西格列汀對(duì)AGEs作用下系膜細(xì)胞自噬的影響*

江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 廣東 廣州 510220)

西格列汀對(duì)AGEs作用下系膜細(xì)胞自噬的影響*

江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 廣東 廣州 510220)

目的： 探討西格列汀對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)作用下系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法: 培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，共分5組，分別為正常對(duì)照(control)組、AGE組和不同濃度(5 、10和20 μmol/L)西格列汀組。培養(yǎng)48 h后采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清膠原蛋白Ⅳ(collagen IV， Col IV)含量的變化。采用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白beclin-1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、 p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平。結(jié)果: 與control組比較，AGEs可明顯引起系膜細(xì)胞活力和Col IV表達(dá)增加，不同濃度的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞活力和Col IV表達(dá)的增加；與control組比較，AGEs可引起系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)和AMPK磷酸化水平下降，p70S6K磷酸化水平增加；不同濃度的西格列汀均可促進(jìn)系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)及AMPK磷酸化，抑制p70S6K磷酸化，并呈一定的濃度依賴性。結(jié)論: 西格列汀可能通過(guò)引起系膜細(xì)胞的自噬發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

西格列??； 自噬； 系膜細(xì)胞； 糖尿病腎?。?Beclin-1； 腺苷酸活化蛋白激酶

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年上升，是終末腎病的主要病因，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康，但目前尚無(wú)有效的治療方法，因此迫切需要對(duì)糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究，尋求新的治療糖尿病腎病的藥物。有研究表明，自噬在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[1]，因此自噬有望成為糖尿病腎病治療新的藥理作用靶點(diǎn)。

西格列汀(sitagliptin)是一種二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)抑制劑，能夠迅速滅活腸促胰島素胰高血糖素樣肽1和糖依賴性胰島素釋放肽等多種激素，增強(qiáng)人體自身的控制血糖能力，是目前臨床治療2型糖尿病的常用藥物之一[2]。但研究發(fā)現(xiàn)西格列汀除了控制血糖等生理作用外，還可減少糖尿病大鼠腎臟的氧化應(yīng)激及TNF-α、TGF-β的分泌，抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，減少尿蛋白的產(chǎn)生[3-4]。以上研究表明，西格列汀可能還對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不清楚。近期有研究表明DPP-4抑制劑可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬而保護(hù)心肌的功能及減輕動(dòng)脈粥樣硬化的程度[5-6]，但西格列汀是否通過(guò)自噬發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，目前少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以系膜細(xì)胞為模型，初步探討了西格列汀對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)作用下大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)的影響，為西格列汀臨床治療糖尿病腎病提供理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

西格列汀、DMSO、MTT和大鼠TNF-α購(gòu)自Sigma-Aldrich；胎牛血清購(gòu)自PPA；DMEM低糖培養(yǎng)基和青、鏈霉素溶液(100×)購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；PBS粉劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；IV型膠原(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；抗beclin-1、p70S6K和p-p70S6K抗體購(gòu)自Abcam；小鼠抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、β-actin 單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG購(gòu)自凱基公司；ECL 顯色劑購(gòu)自Pierce；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管和細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自Corning。3K15低溫離心機(jī)購(gòu)自Sigma；TDL-50B低速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBZY-1細(xì)胞購(gòu)自上海艾研科技有限公司。將HBZY-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為以下5組：對(duì)照(control)組：普通DMEM(含糖5.6 mmol/L)完全培養(yǎng)基；AGEs(5%的牛血清白蛋白和0.5%葡萄糖一起溶解于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，過(guò)濾除菌后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中8周，最后用透析方法析出AGEs，除菌后備用)處理組：采用0.25 g/L AGEs處理細(xì)胞，簡(jiǎn)稱AGE組；藥物處理組：在加AGEs處理的系膜細(xì)胞中，分別用不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀處理(簡(jiǎn)稱AGE+S5組、AGE+S10組和AGE+S20組)。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，置于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6～24 h。采用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h，然后按照細(xì)胞分組加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。

