作 選擇8只24周齡SD大鼠，無菌級(jí)，♀♂不限。每只大鼠隨機(jī)選擇一側(cè)膝關(guān)節(jié)作為對(duì)照組，另一側(cè)作為針灸組。向大鼠膝關(guān)節(jié)髕骨尖端左右兩側(cè)凹陷處進(jìn)針，每次進(jìn)針30 min，每10 min運(yùn)針1次，每周進(jìn)行2次針灸，持續(xù)4周。

1.2 PGC-1α激活模型制作 選擇8只24周齡SD大鼠，♀♂不限。每只大鼠隨機(jī)選擇一側(cè)膝關(guān)節(jié)注射DMSO 10μl作為對(duì)照組，另一側(cè)注射濃度為100 mmol/L的PGC-1α激活劑 ZN005L 10μl作為實(shí)驗(yàn)組。每周注射1次，持續(xù)4周。

1.3 免疫組化技術(shù) 將實(shí)驗(yàn)大鼠脊椎脫臼法處死后取膝關(guān)節(jié)軟骨。室溫下石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片放入 10 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)的電爐鍋內(nèi)，鍋內(nèi)的水沸騰開始計(jì)時(shí) 20 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后自然冷卻到室溫。山羊血清(1 ∶10)封閉非特異性染色，室溫孵育 15 min；然后分別加入一抗(兔抗鼠)col 1(1 ∶500)、col 2(1 ∶200)和aggrecan(1 ∶500)，4 ℃過夜；PBS 洗滌后加入二抗(羊抗兔，1 ∶1 000)，37 ℃孵育 20 min，再按試劑盒的說明書，鏈酶親合素-生物素- 酶復(fù)合物法處理，DAB 顯色，封片。熒光顯微鏡下拍照檢測(cè)。根據(jù)免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(染色細(xì)胞數(shù)百分比參考分值+染色強(qiáng)度參考分值)進(jìn)行評(píng)分。

表1 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng) 收獲SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨,并進(jìn)行胰蛋白酶/膠原酶消化分離軟骨細(xì)胞。用加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液 (Gibco),青霉素/鏈霉素 (0.1g/L) 和谷氨酰胺 (4.5 mmol) 的培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞流式技術(shù) 向培養(yǎng)基中加入ZN005L 100 mmol/L(對(duì)照組加入DMSO)作用24 h后消化并收獲細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至(1～10)×109/L，裝載探針：加入濃度為10 mmol/L的 DCFH-DA,37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5 h，每隔 3～5 min 混勻一下，使探針和細(xì)胞充分作用；用無血清的培養(yǎng)基或溫暖的PBS液洗滌細(xì)胞3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA；收獲各組細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS,激發(fā)光 488 nm,發(fā)射光 525 nm。

2 結(jié)果

2.1 針灸后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型部分指標(biāo)結(jié)果 與對(duì)照組比較，針灸組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞col 1(圖1A、B)和col 2(圖1C、D)的表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著變化；而aggrecan(圖1E、F)的表達(dá)量發(fā)生了下降的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1G。表明膝眼穴針灸療法對(duì)軟骨細(xì)胞表型并沒有促進(jìn)作用，反而使得軟骨細(xì)胞表型出現(xiàn)了丟失的現(xiàn)象。

2.2 針灸后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組比較，針灸組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)PGC-1α的表達(dá)顯著增高(圖2A、B)，而TFAM(圖2C、D)和UCP 2(圖3A、B)的表達(dá)發(fā)生了輕微的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2E、3G。然而NOX 1/4的表達(dá)并沒有出現(xiàn)變化(圖3C～F)。這表明，雖然膝眼穴針灸的干預(yù)使得PGC-1α的表達(dá)增加，但是PGC-1α并沒有提高線粒體的功能，反而促使TFAM的表達(dá)量降低，導(dǎo)致線粒體功能下降，同時(shí)UCP 2表達(dá)下降造成解耦聯(lián)作用也受到損害。

圖1 膝眼穴針灸后，軟骨細(xì)胞表型主要指標(biāo)aggrecan表達(dá)降低 Bar=100 μm，*P<0.05

圖2 膝眼穴針灸后PGC-1α表達(dá)升高，TFAM表達(dá)降低 Bar=100 μm,*P<0.05

2.3 激活PGC-1α的表達(dá)結(jié)果 向培養(yǎng)基內(nèi)加入ZN005L激活PGC-1α的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)， PGC-1α表達(dá)增加后軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量降低(圖4),并且col 1表達(dá)量降低，col 2和aggrecan表達(dá)量升高(圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明激活PGC-1α能夠通過降低軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量，進(jìn)而抑制了軟骨細(xì)胞丟失的現(xiàn)象。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，膝眼穴針灸干預(yù)并沒有保持軟骨細(xì)胞表型的作用，反而會(huì)促進(jìn)aggrecan表達(dá)的降低(圖1)。這說明膝眼穴針灸并未有效地改善軟骨細(xì)胞的功能，相反是破壞了軟骨細(xì)胞的功能。中醫(yī)理論中，針灸能夠緩解患者疼痛，促進(jìn)血液循環(huán)消除腫脹，這可能說明部分穴位針灸療法只能改善膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀，起到緩解的作用，但是并沒有從根本上使得軟骨細(xì)胞功能恢復(fù)到正常狀態(tài)。針灸療法能夠減弱疼痛感，消除腫脹感，但如果長(zhǎng)期、反復(fù)應(yīng)用針灸療法，骨關(guān)節(jié)炎的癥狀是否會(huì)進(jìn)一步得到改善還需要長(zhǎng)期的觀察與隨訪。

