白皮杉醇對(duì)早期糖尿病腎病大鼠腎臟的影響

何 勇， 劉德慧， 吳榮艷， 譚 菲， 王麗芳， 劉宏明， 任稱(chēng)發(fā)， 許仁聰

(贛州市人民醫(yī)院 1藥劑科， 2腎內(nèi)科， 3贛州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江西 贛州 341000)

白皮杉醇對(duì)早期糖尿病腎病大鼠腎臟的影響

何 勇1， 劉德慧2△， 吳榮艷3， 譚 菲2， 王麗芳2， 劉宏明2， 任稱(chēng)發(fā)2， 許仁聰2

(贛州市人民醫(yī)院1藥劑科，2腎內(nèi)科，3贛州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江西 贛州 341000)

目的： 觀(guān)察白皮杉醇(PIC)對(duì)早期糖尿病腎病大鼠腎臟的影響，并探討白皮杉醇初步的作用機(jī)制。方法: 將大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照(control)組，模型(model)組，白皮杉醇低劑量(PIC-LD)組、中劑量(PIC-MD)組和高劑量(PIC-HD)組。建立糖尿病腎病大鼠模型，PIC-LD、PIC-MD和PIC-HD組大鼠造模成功后分別用白皮杉醇20 mg/kg、40 mg/kg與60 mg/kg灌胃(每天1次)，共給藥4周。血糖儀檢測(cè)大鼠血液中的血糖含量，脲酶-谷氨酸脫氫酶法與肌苷酸氧化酶法檢測(cè)血清中尿素氮與肌酐含量，免疫透射比濁法檢測(cè)大鼠24 h尿微量白蛋白的含量，HE染色對(duì)腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察，Western blot法檢測(cè)腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7的蛋白水平。結(jié)果: 與model組相比，PIC-LD、PIC-MD和PIC-HD組大鼠血糖濃度明顯下降，血清中尿素氮含量與尿微量白蛋白含量顯著下降，肌酐含量無(wú)顯著變化，腎組織系膜細(xì)胞與基質(zhì)增生減緩，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性的程度減輕，腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7的蛋白水平明顯下調(diào)。結(jié)論: 白皮杉醇對(duì)早期糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的活性發(fā)揮作用。

糖尿病腎??； 白皮杉醇； TGF-β/Smad信號(hào)通路

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病引起的最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，由于起病隱匿，早期無(wú)明顯臨床癥狀，但隨著病情發(fā)展，病變程度加劇，成為導(dǎo)致終末期腎病和患者死亡的主要原因。DN的主要特征為腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)與功能的改變，體現(xiàn)為高濾過(guò)、高灌注狀態(tài)與腎小球?yàn)V過(guò)屏障的改變[1]。隨著發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。糖尿病腎病的病理表現(xiàn)為腎小球肥大，基底膜增厚，逐漸發(fā)展為間質(zhì)纖維化，最終進(jìn)展為慢性腎功能衰竭[2]，但具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者中約有20%～40%是由于終末期腎病需要進(jìn)行換腎替代治療。

白皮杉醇(piceatannol，PIC)是白藜蘆醇的衍生物，主要存在于葡萄、大黃與甘蔗等植物中，是一種多酚化合物[3]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)人工合成的白皮杉醇具有抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫力以及抗炎等的生物活性[4-5]，白皮杉醇的抗氧化作用比白藜蘆醇強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抵抗脂多糖導(dǎo)致的腎血流動(dòng)力學(xué)變化，通過(guò)下調(diào)血漿與尿液中一氧化氮的水平而抑制脂多糖引起的腎損傷[6]?；诖耍覀兺ㄟ^(guò)建立糖尿病腎病大鼠模型，觀(guān)察白皮杉醇是否對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，并探討其初步的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境中，正常進(jìn)食飲水，進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

鏈脲佐菌素購(gòu)自Sigma；白皮杉醇購(gòu)自杭州廣林生物醫(yī)藥有限公司；肌酐測(cè)試盒與尿素氮測(cè)試盒購(gòu)自寧波瑞源生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司；抗TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照(control)組，模型(model)組，白皮杉醇低劑量(low dose，LD)組(PIC-LD組)、中劑量(medium dose，MD)組(PIC-MD組)和高劑量(high dose，HD)組(PIC-HD組)。

