射干麻黃湯對(duì)急性哮喘小鼠模型IL-17A及IL-17F表達(dá)的影響

隋博文，翟平平，李明虎，李明爽，王浩，王達(dá)，彭先祝

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

射干麻黃湯對(duì)急性哮喘小鼠模型IL-17A及IL-17F表達(dá)的影響

隋博文1，翟平平2，李明虎2，李明爽2，王浩2，王達(dá)2，彭先祝1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討射干麻黃湯對(duì)急性哮喘小鼠模型肺組織及血清中IL-17A及IL-17F表達(dá)的影響，以近一步闡明其治療哮喘的作用機(jī)制。方法：選取60只SD小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組(A組)、哮喘模型組(B組)、地塞米松對(duì)照組(F組)、射干麻黃湯高、中、低濃度組(C、D、E組)。顯微鏡鏡下觀察經(jīng)HE染色的肺組織的病理性改變，哮喘小鼠血清檢測(cè)IL-17A及IL-17F水平，肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的水平采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)。結(jié)果: 小鼠肺組織中B組IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)量均明顯高于A組(P<0.01)。與B組比較, C、D、E組BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平降低(P<0.05)，且C組IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表達(dá)量下降最為明顯。C組與F組IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表達(dá)量相接近。小鼠血清中IL-17A及IL-17F水平變化與小鼠肺組織IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平變化趨勢(shì)基本相同。結(jié)論：射干麻黃湯可能是通過(guò)降低IL-17A及IL-17F細(xì)胞因子的分泌,來(lái)起到治療哮喘的目的。

射干麻黃湯；哮喘小鼠模型；IL-17A；IL-17F

支氣管哮喘(哮喘)的長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑，嚴(yán)重影響肺功能。其主要發(fā)病機(jī)制是炎癥-免疫反應(yīng)。當(dāng)前研究認(rèn)為原始Th0細(xì)胞可在過(guò)敏原的促使下，可向抗原特異性分化為Th2細(xì)胞，形成T細(xì)胞中以Th2細(xì)胞為優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答，致使Th1/Th2比例失衡[1]。由一類Th細(xì)胞亞群CD4+IL-17可進(jìn)一步促使上述定向分化，誘發(fā)以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主哮喘發(fā)生機(jī)制的變態(tài)炎性反應(yīng)[2]。哮喘炎性反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用是主要通過(guò)分泌IL-17來(lái)完成，目前已發(fā)現(xiàn)IL-17具有6種分型，其中IL-17A及IL-17F對(duì)哮喘炎性反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)有著重要影響，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，也具有一定的促進(jìn)作用[3]。因此，通過(guò)觀察射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠模型的肺組織及血清中IL-17A及IL-17F水平，初步對(duì)射干麻黃湯對(duì)哮喘防治的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為哮喘的現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

OVA(卵蛋白)323-329肽段的MPA-OVA(Sigma公司)；氫氧化鋁(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；地塞米松(國(guó)藥準(zhǔn)字H20133353)；SnPP(Alexis，USA)；DAB顯色劑、防脫載玻片、德國(guó)菜卡2135型切片機(jī)；加拿大麥克奧迪moticam3000顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)；IL-17A、IL-17F檢測(cè)ELISA試劑盒(上海美旋生物科研試劑有限公司)；香港Heal公司NW10LV型超純水系統(tǒng)；中國(guó)湖南湘儀H-2050R型超速冷凍離心機(jī)；蘇州BIOHIT公司Proline型微量移液器；上海SYSBERY公司DZF-6050型真空干燥箱；美國(guó)Thermo公司NANO 2000型紫外分光光度計(jì)；韓國(guó)BIONEER公司Exicycler 96型熒光定量PCR儀；2×Power Taq PCR MasterMix、Powder瓊脂糖、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke公司)；RNase固相清除劑(天恩澤公司)；50×TAE(Amresco公司)；SYBR Green(Solarbio)；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 射干麻黃湯的組方與制備