線粒體是ROS生成的主要細(xì)胞器。血管內(nèi)皮發(fā)育與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)學(xué)的相關(guān)研究表明，促進(jìn)PGC-1α的表達(dá)能夠降低ROS的生成量[12-13]。本研究結(jié)果顯示，激活PGC-1α的表達(dá)能夠降低軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成量，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞表型丟失現(xiàn)象(圖4、5)。然而膝眼穴針灸干預(yù)后TFAM與UCP 2的表達(dá)卻發(fā)生降低。這表明雖然針灸能夠促進(jìn)PGC-1α的表達(dá)，但同時(shí)也會(huì)使TFAM和UCP 2表達(dá)降低(圖2、3)。TFAM代表線粒體生物合成功能(如ATP的生成降低)，UCP 2能夠通過解偶聯(lián)作用降低ROS的生成量[14-15]。當(dāng)進(jìn)行針灸后TFAM表達(dá)量下降意味著線粒體的合成功能受損，UCP 2表達(dá)降低意味著線粒體解偶聯(lián)功能受損。而且有研究顯示，在膝骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)線粒體的功能也會(huì)發(fā)生下降。本研究中膝眼穴針灸干預(yù)促使軟骨表型部分指標(biāo)表達(dá)下降，這也許和針灸能夠?qū)е戮€粒體功能下降有一定的關(guān)系。

圖3 膝眼穴針灸后,UCP 2表達(dá)降低 Bar=100 μm,*P<0.05

圖4 激活PGC-1α的表達(dá)后，軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成量降低

圖5 激活PGC-1α的表達(dá)后軟骨細(xì)胞表型丟失現(xiàn)象被抑制 Bar=100 μm,*P<0.05

本次研究只探討了膝眼穴進(jìn)行針灸療法后對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，并沒有研究聯(lián)合其他穴位所產(chǎn)生的效果，由于動(dòng)物模型數(shù)量有限，選取的針灸模型為成年SD大鼠，如果選擇制作關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)行針灸實(shí)驗(yàn)，那么結(jié)果可能更加明顯并且意義更加深遠(yuǎn)。同時(shí)此實(shí)驗(yàn)缺少臨床實(shí)驗(yàn)與隨訪調(diào)查使得本次研究具有一定的局限性,這需要在今后進(jìn)一步完善。

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(接收日期：2017-06-03)

Effect of acupuncture for the knee point on chondrocyte phenotype and PGC-1α signal pathway in knee

MIAOYan-song,XUQing-rong,LIHe,YAOJu-fang,DONGYu-qi

(DeptofOrthopaedics,RenjiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To study the effects of acupuncture for the knee point on the change of chondrocyte phenotype and the peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1 alpha (PGC-1α) signaling pathway involved in mitochondrial oxygen free radical (ROS). Methods The main indicators(col 1，col 2，aggrecan) of chondrocyte phenotype of the rat knee cartilage, PGC-1α, mitochondrial transcriptional factor A (TFAM), uncoupling protein 2(UCP 2) and NADPH oxidase1/4(NOX 1/4) were detected by immunohistochemical technique afer the knee joints of the rats were acupuncture for the knee point. Moreover, after ZN005L was injected into the knee joint of the rat to activate the expression of PGC-1α，the changes of chondrocyte phenotype and ROS were detected. Results The up-regulation of PGC-1α could inhibit the loss of chondrocyte phenotype and reduced the production of ROS. Although acupuncture for the knee point could increase the expression of PGC-1α, it reduced the mitochondrial function and the effect of the coupling,and leaded to the loss of chondrocyte phenotype. Conclusions Acupunture therapy can not improve the function of chondrocytes, on the contrary, it can promote the loss of chondrocyte phenotype and destroy the function of the chondrocytes.

acupuncture for the knee point;chondrocyte phenotype; PGC-1α;TFAM;UCP 2

10.3969/j.issn.1008-0287.2017.04.046

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院骨科,上海 200127

苗巖松,男,碩士生,主要從事膝骨關(guān)節(jié)炎研究, E-mail:1104782332@qq.com; 徐卿榮,男,博士,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師,通訊作者,主要從事膝骨關(guān)節(jié)炎研究, E-mail:xuqingro@139.com

R 684.3

A

1008-0287(2017)04-0503-05