基于COI基因片段的擬釘螺種類鑒定初探

柯雪梅，邱 旻，林陳鑫，葛 婧，郭志南，程明基，陳 清，陳國(guó)偉

基于COI基因片段的擬釘螺種類鑒定初探

柯雪梅1，邱 旻2，林陳鑫3，葛 婧2，郭志南1，程明基2，陳 清2，陳國(guó)偉1

目的探討COI基因片段在擬釘螺種類鑒定中的作用。方法收集來自福建省內(nèi)多個(gè)地區(qū)的疑似擬釘螺標(biāo)本，用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行物種鑒定后，取出螺肉提取基因組DNA，通過PCR的方式擴(kuò)增COI基因序列片段并測(cè)序，通過序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析鑒定其物種。結(jié)果共采集到標(biāo)本13份，通過形態(tài)學(xué)方法將樣本鑒定為福建境擬釘螺屬。所有標(biāo)本經(jīng)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增到長(zhǎng)度為515～598 bp的COI基因片段。13份標(biāo)本中11株的COI基因片段與γ擬釘螺屬最為相似(88.96%～97.82%)，另外2株分別與擬釘螺屬下的武鳴擬釘螺(87.08%)及新擬釘螺屬下的開放新擬釘螺(88.55%)最為相似。在屬水平上，13份標(biāo)本中僅有1份的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與基因鑒定結(jié)果吻合，其余12份樣本的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果均與基因鑒定不同，兩種方法的鑒定結(jié)果存在較大差異。結(jié)論通過COI基因檢測(cè)可快速對(duì)擬釘螺亞科作出準(zhǔn)確判斷，但對(duì)屬水平的鑒定的準(zhǔn)確性還需要進(jìn)一步的研究。

擬釘螺亞科;COI基因;物種鑒定

擬釘螺亞科(Triclulinae)隸屬中腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranch)、圓口螺科(Pomatiopsidae)，目前主要分布于東南亞和中國(guó)南部[1]。已發(fā)現(xiàn)的擬釘螺亞科物種已達(dá)120種，其中在中國(guó)有近50 種，主要分布在長(zhǎng)江流域地區(qū)及其以南的地區(qū)[1-2]。擬釘螺亞科的擬釘螺屬(Tricula)、γ擬釘螺屬(Gammatricula)以及新擬釘螺屬(Neotricula)被認(rèn)為是裂體屬亞洲組血吸蟲和(或)并殖吸蟲的重要中間宿主[3-5]，因此，掌握并了解擬釘螺亞科種類的分布情況對(duì)監(jiān)控與預(yù)警上述兩種寄生蟲病有著重要的意義。傳統(tǒng)的擬釘螺亞科物種鑒定方法采用形態(tài)學(xué)鑒定法，即按照螺個(gè)體的外殼特征和齒舌特征對(duì)其進(jìn)行分類。但由于螺個(gè)體較小，部分形態(tài)學(xué)特征差異難以正確分辨，給分類工作帶來很大的困難，容易錯(cuò)分。故近來許多學(xué)者開始使用分子標(biāo)記即基因分類法作為分類研究的重要手段。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位I(Cytochrome c oxidase subunit I，COI)基因是所有分子標(biāo)記中使用較為廣泛的一種。本文報(bào)告了一種基于COI基因的擬釘螺亞科物種分類方法，并對(duì)該方法在擬釘螺亞科物種鑒定中的應(yīng)用價(jià)值做了初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 從廈門市、福州市、漳州市、南平市等4市的淡水河(溪)流中采集疑似擬釘螺亞科物種共計(jì)13份，每份約100～150只螺。采集到的樣本在經(jīng)清水清洗后，進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。鑒定完畢后的螺體浸入75%乙醇溶液，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取 從每份樣本中取5～10枚擬釘螺，去除螺殼及其內(nèi)臟，使用Earl’s平衡鹽溶液洗凈后一并置于研缽中研磨，將研磨后的螺體溶于Earl’s平衡鹽溶液制成勻漿液。取200 μL勻漿液，使用Promega DNA extraction kit提取其中的總基因組DNA。提取到的DNA經(jīng)檢純度、濃度合格后貯藏于-20 ℃冰箱備用。

1.3COI基因片段擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 采用Davis等[6]設(shè)計(jì)的針對(duì)擬釘螺COI基因設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)獲得的基因組核酸進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物序列為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物序列為：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAYCA-3′，擴(kuò)增的目標(biāo)片段的大小為598 bp。采用Promega公司的Master Green Mix試劑盒，參照使用說明構(gòu)建如下25 μL反應(yīng)體系：Master Green Mix 12.5 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，DNAase Free Water 8.5 μL，基因組DNA2.0 μL。具體PCR反應(yīng)流程如下：94 ℃預(yù)變性10 min，之后94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min 45 s，循環(huán)40次, 最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察是否擴(kuò)增成功。