2.2 早期糖尿病腎病大鼠模型建立與給藥 進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)后，正常對(duì)照組大鼠繼續(xù)采用普通飼料喂養(yǎng)；其余各組大鼠均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)1周，禁食12 h，采用無(wú)菌枸櫞酸鈉緩沖液配制的鏈脲佐菌素(42 mg/kg)腹腔注射，72 h后，尾靜脈取血檢測(cè)血糖，當(dāng)血糖值≥16.7 mmol/L時(shí)確定為造模成功。造模成功后，白皮杉醇低劑量組、中劑量組和高劑量組分別采用20 mg/kg、40 mg/kg與60 mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)給藥4周。模型組與正常對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 樣本收集 給藥完成后，各組大鼠禁食不禁水24 h，置于代謝籠，收集尿液，離心后備用；腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈穿刺取血，置于抗凝真空采血管中，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用；采集血液后，摘取雙側(cè)腎臟，清洗后左側(cè)腎臟用4%多聚甲醛固定，備用，右側(cè)腎臟切取皮髓交界處組織備用。

2.4 空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)與血清肌酐(serum creatinine， SCr)含量的檢測(cè) 采用血糖儀檢測(cè)大鼠血液中的血糖含量，采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法與肌苷酸氧化酶法檢測(cè)血清中尿素氮與肌酐含量。

2.5 尿微量白蛋白(urinary microalbumin，U-mAlb)含量的檢測(cè) 采用免疫透射比濁法檢測(cè)大鼠24 h尿微量白蛋白的含量。

2.6 HE染色病理學(xué)觀(guān)察 將已固定好的腎臟組織制作成石蠟切片，分別浸泡在二甲苯I、II溶液中各20 min，再分別浸泡于梯度乙醇各5 min，蒸餾水沖洗，加入蘇木素染液浸泡3 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸溶液分化20 s，自來(lái)水沖洗，0.5%伊紅復(fù)染60 s，再次放入梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，用中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀(guān)察。

2.7 Western blot法 將腎組織樣本放置于冰上剪碎，加入RIPA裂解液，于勻漿機(jī)中勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后取等量蛋白，100 ℃水浴變性5 min，用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入封閉液中室溫孵育1 h，加入 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌2次，加入相應(yīng) II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，使用化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光、保存膠片。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組均數(shù)間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠空腹血糖、血尿素氮、血清肌酐與尿微量白蛋白水平的變化

Control組大鼠正常飲食，精神狀態(tài)正常；model組大鼠精神狀態(tài)萎靡，體重逐漸減輕，空腹血糖濃度顯著高于control組(P<0.05)，血清中尿素氮含量顯著高于control組(P<0.05)；PIC-LD、PIC-MD和PIC-HD組大鼠體重?zé)o顯著變化，空腹血糖下降明顯(P<0.05)，但并未到達(dá)正常范圍值，血清中尿素氮含量下降(P<0.05)。各組大鼠血液中肌酐含量的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表1。

與control組相比，model組大鼠尿微量白蛋白含量顯著升高(P<0.05)；與model組相比，經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，大鼠的尿微量白蛋白含量隨藥物劑量逐漸下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、血尿素氮、血清肌酐與尿微量白蛋白水平的變化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

2 各組大鼠腎臟的病理學(xué)觀(guān)察

Control組大鼠的腎小球與系膜基質(zhì)未出現(xiàn)明顯的病理改變；model組大鼠顯微鏡下可見(jiàn)系膜細(xì)胞與基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣變性；PIC-LD、PIC-MD和PIC-HD組大鼠的腎臟病理改變明顯減輕，其中PIC-HD組大鼠的病理學(xué)形態(tài)最接近c(diǎn)ontrol組，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of piceatannol on the pathological changes of kidney in the rats with diabetic nephropathy (×200).

圖1 白皮杉醇對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟病理學(xué)變化的影響

3 各組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7蛋白水平的變化

與control組相比，model組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7的蛋白水平顯著增加(P<0.05)；與model組相比，PIC-LD、PIC-MD和PIC-HD組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2及p-Smad3的蛋白水平明顯下降，而僅PIC-HD組Smad7蛋白較model組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

