玉米大斑病菌環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表達分析

申珅, 李貞楊, 趙玉蘭, 李盼, 韓建民, 郝志敏, 董金皋

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玉米大斑病菌環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表達分析

申珅, 李貞楊, 趙玉蘭, 李盼, 韓建民, 郝志敏, 董金皋

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北保定071001）

【目的】獲得玉米大斑病菌（）環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶（cAMP phosphodiesterase, PDE）基因，并分析其在病菌侵染結(jié)構發(fā)育過程及侵染寄主早期階段中的表達，為深入探索cAMP信號途徑調(diào)控病菌致病性的作用機制打下基礎?！痉椒ā扛鶕?jù)釀酒酵母（）、白色念珠菌（）、灰霉病菌（）、稻瘟病菌（）、綠僵菌（）和黑曲霉（）6種真菌PDE基因的保守序列，利用簡并引物PCR對基因保守片段進行擴增，結(jié)合RACE和Genome Walking技術獲得基因全長及其側(cè)翼序列；利用MEGA 5.0軟件對PDE蛋白預測編碼產(chǎn)物進行多重序列比對，并采用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用GSDS分析基因結(jié)構，ProtParam分析理化性質(zhì)，SOMPA預測二級結(jié)構，SMART數(shù)據(jù)庫在線分析保守結(jié)構域；收集人造疏水介質(zhì)誘導下侵染結(jié)構發(fā)育不同時期以及侵染感病寄主葉片不同時間的玉米大斑病菌材料，利用qRT-PCR技術研究在病菌侵染結(jié)構形成過程中不同階段的轉(zhuǎn)錄水平?！窘Y(jié)果】玉米大斑病菌基因組中存在1個高親和力磷酸二酯酶基因（）和1個低親和力磷酸二酯酶基因（）。其中，全長3 208 bp，包含5個內(nèi)含子和6個外顯子，ORF為2 898 bp。全長5 054 bp，包含4個內(nèi)含子和5個外顯子，ORF為3 090 bp。和分別含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化結(jié)構域。不同的植物病原真菌中PDE同源基因分別呈現(xiàn)出高度的相似性，其中，與、、等病原真菌的高親和力磷酸二酯酶基因聚于同一進化支，與、、、等病原真菌的低親和力磷酸二酯酶基因聚于相同進化支。人造疏水介質(zhì)誘導下，與菌絲相比，和在分生孢子中的表達水平均顯著上調(diào)，其中和分別上調(diào)了約2倍和52倍。孢子萌發(fā)初期兩個基因表達水平顯著下調(diào)，隨著萌發(fā)的進行，表達水平緩慢回升，至附著胞形成階段，基因表達出現(xiàn)了第2次高峰，隨后表達水平再次下調(diào)。在整個過程中，的最高表達水平則出現(xiàn)在附著胞形成時期，達到了菌絲體中的近7倍、分生孢子中的近2倍，而的表達水平始終低于其在分生孢子中的表達水平。和在病菌侵染寄主過程中的表達水平變化趨勢與其在人工疏水介質(zhì)誘導下的表現(xiàn)基本一致。在孢子萌發(fā)早期表達顯著下調(diào)，隨著時間延長，緩慢回升，至接種后18和24 h表達水平上調(diào)，超過萌發(fā)初期?！窘Y(jié)論】在病菌侵染結(jié)構發(fā)育過程中，和均呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的表達水平變化趨勢。在附著胞時期表達水平最高，在分生孢子中的相對表達水平最高。