實(shí)驗(yàn)所用中藥干預(yù)為射干麻黃湯，全方用量為射干6 g，麻黃9 g，款冬花6 g,細(xì)辛3 g,紫菀6 g,五味子3 g,半夏9 g,生姜9 g,大棗3枚組成。所用中藥購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥房，選用天江制劑溶解于蒸餾水，以低劑量為臨床等效的比例為5∶2∶1的配制成18.720 g/mL、7.488 g/mL、3.744 g/mL的高、中、低的劑量溶液3個(gè)實(shí)驗(yàn)計(jì)量，并在4 ℃條件下保存并備用。

1.3 哮喘小鼠模型分組與建立

健康SPF級(jí)SD小鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-005)，體質(zhì)量20～24 g。60只SD小鼠隨機(jī)平均分成的6組：分別為正常對(duì)照組(A組)、哮喘模型組(B組)、地塞米松對(duì)照組(F組)、射干麻黃湯高、中、低濃度組(C、D、E組)。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，以第1周末作為第0天，在第1、8天予A組正常飼養(yǎng),B-F組小鼠腹腔注射OVA 100 mg和100 mg氫氧化鋁誘導(dǎo)劑。第15天通過(guò)1%OVA激發(fā)小鼠3周連續(xù)霧化，霧化每次30 min。致敏后第15天開(kāi)始每次霧化激發(fā)前30 min灌胃給藥，分別給予C-E組射干麻黃湯藥劑量18.720,7.488,3.744g/mL的藥液1 mL/只[4]。給予A組等高濃度生理鹽水1 mL/只。F組注射地塞米松的藥液1 mL/只。各組予每天2次給藥，連續(xù)3周。

1.4 標(biāo)本的采集及檢測(cè)

各組小鼠末次給藥24 h后給予腹腔注射10%水合氯醛 (0.35 mL/kg)進(jìn)行麻醉，在無(wú)菌操作下，打開(kāi)小鼠胸腔并暴露雙肺，采集右肺組織，用4%聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋切片，HE染色[5]。集肺左葉組織并迅速保存于-80℃冰箱，用于RT-PCR檢測(cè)。暴露小鼠腹主動(dòng)脈采血，并依據(jù)ELISA法檢測(cè)哮喘小鼠動(dòng)脈血中IL-17A及IL-17F含量。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)

取保存于-80℃冰箱的小鼠左肺葉組織，利用總RNA提取試劑盒參照說(shuō)明提取肺組織總RNA，經(jīng)過(guò)測(cè)定各組小鼠肺組織中mRNA濃度并制作反轉(zhuǎn)錄RNA樣本用量表，計(jì)算mRNA量。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明在PCR儀操作完成得到對(duì)應(yīng)的cDNA。置于-20℃保存。按照SYBR GREEN試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。以內(nèi)參照物為β-actin，按照引物序列：IL-17A上游引物：5′-TACCTCAACCGTTCCACTTCA-3′，下游引物5′-CACTTCTCAGGCTCCCTCTTC-3′。IL-17F上游引物：5′-CTGCTGCTGTTGATGTTGG-3′，下游引物5′-ACTGGAGCGGTTCTGGAA-3′。β-actin上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。在反應(yīng)條件(95℃，10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s， 72 ℃ 30 s循環(huán)40次；4 ℃ 5 min)下，按照反應(yīng)體系(cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL)加入到ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠激發(fā)后的行為學(xué)觀察

致敏和霧化吸入前6組小鼠的狀態(tài)良好，且表現(xiàn)無(wú)差異。在致敏后，A組小鼠體質(zhì)量較B組重，精神好，活動(dòng)頻繁，未見(jiàn)呼吸頻率及深度改變。C-F組小鼠表現(xiàn)較輕微，僅有活動(dòng)減慢、精神輕度萎靡但無(wú)不規(guī)則呼吸。B組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、精神差，煩躁不安，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，鼻翼煽動(dòng)，前肢撓鼻等癥狀。