2.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清Col IV的含量 從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30 min。配置標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，37 ℃恒溫箱溫育120 min。棄去液體，洗滌液洗板4次。加入工作液100 μL，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗板5次。依序每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。用450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值。

2.5 Western blot 檢測(cè) beclin-1、AMPK、p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平 細(xì)胞加 200 μL預(yù)冷的 RIPA 裂解液(含50 mmol/L Tris， pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0.1% SDS， 10 mmol/L EDTA， 1 mmol/L PMSF， 2 mg/L aprotinin, 2 mg/L leupeptin)，4 ℃ 12 000 r/min 離心 25 min， 吸取上層液體經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后，取 150 μg 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE 分離，蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉 4 h， 加I 抗 4 ℃過(guò)夜， 加II 抗室溫孵育 1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，所得結(jié)果以 β-actin 為內(nèi)參照。各組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 西格列汀 對(duì)AGEs作用下大鼠系膜細(xì)胞活力的影響

培養(yǎng)48 h，AGE組系膜細(xì)胞活力明顯高于control組(P<0.01)。不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞的活力(P<0.01)，并呈一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The changes of the viability of the mesangial cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖1 各組系膜細(xì)胞活力的比較

2 西格列汀對(duì)AGEs作用下系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液Col IV含量的影響

與control組比較，AGE組系膜細(xì)胞上清液中Col IV的含量明顯增加(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯降低AGEs誘導(dǎo)下系膜細(xì)胞上清液中Col IV的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of sitagliptin (SIT) on the content of Col IV in the cell culture supernatant induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L);▲P<0.05vsAGE+SIT (10 μmol/L).

圖2 西格列汀對(duì)AGEs條件下系膜細(xì)胞分泌Col IV的影響

3 西格列汀對(duì)AGEs作用下大鼠系膜細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，AGEs可抑制系膜細(xì)胞beclin-1的表達(dá)(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯促進(jìn)AGEs條件下系膜細(xì)胞beclin-1的表達(dá)(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進(jìn)系膜細(xì)胞beclin-1的表達(dá)作用增強(qiáng)，呈一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein expression of beclin-1 in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖3 西格列汀對(duì)AGEs條件下大鼠系膜細(xì)胞beclin-1表達(dá)的影響

4 西格列汀對(duì)AGEs作用下大鼠系膜細(xì)胞TORC1活性的影響

p70S6K 是已知的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的底物蛋白，其磷酸化水平反映mTORC1的活性。培養(yǎng)48 h，與對(duì)照組相比，AGEs可明顯促進(jìn)系膜細(xì)胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯抑制AGEs作用下系膜細(xì)胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其抑制p70S6K磷酸化的作用更加明顯，具有一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖4。

5 西格列汀對(duì)AGEs作用下大鼠系膜細(xì)胞AMPK磷酸化的影響

與對(duì)照組相比，AGEs可明顯抑制系膜細(xì)胞AMPK的磷酸化(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯增加AGEs作用下系膜細(xì)胞AMPK的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進(jìn)系膜細(xì)胞AMPK磷酸化的作用增加，呈一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The effects of sitagliptin (SIT) on the expression of p-p70S6K in mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖4 西格列汀對(duì)AGEs條件下大鼠系膜細(xì)胞p70S6K磷酸化的影響

Figure 5.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein level of p-AMPK in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖5 西格列汀對(duì)AGEs條件下大鼠系膜細(xì)胞AMPK磷酸化的影響

討 論

自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在膜包囊泡中降解的生物學(xué)過(guò)程，主要通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，為合成新的蛋白質(zhì)和更新細(xì)胞器提供所需的原料，維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。自噬異常能導(dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退變、糖尿病等多種疾病的發(fā)生。糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程的腎小球基底膜增厚、系膜及基質(zhì)增生聚集、蛋白尿等一系列病理過(guò)程與自噬關(guān)系密切[8]。研究表明抑制自噬可引起糖尿病腎病患者腎小球?yàn)V過(guò)率下降，增加TGF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)[9]。此外，Munehiro等[10]研究發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)了腎小管的自噬，可改善了糖尿病腎病腎臟的損傷。還有研究指出適度的自噬對(duì)糖尿病腎病具有保護(hù)作用，能夠抑制糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[11]。因此，我們推測(cè)通過(guò)干預(yù)自噬可能可以達(dá)到保護(hù)腎臟、延緩腎臟疾病進(jìn)展的目的。