玉米大斑病菌; 環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶; qRT-PCR; 基因表達

0 引言

【研究意義】環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cAMP phosphodiesterase，PDE）作為cAMP信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要元件，能夠特異地催化cAMP/cGMP 3′, 5′環(huán)磷酸的3′環(huán)磷酸鍵水解，進而與腺苷酸環(huán)化酶協(xié)同調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP的濃度。PDE通過調(diào)控基礎cAMP水平，對真菌的營養(yǎng)感知、假菌絲的分化、細胞周期進程以及脅迫信號起主要調(diào)控作用[1]，故而對致病真菌的生長、發(fā)育和成功侵染至關重要?！厩叭搜芯窟M展】在真菌中普遍存在兩種磷酸二酯酶，分別為高親和力磷酸二酯酶和低親和力磷酸二酯酶。釀酒酵母（）中二者共同調(diào)控胞內(nèi)cAMP水平[2]，調(diào)控基礎cAMP水平，該基因的缺失能夠?qū)е箩劸平湍讣毎诤图毎さ耐暾匀毕荩粍t負責調(diào)控葡萄糖存在下的cAMP水平，且受PKA催化亞基正調(diào)控[3]。在稻瘟病菌（）中，和通過共同調(diào)控病菌的侵染過程和有性發(fā)育而影響其致病性[4-5]，不僅對胞內(nèi)cAMP水平及病菌致病性有重要作用，而且對維持細胞壁完整性至關重要，MoPdeH與MAPK途徑中的MoMck1直接互作進而對CWI進行調(diào)控[6]。在白色念珠菌（）中，參與調(diào)控次生代謝、轉(zhuǎn)錄、脅迫應答、細胞壁和細胞膜形態(tài)建成以及侵染和毒力[7-9]。在灰霉病菌（）中，對病菌的生長、分化以及毒力具有重要調(diào)控作用，而在這些過程中發(fā)揮作用較小[10]。在黃曲霉（）中，主要調(diào)控病菌的營養(yǎng)生長和黃曲霉毒素生物合成，與其功能有重疊但作用較弱[11]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組前期通過藥物學試驗初步闡明cAMP信號途徑與玉米大斑病菌的侵染過程有關，并對該途徑中的保守元件編碼基因[12]、[13-14]開展了功能研究，進一步證實cAMP信號途徑調(diào)控玉米大斑病菌的營養(yǎng)生長及分生孢子發(fā)育。但是，作為負性調(diào)節(jié)因子的PDE在該病菌中的功能尚待明晰。【擬解決的關鍵問題】克隆玉米大斑病菌的PDE編碼基因，利用生物信息學的方法分析其基因結(jié)構、編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構及理化性質(zhì)，系統(tǒng)分析基因在病菌不同發(fā)育時期及在侵染寄主早期階段的轉(zhuǎn)錄水平，為深入研究PDE基因的功能及其調(diào)控病菌發(fā)育的機制打下基礎，同時為進一步闡明cAMP途徑功能提供證據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2016年在河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院完成。

1.1 供試菌株及寄主

玉米大斑病菌野生型菌株01-23、感病寄主玉米OH43自交系均由河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存。

1.2 供試主要培養(yǎng)基及試劑

PDA培養(yǎng)基用于玉米大斑病菌的培養(yǎng)。

總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（CLONTECH，Catalog#: K1811-1）、3′-Full RACE Core Set（TaKaRa，Code No. D6121）、Prime Script?RT reagent Kit和SYBR Premix ExTMII（perfect real-time）均購自TaKaRa（中國大連）公司；DNA膠回收試劑盒購自全式金生物技術有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA和RNA的提取

收集在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)10 d的玉米大斑病菌菌絲體，參照Zhang等[15]的方法提取DNA及RNA，用于基因的克隆、RACE及Genome Walking。

參考Hao等[14]的方法將濃度為10個/μL的病菌孢懸液以20 μL/滴的液滴接種于無菌復印膜上，25℃黑暗保濕孵育，分別于接種后0（分生孢子）、3 h（芽管形成率＞80%）、12 h（附著胞形成率＞80%）、24 h（侵染菌絲形成率＞80%）收集菌絲體；按照同樣的接種方法將病菌孢懸液接種于感病寄主葉片表面，分別于接種后1、3、6、9、12、18、24 h從葉片上收集菌絲體，置于無菌Eppendorf管中，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肨rizol試劑盒分別提取人造疏水介質(zhì)誘導下不同發(fā)育時期菌絲體及接種感病寄主葉片不同時間后菌絲體的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用于實時定量PCR（quantitative real-time PCR）分析基因的表達情況。所有試驗均設3次重復。

1.4 玉米大斑病菌PDE基因的克隆

根據(jù)釀酒酵母、白色念珠菌、灰霉病菌、稻瘟病菌、綠僵菌（）和黑曲霉（r）6種真菌PDE基因的保守序列，設計2對簡并引物H-PDE-F/R和L-PDE-F/R（表1），以基因組DNA為模板，擴增同源片段。25 μL PCR反應體系：DNA（20 ng·μL-1）1 μL，引物F、R（10 μmol·L-1）各2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，TaKaRaDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.3 μL，ddH2O 15.2 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃5 min，共35個循環(huán)；72℃10 min。

