山柰酚通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移*

黃茂莘， 陳 玲， 韓鵬定， 林詩可

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院藥學(xué)部， 海南 ?？?570311)

山柰酚通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制HBx-HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移*

黃茂莘△， 陳 玲， 韓鵬定， 林詩可

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院藥學(xué)部， 海南 ?？?570311)

目的： 探討山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響，并研究其潛在分子作用機(jī)制。方法： 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平，利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)蛋白的水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率，MTT實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)果： 山柰酚(10～200 μmol/L)能夠劑量和時(shí)間依賴性地抑制HBx-HepG2 細(xì)胞的增殖。山柰酚(100 μmol/L)能顯著抑制HBx-HepG2細(xì)胞的集落形成數(shù)量、細(xì)胞侵襲能力以及細(xì)胞愈合率，誘導(dǎo)HBx-HepG2細(xì)胞凋亡，引起cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及Bax蛋白水平上升，Bcl-2蛋白水平下降，降低β-catenin、c-Myc 和 cyclin D1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。山柰酚(100 μmol/L)同時(shí)能夠降低p-GSK-3β蛋白水平以及細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的β-catenin蛋白水平，對GSK-3β蛋白水平?jīng)]有影響。 LiCl處理能夠反轉(zhuǎn)山柰酚(100 μmol/L)對HBx-HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移抑制作用。結(jié)論： 山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用，這種抑制作用很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性來實(shí)現(xiàn)的。

HBx-HepG2細(xì)胞; 山柰酚; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞侵襲; 細(xì)胞遷移; Wnt/β-catenin信號(hào)通路

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝細(xì)胞癌發(fā)病的重要原因之一[1]。HBV編碼的HBx 蛋白與HCC的發(fā)展有著密切的聯(lián)系[2]。山柰酚(kaempferol)是屬于黃酮類的一種化合物，主要來源包括姜科植物山柰及小檗科植物窩兒七的莖和根[3]。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可以通過不同分子機(jī)制抑制不同種類的腫瘤細(xì)胞增殖并且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[4]，但未有山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞影響的報(bào)道。本研究首次探討了山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響，并研究其潛在的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

山柰酚購于Sigma；HBx-HepG2細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；各種基因qRT-PCR的引物購自上海吉瑪生物科技有限公司；TRIzol試劑購于Invitrogen；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽取試劑盒購于Beyotime;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)所用的 I 抗和 II 抗均購于Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 利用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HBx-HepG2 細(xì)胞，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，消化傳代。于6孔板里每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，利用不含雙抗的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞用不同濃度的山柰酚處理，用于后面各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測山柰酚處理后細(xì)胞的不同基因的表達(dá)水平 利用山柰酚(100 μmol/L)或正常培養(yǎng)液處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，用TRIzol溶劑提取mRNA, 提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 采用熒光定量PCR儀器擴(kuò)增β-catenin、c-myc以及cyclin D1目的片段。這些基因的表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 MTT法檢測HBx-HepG2的細(xì)胞活力 利用不同濃度山柰酚(10～200 μmol/L)或正常細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理HBx-HepG2細(xì)胞24 h、48 h 及72 h后，將處理的HBx-HepG2細(xì)胞每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清夜，然后于每孔加入150 μL DMSO，利用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀測量每孔在570 nm波長的吸光度來計(jì)算細(xì)胞活力。

2.4 平板集落形成實(shí)驗(yàn) (colony formation assay) 利用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養(yǎng)液或100 μmol/L山柰酚+1 mmol/L LiCl(Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活劑)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，將HBx-HepG2于每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)10 d, 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每隔3 d更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d 后，棄掉培養(yǎng)液后利用生理鹽水洗滌3次，常溫空氣中干燥后利用75%乙醇固定細(xì)胞15 min, 然后利用0.5%結(jié)晶紫染色2 h，將染色的細(xì)胞在顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算形成的集落數(shù)量。

2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel 按每孔40 μL 均勻鋪在 Transwell 小室膜上。將用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養(yǎng)液或山柰酚(100 μmol/L)+ LiCl(1 mmol/L)處理48 h后的HBx-HepG2 細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，吸取100 μL懸液加到小室的上層，下層加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將不鋪膠的小室取出，利用PBS洗滌3次后再利用4%的多聚甲醛固定20 min, 然后利用結(jié)晶紫染色30 min，揭下Transwell小室膜反貼在載玻片上。在顯微鏡下計(jì)數(shù)每膜上下左右中5個(gè)隨機(jī)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 利用山柰酚(100 μmol/L)、正常培養(yǎng)液或山柰酚(100 μmol/L)+LiCl(1 mmol/L)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞接種于6孔板中，24 h常規(guī)培養(yǎng)后吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，用20 μL 槍頭在每孔細(xì)胞中均勻劃3條橫線(每隔1 cm劃1條)，橫穿過孔。然后在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h 分別進(jìn)行顯微鏡觀察和拍照，計(jì)算融合率。劃痕融合率(%)=(Area0 h-Area48 h)/Area0 h×100%, Area 表示未愈合面積。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 利用山柰酚(100 μmol/L)或者正常培養(yǎng)液處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞利用PBS洗滌3次，然后加入70%冷乙醇固定后收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞利用PBS洗滌去除固定液，然后加入RNA酶,反應(yīng)過夜，再利用Annexin V-FITC/PI 對細(xì)胞進(jìn)行雙染色，然后利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡率進(jìn)行分析。