討 論

糖尿病腎病是糖尿病患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是引起末期腎病的主要原因[7]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未明確。肌酐一般全部隨尿排出，不會(huì)被腎小管重吸收，臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病早期由于腎小球?yàn)V過(guò)率并未出現(xiàn)明顯變化，所以血肌酐含量不會(huì)出現(xiàn)明顯波動(dòng)；尿素氮在一定程度上可反映腎小球的濾過(guò)功能，但容易受腎外因素(如蛋白代謝紊亂、消化道出血等)的影響而明顯升高，因此，檢測(cè)血肌酐的含量更能體現(xiàn)糖尿病腎病早期腎臟功能的變化。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠血肌酐與正常組并無(wú)差異，經(jīng)過(guò)白皮杉醇給藥后，血肌酐略微下降，但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，白皮杉醇能夠明顯降低糖尿病腎病大鼠血清尿素氮的含量，提示白皮杉醇可能對(duì)糖尿病腎病早期的蛋白代謝紊亂有改善作用。尿微量白蛋白是腎臟早期損傷的重要標(biāo)志，能夠在一定程度上反映腎小球損傷[8]。因此，在臨床上常檢測(cè)尿微量蛋白來(lái)監(jiān)測(cè)腎臟是否出現(xiàn)損傷。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白皮杉醇能夠降低糖尿病腎病大鼠尿微量白蛋白的含量，推測(cè)白皮杉醇可能具有保護(hù)腎臟的功能。

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號(hào)通路與多個(gè)器官的纖維化、硬化有密切聯(lián)系，是調(diào)節(jié)組織纖維化的最重要因子[9-10]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β, TGF-β)在人體的肝、腎、皮膚、結(jié)締組織等均有表達(dá)，是一種具有多種功能的細(xì)胞因子。多項(xiàng)研究表明TGF-β信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化，胚胎發(fā)育、損傷修復(fù)等一系列細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)[11]。Smad蛋白是目前所知唯一的TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物，是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)非常重要的分子[12]。活化的TGF-β受體I磷酸化后激活Smad2/3蛋白，形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移與凋亡，同時(shí)引起Smad7從細(xì)胞核中移出。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGF-β/Smad信號(hào)通路處于高度激活狀態(tài)時(shí)，腎臟系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中的膠原合成顯著增加，形成腎間質(zhì)纖維化[13]，并出現(xiàn)Smad7功能的缺失。我們研究發(fā)現(xiàn)，白皮杉醇能夠抑制由糖尿病腎病引起的TGF-β1、p-Smad2與p-Smad3蛋白水平的上升，推測(cè)白皮杉醇可能通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的重要因子Smad2和Smad3的磷酸化，且抑制Smad7的蛋白水平，從而具有抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用。

Figure 2.The effect of piceatannol on the protein levels of TGF-β1, p-Smad2, p-Smad3 and Smad7 in the kidney tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 白皮杉醇對(duì)大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7蛋白水平的影響

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 宋延君)

Effects of piceatannol on rat kidney with diabetic nephropathy in early stage

HE Yong1, LIU De-hui2, WU Rong-yan3, TAN Fei2, WANG Li-fang2, LIU Hong-ming2, REN Cheng-fa2, XU Ren-cong2

(1DepartmentofPharmacy,2DepartmentofNephrology,GanzhouPeople’sHospital，3DepartmentofLaboratoryMedicine,ThirdPeople’sHospitalofGanzhou,Ganzhou341000,China.E-mail:liuxianmed@163.com)

AIM: To observe the effect of piceatannol on the kidney of diabetic nephropathy rats in early stage, and to explore the possible mechanisms.METHODS: The rats were randomly divided into 5 groups: control group, model group, low dose of piceatannol treatment group, medium dose of piceatannol treatment group and high dose of piceatannol treatment group. The rat model of diabetic nephropathy was induced accordingly, and the rats

20 mg/kg, 40 mg/kg or 60 mg/kg of piceatannol by gavage once a day for 4 weeks. Blood glucose was detected by glucometer. The urea nitrogen and creatinine levels in the serum were measured by urease-glutamate dehydrogenase enzymatic and inosine acid oxidase methods, respectively， and 24 h urinary microalbumin was analyzed by immune transmission turbidimetry test. Moreover, the pathological changes of the kidney tissues were observed under microscope with HE staining. The protein expression of TGF-β1 and Smad 7 and the phosphorylation levels of Smad2 and Smad3 were determined by Western blot. RESULTS: Compared with model group, piceatannol treatment significantly decreased the levels of blood glucose, blood urea nitrogen and urinary microalbumin, but had no effects on serum creatinine. Furthermore, HE staining showed that the increased mesangial cells, matrix hyperplasia and degenerated epithelial cells in model group were markedly inhibited after piceatannol treatment. Additionally, piceatannol treatment also reduced the protein expression of TGF-β1 and Smad 7, and the phosphorylation levels of Smad2 and Smad3. CONCLUSION: Piceatannol attenuates pathological progression in the kidney of diabetic nephropathy rats in early stage, which may be through inhibiting TGF-β/Smad signaling pathway.

Diabetic nephropathy; Piceatannol; TGF-β/Smad signaling pathway

1000- 4718(2017)08- 1528- 04

2017- 02- 20

2017- 04- 27

R587.1； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.030

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