根據(jù)基因同源片段設計特異引物（表1），按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書擴增基因cDNA末端片段。參考郝志敏等[16]的方法，利用Genome Walking技術對同源片段進行延伸。所得序列用DNAMAN5.0進行拼接。根據(jù)所得的基因全長序列設計引物H-PDE-DNA-F/R和L-PDE-DNA-F/R（表1）克隆PDE的全長基因。

上述所有擴增產(chǎn)物均經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，連接pMD-19載體并測序。

1.5 PDE基因及編碼產(chǎn)物的生物信息學分析

利用MEGA 5.0軟件對PDE蛋白預測編碼產(chǎn)物進行多重序列比對，并采用鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設置為1 000。利用GSDS（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/chinese.php?input=seq）[17]分析基因結(jié)構。利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析理化性質(zhì)，利用SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl?Page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測二級結(jié)構。利用SMART數(shù)據(jù)庫在線分析保守結(jié)構域。

1.6 PDE基因表達水平的real-time PCR分析

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計特異性引物用于qRT-PCR（表1），以18s rDNA為參照基因。采用ABI Step One-Real-Time PCR System，以各時期cDNA為模板，SYBR Premix Ex TaqTMII2770（perfect real-time）試劑盒進行qRT-PCR擴增。20 μL qPCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、引物F、R（10 μmol·L-1）各0.4 μL、cDNA（300 ng·μL-1）模板2 μL、ROX 0.4 μL，加水至20 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s（此處收集熒光），共40個循環(huán)；然后從60℃上升至95℃，每秒上升0.3℃，并收集一次熒光。每個樣品均設3次重復。根據(jù)基因相對表達量分析方法2-ΔΔCt，對不同發(fā)育時期及侵染寄主過程中的表達量進行統(tǒng)計，試驗數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進行差異顯著性分析。

表1 試驗所用引物

2 結(jié)果

2.1 玉米大斑病菌全長PDE基因的克隆與序列分析

分別利用2對簡并引物進行擴增，得到0.75 kb（圖1-A）和0.7 kb（圖2-A）產(chǎn)物，經(jīng)BlastX分析表明，2個擴增產(chǎn)物與釀酒酵母、白色念珠菌、灰霉病菌、稻瘟病菌、綠僵菌和黑曲霉的PDE基因相似性均達到80%以上，初步認定2個片段為PDE編碼基因，將其命名為、。

對進行RACE擴增，3′ RACE獲得2.5 kb的擴增產(chǎn)物（圖1-B），該產(chǎn)物與所得基因片段間有125 bp的完全重疊區(qū)，且含有終止密碼子TGA；5′ RACE未獲得擴增產(chǎn)物。繼而，利用引物H-PDE-GW-GSP1和H-PDE-GW-GSP2（表1）進行兩次5′ Genome Walking延伸，分別得到約0.8和1.0 kb的條帶（圖1-C、1-D），最終拼接序列經(jīng)BlastX分析表明，起始密碼子ATG位于序列的171 bp處。對進行5′及3′ Genome Walking延伸，分別得到約1和2.5 kb的擴增產(chǎn)物（圖2-B、2-C），拼接結(jié)果表明，序列中含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。

根據(jù)基因的預測ORF設計特異引物，分別對ORF的DNA及cDNA全長進行擴增，獲得3.2和5.0 kb的擴增產(chǎn)物（圖3）。測序結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物均為完整的ORF。ORF全長3 208 bp，包含5個內(nèi)含子和6個外顯子，編碼區(qū)為2 898 bp，內(nèi)含子長度分別為78、46、59、76、51 bp。ORF全長5 054 bp，共包含4個內(nèi)含子和5個外顯子（圖4），編碼區(qū)為3 090 bp，4個內(nèi)含子大小分別為63、182、50、1 669 bp。

M：DL 2000 DNA Marker；1、2：StH-PDE同源片段擴增產(chǎn)物The amplification products of StH-PDE homologous fragment；3：3′ RACE擴增產(chǎn)物Products of 3′ RACE of StH-PDE；4—7：5′ Genome walking擴增產(chǎn)物的電泳檢測Products of 5′ Genome walking of StH-PDE

M：DL 2000 DNA Marker；1、2：StL-PDE同源片段擴增產(chǎn)物The amplification products of StL-PDE homologous fragment；3、4：3′ Genome Walking 擴增產(chǎn)物Products of 3′ Genome Walking of StL-PDE；5：5′ Genome Walking擴增產(chǎn)物的電泳檢測Products of 5′ Genome Walking of StL-PDE