2.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 利用山柰酚(100 μmol/L)或者正常培養(yǎng)液處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞提取蛋白,用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分離細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白。取25 μg等量蛋白上樣，利用10% SDS-PAGE，將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液于室溫封閉1 h,然后用TBST 洗滌5 min,洗滌3次。然后將醋酸纖維素膜分別與不同的 I 抗(抗cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc、cyclin D1、p-GSK-3β、GSK-3β、α-tubulin、lamin A及β-actin抗體)4 ℃孵育過夜。將I抗孵育后的抗體利用TBST洗滌3次，再跟辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗于室溫孵育1 h。醋酸纖維素膜進(jìn)行曝光顯影，利用凝膠成像儀器對各顯色條帶的灰度值進(jìn)行測量，以β-actin為內(nèi)參照計(jì)算各個(gè)目的蛋白的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組與組之間的比較采用Studentt檢驗(yàn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞活力的影響

用不同濃度的山柰酚分別處理HBx-HepG2 細(xì)胞24 h、48 h 及72 h，然后利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測了HBx-HepG2細(xì)胞的活力。MTT結(jié)果顯示山柰酚可抑制HBx-HepG2細(xì)胞活力，并呈劑量依賴性及時(shí)間依賴性，24 h、48 h及72 h處理后的IC50分別為101.8 μmol/L、98.3 μmol/L和73.5 μmol/L,見圖1。

2 山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞生長、侵襲及遷移的影響

山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，分別利用集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及愈合實(shí)驗(yàn)檢測HBx-HepG2細(xì)胞的生長、侵襲及遷移。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h 后能夠顯著抑制集落形成的數(shù)量(P<0.01)；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠減少侵襲細(xì)胞的數(shù)量，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05);細(xì)胞愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠降低愈合率，并且與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 1.The effect of kaempferol on the viability of the HBx-HepG2 cells. The viability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol (10～200 μmol/L) for 24 h， 48 h and 72 h was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖1 山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of HBx-HepG2 cells. A: the growth of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by colony formation assay; B: the invasion ability of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Transwell invasion assay; C: the migration ability of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by wound healing assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖2 山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞生長、侵襲及遷移的影響

3 山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞凋亡的影響

用山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測HBx-HepG2細(xì)胞的凋亡率。與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h 后能顯著增加細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。進(jìn)一步的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測了凋亡通路相關(guān)蛋白，包括cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2及Bax,與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠顯著增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白的水平，同時(shí)降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平 (P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effect of kaempferol on the apoptosis of the HBx-HepG2 cells. A: the apoptosis of HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was analyzed by flow cytometry; B: the expression levels of apoptosis-related proteins， cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2 and Bax， in the HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖3 山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞凋亡的影響

4 山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

用山柰酚(100 μmol/L)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后，RT-qPCR 和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平。與對照組相比，山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠顯著降低β-catenin、c-Myc 和 cyclin D1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山柰酚處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠顯著降低p-GSK-3β的蛋白水平 (P<0.05)，對GSK-3β的蛋白水平?jīng)]有影響。山柰酚能夠降低細(xì)胞質(zhì)中β-catenin蛋白水平,同時(shí)對細(xì)胞核中的β-catenin蛋白水平的降低更為明顯，見圖4。

5 山柰酚對LiCl處理的HBx-HepG2細(xì)胞生長、侵襲以及遷移的影響

用山柰酚(100 μmol/L)或山柰酚(100 μmol/L)+ LiCl(1 mmol/L)處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后, 分別利用集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及愈合實(shí)驗(yàn)檢測HBx-HepG2細(xì)胞的生長、侵襲及遷移。100 μmol/L山柰酚+1 mmol/L LiCl處理HBx-HepG2 細(xì)胞48 h后能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長、侵襲及遷移，與100 μmol/L山柰酚組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

討 論

肝癌是中國最常見的腫瘤之一，研究發(fā)現(xiàn)HBx基因是HBV基因組中最小的開放讀碼框，其所編碼的HBx蛋白在肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及癌變起著重要的作用[2]。HBx蛋白可以作為一種反式激活因子激活多種信號(hào)通路，這些信用通路包括MAPK、PI3K-Akt、Ras、Notch/Jagged和Src等，從而影響細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖等[5]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚在不同類型的腫瘤細(xì)胞中通過不同的機(jī)制抑制細(xì)胞的增殖。山柰酚可以通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移[6]。Lee等[7]發(fā)現(xiàn)山柰酚可以通過阻斷EGFR相關(guān)的信號(hào)通路來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Cho等[8]研究發(fā)現(xiàn)山柰酚通過引起G1和G2/M 細(xì)胞周期阻滯，從而抑制大腸癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠抑制HBx-HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移。進(jìn)一步的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平，同時(shí)降低Bcl-2蛋白表水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示山柰酚很有可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制HBx-HepG2細(xì)胞的增殖。本研究的結(jié)果與Song等[9]的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可以通過增加cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 蛋白水平同時(shí)降低Bcl-2蛋白水平來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并且山柰酚可以導(dǎo)致胃癌細(xì)胞在G2/M期阻滯，從而影響細(xì)胞的增殖。本研究將來可能也有必要去進(jìn)一步探討山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞周期的影響，從而進(jìn)一步確定其中潛在的機(jī)制。