1.4 擴(kuò)增子測(cè)序及比對(duì) 擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行切膠純化及回收后，使用前述引物進(jìn)行雙向序列測(cè)定(采用sanger法)，使用Bioedit[7]軟件對(duì)原始序列進(jìn)行拼接，獲得相應(yīng)COI基因序列片段。之后使用Bioperl[8]軟件將獲得序列提交NCBI服務(wù)器進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取BLAST report中的最優(yōu)結(jié)果對(duì)應(yīng)的物種名稱作為樣品的參考。

1.5 基因序列分析 依據(jù)關(guān)飛等[1]的報(bào)道，選取我國(guó)境內(nèi)5個(gè)省(福建、廣西、湖北、浙江、四川)的12種擬釘螺相應(yīng)的同源區(qū)段作為參考序列，并選擇我國(guó)境內(nèi)常見的湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)作為外群。與本實(shí)驗(yàn)中獲得的COI基因片段組成數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析：1)使用MEGA7.0[9]軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；2)基于比對(duì)結(jié)果計(jì)算序列一致性情況；3)根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行核苷酸替換模型測(cè)試，使用最適的替換模型計(jì)算參考序列與檢出序列間的進(jìn)化距離并構(gòu)建距離矩陣；使用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行1 000次Bootsrap迭代檢驗(yàn)進(jìn)化樹的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本采集及鑒定情況 本研究中采集的13份標(biāo)本的具體采集地點(diǎn)見表2。

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)擬釘螺個(gè)體大小，外殼特征及齒舌情況等，將本次采集到的擬釘螺標(biāo)本鑒定為此前在福建境內(nèi)多有發(fā)現(xiàn)的6種擬釘螺屬物種，見表1，圖1。

2.1.2 分子鑒定 從13份標(biāo)本的DNA中均擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的COI基因片段(515～598 bp)。經(jīng)BLAST比對(duì)鑒定，11份樣品的最優(yōu)結(jié)果為γ擬釘螺屬(Gammatricula)。其中采自廈門、福州以及漳州市的標(biāo)本序列一致性較高，達(dá)94.17%～97.82%，而采自南平市的標(biāo)本序列比對(duì)一致性只有87.08%～88.96%。另外，采自南平的NPQ-1的最優(yōu)結(jié)果為武鳴擬釘螺(Triculawumingensis)序列一致性為87.08%，而同為南平的NPQ-2的最優(yōu)結(jié)果為開放新擬釘螺(Neotriculaaperta)序列一致性為88.55%。13份標(biāo)本中，僅有NPQ-2的2個(gè)鑒定結(jié)果在屬水平一致，但種水平不一致。其它12份均在屬水平上不一致，但未有亞科水平結(jié)果不一致的情況。

表1 福建省幾種擬釘螺的形態(tài)特征比較Tab.1 Diagnosis features of Triculinae collected in Fujian Province

1-1小橋擬釘螺1-1 T.xiaoqiaoensis

1-2建甌擬釘螺1-2 T.jianouensis

1-3福建擬釘螺1-3 T.fujianensis

1-4 翔安擬釘螺1-4 T.xiananensis

1-5新店擬釘螺1-5 T.xindianensis

1-6 華安擬釘螺1-6 T.huaanensis

1-7翔安擬釘螺齒舌帶

表2 福建境內(nèi)采集疑似擬釘螺亞科物種標(biāo)本的鑒定結(jié)果Tab.2 Classification of Triculinae collected in Fujian Province

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 本研究中采用的參考序列的名稱、來源地區(qū)以及GenBank登錄號(hào)見表3。

表3 研究中使用的擬釘螺參考序列信息Tab.3 Reference sequences used in this study

經(jīng)計(jì)算，本次研究中的序列集最適用的替換模型為Tamura 3-parameter，故使用此模型估算各序列間的進(jìn)化距離，并構(gòu)建NJ樹如圖2。從計(jì)算結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)中采集的大部分?jǐn)M釘螺與我國(guó)境內(nèi)原先報(bào)道的擬釘螺在基因水平上有一定差異，COI基因序列一致性在85%～90%之間，進(jìn)化距離為0.109～0.201不等。從進(jìn)化樹上可見，除南平七里街(NPQ-1 NPQ-2)的2份標(biāo)本與武鳴擬釘螺聚為一支外，其它株均不與國(guó)內(nèi)已知的任何一種擬釘螺聚為一支，而是獨(dú)自成支，本研究中采集樣本的序列相互之間相似度高，進(jìn)化距離較近，相關(guān)分支的bootstrap值較高，表明該聚類結(jié)果較為可靠。

(帶“▲”為本次研究中獲得序列)(Sequences originally obtained in this study were marked with “▲”)圖2 實(shí)驗(yàn)獲得COI基因序列與參考序列通過鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ-Tree based on partial sequences of COI gene obtained in this study and reference sequences

3 討 論

在本研究中，形態(tài)學(xué)鑒定和基因鑒定在擬釘螺亞科水平上鑒定結(jié)果完全一致，但是在屬鑒定的結(jié)果間存在著較大的差異，這種差異的來源可能有如下幾點(diǎn)：