2.2和的系統(tǒng)進化分析

將和與其他真菌物種中的PDE基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明不同的植物病原真菌中PDE同源基因分別呈現(xiàn)出高度的相似性（圖5），其中，與、、等病原真菌的高親和力磷酸二酯酶基因聚于同一進化支。與、、、等病原真菌的低親和力磷酸二酯酶基因聚于相同進化支。

M：DL 2000 DNA Marker；1、2：StH-PDE同源片段擴增產(chǎn)物The amplification products of StH-PDE homologous fragment；3：StL-PDE同源片段擴增產(chǎn)物The amplification products of StL-PDE homologous fragment

圖4 玉米大斑病菌PDE基因結(jié)構特征

圖5 磷酸二酯酶基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3和編碼產(chǎn)物的生物信息學分析

編碼965個氨基酸，分子量約為107.16 kD；編碼1 029個氨基酸，分子量約為110.77 kD。其二級結(jié)構均以無規(guī)卷曲（random coil，Cc）為主，分別占65.38%和73.13%，其次為-螺旋（Alpha helix，Hh），分別占30.25%和18.03%。等電點（pI）分別為7.9和8.88，說明二者均為堿性蛋白質(zhì)。StH-PDE氨基酸殘基中極性氨基酸占60.21%，疏水性氨基酸占39.79%，帶電荷氨基酸占26.74%；StL-PDE氨基酸殘基中極性氨基酸占60.65%，疏水性氨基酸占39.35%，帶電荷氨基酸占26.10%，其中包括10.11%的酸性氨基酸及11.38%的堿性氨基酸。

保守結(jié)構域分析表明，StH-PDE的418—429位氨基酸構成了典型的Class IPDE保守催化結(jié)構域H-D-[LIVMFY]-x-H-x-[AG]-x(2)-[NQ]-x-[LIVMFY]（圖6-A），StL-PDE的542—556位氨基酸構成了Class II PDE保守催化結(jié)構域H-x-H-L-D-H-[LIVM]-x- [GS]-[LIVMA]-[LIVM](2)-x-S-[AP]（圖6-B）。

下劃線標識部分為催化結(jié)構域The catalytic domains were underlined

2.4和的表達分析

2.4.1 人造疏水介質(zhì)誘導下病菌侵染結(jié)構發(fā)育過程中的相對表達量 與菌絲體相比，和在分生孢子中的表達水平均顯著上調(diào)，其中和分別上調(diào)了約2倍和52倍。當孢子開始萌發(fā)時兩基因表達水平均明顯下調(diào)，隨著萌發(fā)的進行，表達水平緩慢回升，至附著胞形成階段，基因表達出現(xiàn)了第2次高峰，隨后表達水平再次下調(diào)。但在整個過程中，的最高表達水平則出現(xiàn)在附著胞形成時期，達到了菌絲體中的近7倍、分生孢子中的近2倍，而的表達水平始終低于其在分生孢子中的表達水平（圖7-A）。說明和共同調(diào)控病菌的分生孢子發(fā)育及附著胞形成。尤其在附著胞形成過程中，表現(xiàn)更加活躍。

2.4.2 在病菌侵染感病寄主葉片過程中的相對表達量 為了進一步驗證和在病菌侵染過程中的表達情況，選取與感病寄主互作24 h內(nèi)的病菌材料，分析表達水平。結(jié)果表明，和在此過程中的表達水平變化趨勢與其在人工疏水介質(zhì)誘導下的模擬侵染過程中的表現(xiàn)基本一致。在孢子萌發(fā)早期表達水平顯著下調(diào)，隨著時間延長，緩慢回升，至接種后18和24 h表達水平上調(diào)，超過萌發(fā)初期（圖7-B）。

A：疏水介質(zhì)誘導下玉米大斑病菌不同發(fā)育時期的表達量Expression at different developmental stages induced by hydrophobic medium；B：接種后不同時間的表達量Expression in different times after inoculation of maize leaves