Beclin-1是酵母自噬基因在哺乳細(xì)胞中的同源蛋白，參與自噬體的形成，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性緊密相關(guān)[7]。本研究證實(shí)西格列汀能夠抑制AGEs作用下大鼠系膜細(xì)胞的活力以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，初步證實(shí)了西格列汀可能具有一定的腎臟保護(hù)作用，這與以往的研究具有一致性。同時(shí)本研究還證實(shí)AGEs可明顯抑制系膜細(xì)胞beclin-1的表達(dá)，這一結(jié)果初步表明AGEs可能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬引起糖尿病腎病的發(fā)生，而西格列汀可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

mTORC1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與自噬小體的誘導(dǎo)及形成，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞自噬。有研究指出，抑制mTORC1信號(hào)通路可以起到保護(hù)腎臟的作用，并減緩糖尿病腎病的發(fā)展[12-13]。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由α、β和γ亞單位組成，對(duì)分解代謝起到關(guān)鍵的作用，是機(jī)體能量代謝平衡的總開(kāi)關(guān)。有研究指出糖尿病腎病中激活A(yù)MPK不僅可以通過(guò)對(duì)mTORC1的抑制達(dá)到對(duì)自噬作用的調(diào)控，且可以通過(guò)對(duì)ULK1激酶調(diào)節(jié)beclin-1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的直接調(diào)控作用，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和腎臟的纖維化[14-15]。因此推測(cè)AMPK對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能是通過(guò)對(duì)自噬作用的激活實(shí)現(xiàn)的。本研究證實(shí)西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細(xì)胞mTORC1底物蛋白p70S6K的磷酸化，顯示西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細(xì)胞mTORC1的活性。此外，西格列汀還可促進(jìn)AGEs條件下系膜細(xì)胞AMPK的磷酸化。由此可推測(cè)西格列汀可能通過(guò)促進(jìn)AMPK的磷酸化及抑制mTORC1的活性進(jìn)而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of sitagliptin on autopaghy in mesangial cells induced by AGEs

JIANG Ying-juan, JIANG Zuo-feng, WU Xiao-lan, HUANG Pei, WU Weng-fa, Yu Hui-wen

(DepartmentofGeneralMedicine,GuangzhouRedCrossHospital,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510220,China.E-mail:yuhwgz@163.com)

AIM: To investigate the effect of sitagliptin on the autopaghy and the expression of extracellular matrix in mesangial cells induced by advanced glycation end products (AGEs). METHODS: The cells were divided into 5 groups: control group, AGE group, and sitagliptin (5, 10 and 20 μmol/L) groups. After 48 h, the cell viability was measured by MTT assay, and the content of collagen (Col) Ⅳ in the supernatant of the cell culture was detected by ELISA. The protein levels of beclin-1, adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)， p-AMPK， p70S6K and p-p70S6K were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the cultured mesangial cells were significantly increased (P<0.01). Sitagliptin decreased the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the mesangial cells in a dose-dependent manner. AGEs significantly inhibited the protein levels of beclin-1 and p-AMPK, but significantly increased the protein level of p-p70S6K. Compared with AGE group, sitagliptin significantly reversed the above results in a dose-dependent manner. CONCLUSION: Autophagy may mediate the protective effect of sitagliptin on mesangial cells induced by AGEs.

Sitagliptin; Autophagy; Mesangial cells; Diabetic nephropathy; Beclin-1; Adenosine monophosphate-activated protein kinase

1000- 4718(2017)08- 1455- 05

2017- 01- 19

2017- 05- 17

廣州市衛(wèi)生和計(jì)劃生育科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(No. 20161A011020)

R363.2+1； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.018

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△通訊作者 Tel: 020-34402117; E-mail: yuhwgz@163.com