首先，形態(tài)學(xué)的鑒定方法依賴物種間表觀形態(tài)上的差異。對(duì)于擬釘螺這種個(gè)體特別小的淡水螺來說，其外殼、齒舌等特征差異并不明顯，這無(wú)疑使鑒別工作變得十分困難。即使在李翠娥[10]等提出以細(xì)部解剖資料作為依據(jù)進(jìn)行鑒別參考后，僅從形態(tài)及解剖學(xué)上對(duì)擬釘螺進(jìn)行精細(xì)區(qū)分仍然困難重重。而小橋擬釘螺、建甌擬釘螺、華安擬釘螺等在最初被記述、分類并命名時(shí)，往往僅以形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)特征為基礎(chǔ)[11-12]，加之過去研究中確實(shí)多有發(fā)生僅依靠外觀而錯(cuò)判為擬釘螺屬的情況[10]，因此，對(duì)于廈門、福州、漳州采集的7份標(biāo)本，傾向于認(rèn)為系最初分類的偏差及命名的錯(cuò)誤導(dǎo)致了形態(tài)學(xué)鑒定上的偏差，這7份標(biāo)本實(shí)際上應(yīng)該屬于γ擬釘螺。

另一方面，基于分子標(biāo)記的分子鑒別方法雖然簡(jiǎn)單易行，但在實(shí)際應(yīng)用中也需進(jìn)一步評(píng)價(jià)和完善。該方法的本質(zhì)是通過比對(duì)，尋找已知數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)與被提交序列最為相似者，然后以這條序列的注釋信息作為鑒定結(jié)果。這種方法的準(zhǔn)確性依賴于兩個(gè)重要因素：①提交序列本身的測(cè)序質(zhì)量；②已知數(shù)據(jù)庫(kù)的完備與準(zhǔn)確。對(duì)于前者，由于實(shí)際樣本情況的差異與實(shí)驗(yàn)條件的限制，難以保證所有樣品的測(cè)序都能達(dá)到高質(zhì)量且均一；至于后者，由于分子標(biāo)記鑒定相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)仍在發(fā)展及完善中，難免出現(xiàn)庫(kù)中數(shù)據(jù)不全或者不準(zhǔn)確的情況。Buhay[13]等就曾提及現(xiàn)有的包含COI基因的數(shù)據(jù)庫(kù)如NCBI Genbank及Barcode of Life(BOL)等在進(jìn)行數(shù)據(jù)收錄時(shí)并未收集數(shù)據(jù)的質(zhì)量信息，因此研究者若想使用，只能自己進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)控與篩選工作。綜上，若相關(guān)方法及數(shù)據(jù)庫(kù)在某一個(gè)物種上尚不成熟，則基因鑒定同樣會(huì)出現(xiàn)偏差。比如本研究中所有采自南平的標(biāo)本，雖然都能通過BLAST獲得注釋結(jié)果，但由于序列一致性并不算特別高，故不排除由于數(shù)據(jù)庫(kù)不完備而發(fā)生了注釋上的偏差的可能。因此相關(guān)的6份標(biāo)本尚無(wú)法判明種屬。

本研究表明，用COI基因片段對(duì)擬釘螺種類進(jìn)行鑒定，在亞科水平上可得到與形態(tài)學(xué)鑒定完全一致的結(jié)果。但是在屬鑒定水平上則差異較大。提示在基因鑒定方面仍需開展更多研究，例如選用多個(gè)分子標(biāo)記聯(lián)合判斷、不斷完善擬釘螺亞科相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息等。

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Chen Guo-wei, Email: xmcdcxsk@163.com

SpeciesidentificationofTriculinaebasedonCOIgenesegment，F(xiàn)ujianProvince

KE Xue-mei1, QIU Min2, LIN Chen-xin3, GE Jing2, GUO Zhi-nan1, CHENG Ming-ji2, CHEN Qing2, CHEN Guo-wei1

(1.XiamenCenterforDiseaseControlandPrevention,Xiamen361021,China; 2.PublicHealthCollegeofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

The aim of the study is to evaluate the utility value of species identification of Triculinae based onCOIgene. Triculinae-like samples were collected from different places in Fujian Province. After classification based on morphology characters, genomic DNA was extracted from collected samples. Then the segments ofCOIgene were amplified and sequenced for taxonomy annotation and phylogenetic analysis. Eleven samples were annotated asGammatricula(identities: 88.96%-97.82%), the other two were annotated asTriculawumingensis(identity: 87.08%) andNeotriculaapart(identity: 88.55%), respectively. In most cases (12 out of 13), there was a difference between results based on different classification methods on a genus level. The alignment ofCOIgene segment is sufficient for preliminary identification of Triclulinae at family level. However, it is need further study in species identification of Triclulinae at genus level.

Triclulinae;COI; species classification phylogenetic

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.012

福建省科技廳項(xiàng)目(No.2011D015)

陳國(guó)偉，xmcdcxsk@163.com

1.廈門市疾病預(yù)防控制中心，廈門 361021; 2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510515； 3.福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

Supported by the Science and Technology Agency og Fujian Province (No. 2011D015)

R38

：A

：1002-2694(2017)08-0724-06

2016-11-03編輯：劉岱偉