3 討論

真菌PDE被劃分為高親和力磷酸二酯酶和低親和力磷酸二酯酶2類。在病原真菌中，磷酸二酯酶的功能已經(jīng)初步明確，新生隱球菌（）中主要由低親和力的磷酸二酯酶調(diào)控胞內(nèi)cAMP進而調(diào)節(jié)整個信號通路[18]，而在白色念珠菌[9]、釀酒酵母[3]裂殖酵母（）[19]稻瘟病菌[4-5]等真菌中，均主要由高親和力的磷酸二酯酶調(diào)控胞內(nèi)cAMP水平。研究表明，PDE家族催化域的氨基酸序列相似性較低，但是具有一些共同的結(jié)構特征[20-22]。這些保守結(jié)構域均可以作為識別環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的特征序列[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，StH-PDE具有Ⅰ型cAMP磷酸二酯酶催化結(jié)構域和依賴金屬離子的磷酸水解酶保守“HD”基序，屬高親和力磷酸二酯酶；StL-PDE具有特有的Ⅱ型cAMP磷酸二酯酶催化結(jié)構域和翻譯延長因子EF1B-gamma保守基序，屬低親和力磷酸二酯酶。此外，PDE在哺乳動物、果蠅細胞內(nèi)同樣分布廣泛，依據(jù)其序列、底物特異性、抑制物敏感性和輔助因子等特征，PDE被劃分為11 個家族，包括21個基因的編碼產(chǎn)物，然而，由于可變的轉(zhuǎn)錄起始位點和mRNA前體的可變剪接，這些基因可以產(chǎn)生多于21種的mRNA及蛋白產(chǎn)物，目前已發(fā)現(xiàn)了100種以上的mRNA產(chǎn)物，其中絕大部分可以翻譯成蛋白。但是絲狀真菌中的PDE是否存在類似現(xiàn)象尚未見報道。本研究克隆的與2013年完成基因組測序的Et28A菌株[26-27]的相應基因（SETTUDRAFT_91803）DNA序列相同，但CDS序列不同。前者為3 090 bp，由5個外顯子拼接組成；而后者為3 027 bp，由6個外顯子拼接而成。相差的63 bp位于的4 714—4 776 bp處，是第5個外顯子的片段；而該片段在SETTUDRAFT_91803中為第5個內(nèi)含子。說明該基因可能存在可變剪接現(xiàn)象，而01-23菌株屬于1號小種，Et28A菌株為23N小種，該基因的不同剪接方式是否與生理小種差異有關尚有待進一步驗證。

在黃曲霉中，缺失后表現(xiàn)為產(chǎn)孢量降低，菌核形成減少；在野生型菌株中表達量明顯高于，并且對于的轉(zhuǎn)錄有重要影響[11]。Ramanujam等提出，稻瘟病菌的磷酸二酯酶和在調(diào)控cAMP水平以及致病性則發(fā)揮不同的作用，其中在分生孢子發(fā)育、附著胞以及侵染結(jié)構形成時的表達量最高，而在菌絲的表達量最低，說明在稻瘟病菌中，主要通過調(diào)控病菌的侵染結(jié)構的形成影響致病性[4-5]。本研究表明，和在大斑病菌侵染結(jié)構發(fā)育過程中，無論是人造疏水介質(zhì)誘導條件下還是與感病寄主互作過程中，其轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢是基本一致的，只不過可能由于疏水介質(zhì)和寄主葉片的疏水性及結(jié)構的差異，導致基因表達變化的程度存在一定差異?？傮w來說，隨著孢子萌發(fā)、侵染過程的進行，和均表現(xiàn)出下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的變化趨勢。其中，的表達最高峰出現(xiàn)在分生孢子時期，而則在附著胞階段表達水平最高，說明可能主要參與分生孢子發(fā)育，而則在附著胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)基因表達水平的變化趨勢，在病菌-寄主互作過程中表達量峰值的出現(xiàn)比其在人工介質(zhì)上略顯滯后，說明在葉片上病菌附著胞發(fā)育的進程可能比人工介質(zhì)上遲緩，推測是由于兩種物質(zhì)表面的疏水性差異所致，那么，是否與疏水性表面識別有關值得進一步探索。此外，病菌侵染結(jié)構發(fā)育至附著胞形成后期，人工介質(zhì)上的病菌表達水平迅速下調(diào)，葉片上的病菌仍保持了較高的表達水平。出現(xiàn)這種差異有可能是由于在人工介質(zhì)上病菌侵入釘無法真正穿透，只能停留在介質(zhì)表面，葉片上的侵入釘則可以進一步生長至葉片細胞中吸取營養(yǎng)，而cAMP信號途徑的主要功能之一即調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的識別與代謝，前期研究已證明，cAMP/PKA負調(diào)控大斑病菌的菌絲生長[28]，那么較高的表達水平將有利于降低胞內(nèi)cAMP水平，從而減弱PKA活性，促使菌絲的生長。下一步將利用分子生物學手段，對這一推測加以證實。