Figure 4.The effect of kaempferol on Wnt/β-catenin signaling pathway in the HBx-HepG2 cells. A: the mRNA expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in the HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was detected by RT-qPCR; B: the protein expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was determined by Western blot； C: the protein expression levels of p-GSK-3β and GSK-3β in HBx-HepG2 cells after kaempferol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot； D: the protein expression levels of β-catenin in the cytoplasm and nucleus in HBx-HepG2 cells after kaempfe-rol (100 μmol/L) or vehicle treatment for 48 h was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vskaempferol (0 μmol/L) group.

圖4 山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

Figure 5.The effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of LiCl-treated HBx-HepG2 cells. A: the colony formation ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by colony formation assay; B: the cell invasion ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by Transwell invasion assay; C: the cell migration ability of the HBx-HepG2 cells treated with kaempferol or kaempferol+LiCl for 48 h was measured by wound healing assay. a: kaempferol (100 μmol/L); b: kaempferol (100 μmol/L)+LiCl (1 mmol/L). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsa group.

圖5 山柰酚對LiCl處理的HBx-HepG2細(xì)胞生長、侵襲及遷移的影響

Wnt信號(hào)途徑由Wnt蛋白、受體以及調(diào)節(jié)蛋白等組成了復(fù)雜的信號(hào)通路, 調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、遷移以及哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育的多個(gè)重要環(huán)節(jié)[10-12]。近年來發(fā)現(xiàn)很多腫瘤的發(fā)生與Wnt信號(hào)的異常相關(guān)[13-14]，在HCC的發(fā)生發(fā)展中也不乏Wnt信號(hào)通路異常的報(bào)道[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)HBx 蛋白對于肝癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活起到關(guān)鍵的作用[16]。Chen等[17]研究發(fā)現(xiàn)HBx蛋白能夠促進(jìn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路從而增加肝癌細(xì)胞的遷移。本研究首次發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠抑制β-catenin、c-myc 和 cyclin D1的mRNA以及蛋白的水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠抑制p-GSK-3β 的蛋白水平，而山柰酚對于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制可能是通過抑制β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活劑LiCl可以阻斷山柰酚對HBx-HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移抑制作用。這些結(jié)果提示山柰酚很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活性來抑制HBx-HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)山柰酚對HBx-HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移有顯著性的抑制作用，這種抑制作用很有可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性來實(shí)現(xiàn)的。本研究的不足之處在于缺少相應(yīng)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確定山柰酚對HBx-HepG2的抑制作用。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Kaempferol inhibits cell proliferation, invasion and migration via Wnt/β-catenin signaling in HBx-HepG2 cells

HUANG Mao-xin, CHEN Ling, HAN Peng-ding, LIN Shi-ke

(DepartmentofPharmacy,HainanNongkenHospital,Haikou570311,China.E-mail:huang_maoxin@126.com)

AIM: To explore the effects of kaempferol on the proliferation, invasion and migration abilities of HBx-HepG2 cells and to examine the underlying molecular mechanisms. METHODS: The expression levels of related genes at mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry. The cell proliferation, growth, invasion and migration abilities were measured by MTT assay, colony formation assay, Transwell invasion assay and wound healing assay, respectively. RESULTS: Kaemferol inhibited HBx-HepG2 cell proliferation in a concentration- and time-dependent manner. Kaempferol at 100 μmol/L significantly inhibited the colony formation, invasion and migration abilities of the HBx-HepG2 cells. Kaemferol at 100 μmol/L also increased cell apoptotic rate, increased the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and Bax, and decreased the expression level of Bcl-2. In addition, kaemferol at 100 μmol/L suppressed the mRNA and protein expression levels of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in the HBx-HepG2 cells. Kaemferol at 100 μmol/L also suppressed the protein level of p-GSK-3β and the β-catenin protein levels in both cytoplasm and nucleus. LiCl treatment reversed the inhibitory effect of kaempferol on the growth, invasion and migration of the HBx-HepG2 cells. CONCLUSION: Kaempferol inhibits cell proliferation, invasion and migration via activating Wnt/β-catenin signaling in HBx-HepG2 cells.

HBx-HepG2 cells; Kaempferol; Cell proliferation; Cell invasion; Cell migration; Wnt/β-catenin signaling pathway

1000- 4718(2017)08- 1417- 06

2016- 12- 14

2017- 04- 12

海南省衛(wèi)計(jì)委普通醫(yī)學(xué)科研(No. 14A210221)

R735.7； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.012

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△通訊作者 Tel: 0898-66808275； E-mail: huang_maoxin@126.com