4 結(jié)論

玉米大斑病菌中含有1個高親和力磷酸二酯酶基因和1個低親和力磷酸二酯酶基因。全長3 208 bp，編碼965個氨基酸。全長5 054 bp，編碼1 029個氨基酸。在玉米大斑病菌生長發(fā)育過程中，主要在附著胞的形成階段發(fā)揮調(diào)控作用，而主要在分生孢子階段發(fā)揮調(diào)控作用。

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（責任編輯 岳梅）

Cloning and Expression Pattern analysis of cAMP Phosphodiesterase Coding Genes in

Shen Shen, Li Zhenyang, Zhao Yulan, Li Pan, Han Jianmin, Hao Zhimin, Dong Jingao

(College of life science, Agricultural University of Hebei/Hebei Key Laboratory of plant physiology and molecular pathology, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to clarify the function of cAMP phosphodiesterase (PDE) and cAMP signal pathway in regulating the pathogenicity of, the genes encoding cAMP phosphodiesterase were cloned and the expression pattern of these genes were analyzed during the development of infective structures and the early stage of infecting the host. 【Method】Based on conserved sequence ofgenes from,,,,, the homologous fragments were amplified by degenerate primers PCR, and the full length PDE genes and flanking sequences were obtained by combining RACE and Genome Walking. Multiple sequence alignment for prediction coding product of the protein was constructed by Mega 5.0 software and phylogenetic tree was constructed by adjacent method. Gene structure was analyzed by GSDS. Physical and chemical properties were analyzed by ProtParam. Secondary structure was predicted by SOMPA. Conserved domains were analyzed by SMART on line.The material of different development periods fromwas collected under the induction on artificialhydrophobic medium and on the susceptible host surface. Quantitative real-time(qRT-PCR) was used to analyze the gene expression patterns.【Result】There were one high-affinity phosphodiesterase gene () and one low-affinity phosphodiesterase gene () in the genome of. Full-length ofwas 3 208 bp, which consisted of 5 introns and 6 exons, the coding region was 2 898 bp. The full length ofwas 5 054 bp, which contained 4 introns and 5 exons, with the coding region of 3 090 bp. StH-PDE protein contained conservative type I cAMP phosphodiesterase, and StL-PDE contained L-PDE specific type II cAMP phosphodiesterase catalytic domain.homologous genes in different plant pathogenic fungi presented a high degree of similarity.and the high affinity phosphodiesterase gene from,,were clustered in the same evolution.and the low affinity phosphodiesterase gene from,,,were clustered in the same evolution. Compared with the mycelia, the expression levels ofandin conidia were significantly up-regulated, andandwere up-regulated by about 52-fold and 2-fold under the induction on artificialhydrophobic medium, respectively. The expression of both genes at the early stage of spore germination was significantly down-regulated. With the germination process, the expression level gradually increased, and the second peak appeared at the appressorial formation stage, and then the expression level was down again. However, in the whole process, the highest expression level ofappeared in the appressorial formation period, reaching nearly 7-fold and 2-fold of that in the mycelia and the conidia, respectively, and the expression level ofwas always lower than that in conidia. During the interaction ofwith the susceptible host, the expression ofandin the process of pathogen infection was consistent with that under the induction of artificial hydrophobic material. The expression of both genes in the early stage of spore germination was significantly down-regulated. With the germination process, the expression level gradually increased. The expression ofwas down-regulated in 18 and 24 h post-inoculation beyond the early stage of spore germination. 【Conclusion】andshowed a down-regulation-up-regulated-down-regulated expression pattern in the development of pathogen infection. The relative expression level ofwas the highest during the appressorial formation, and the expression level ofin conidia was the highest.

; cAMP phosphodiesterase; quantitative real-time; gene expression

2017-02-28；接受日期：2017-05-02

國家自然科學基金（31301616，31601598）、河北省自然科學基金（C2016204160）、河北省高等學?？茖W技術研究項目（QN2016071）

申珅，E-mail：shenshen0428@163.com。李貞楊，E-mail：1543639761@qq.com。申珅和李貞楊為同等貢獻作者。通信作者郝志敏，E-mail：hzm_0322@163.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com