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

A組支氣管結(jié)構(gòu)清晰,氣道黏膜上皮及肌層完整,肺泡結(jié)構(gòu)完整，管腔規(guī)則無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組支氣管管壁結(jié)構(gòu)破壞, 肺泡腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且周圍組織水腫伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)支氣管管腔狹窄且管腔內(nèi)黏液滲出物。C、D、E組支氣管管壁完整，且C組最為明顯,肺泡腔可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，卻無(wú)周圍組織水腫，細(xì)支氣管管腔未見(jiàn)狹窄。

2.3 各組小鼠BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)

結(jié)果顯示小鼠肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表達(dá)量相接近。A組中小鼠肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)量明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C、D、E組和F組的小鼠肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)量均明顯低于B組，小鼠肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組降低最為明顯。見(jiàn)表1。

表1 射干麻黃湯對(duì)小鼠BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA濃度的影響

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.01； 與模型組比較，#P<0.05

2.4 各組小鼠血清中IL-17A及IL-17F的水平

結(jié)果顯示各組小鼠IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白濃度相接近，A組中IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白濃度明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C、D、E組和F組的IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白濃度均明顯低于B組，IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白濃度明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組降低最為明顯。哮喘小鼠肺組織中IL-17A mRNA及IL-17F mRN與血清中IL-17A及IL-17F變化趨勢(shì)基本一致。見(jiàn)表2。

表2 射干麻黃湯對(duì)小鼠血清中IL-17A及IL-17F濃度的影響

注:與正常對(duì)照組比較，*P<0.01； 與模型組比較，#P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是最常見(jiàn)的非特異性呼吸道炎性的慢性疾病。哮喘氣道的高反應(yīng)性與Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞免疫平衡有關(guān)[1]。有些哮喘的發(fā)生機(jī)制，Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞免疫平衡尚不能解答。研究表明,在哮喘的發(fā)生機(jī)制中，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞也具有重要作用[5-6]。IL-17是前炎性細(xì)胞因子，由Th17細(xì)胞分泌，其在中性粒細(xì)胞與T細(xì)胞之間具有橋梁作用[7]。通過(guò)刺激肺支氣管組織，促進(jìn)其合成釋放炎性因子,進(jìn)一步增進(jìn)哮喘氣道單核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的募集[2,8]。IL-17A及IL-17F屬于IL-17中6成員之中。IL-17A是一種強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，可促使肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)，也可破壞某些組織因子的產(chǎn)生促進(jìn)黏液分泌及基底膜細(xì)胞的增殖等病理改變加重氣道重構(gòu)。IL-17A可活化中性粒細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子來(lái)完成。并使中性粒細(xì)胞在氣道募集與激活其活性。IL-17A還可在調(diào)節(jié)激酶，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞粘蛋白的表達(dá),引起粘液高分泌[9]。研究發(fā)現(xiàn)：IL-17F在對(duì)炎性細(xì)胞高表達(dá)和募集、氣道高反應(yīng)性與重塑，也有著重要影響。IL-17F可直接刺激支氣管上皮細(xì)胞,使其增加ICAM-1表達(dá)，并刺激IL-11分泌及表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺支氣管組織增生及膠原蛋白沉淀，最終導(dǎo)致氣道重塑[10]。

中醫(yī)認(rèn)為哮喘發(fā)作期主因內(nèi)有痰飲留伏，外受邪氣而誘發(fā)[11-12]。中醫(yī)學(xué)哮喘的發(fā)病機(jī)理概括為“外因誘發(fā)，觸動(dòng)伏痰，痰隨氣升，氣因痰阻，相互搏結(jié)于氣道”[13-14]。在急性發(fā)作期冷哮患者最為多見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)所用射干麻黃湯出自于《金匱要略》，是治療急性發(fā)作期冷哮經(jīng)典方劑。具有散寒解表，宣肺祛痰，溫肺止咳，安中扶正之功。射干麻黃湯對(duì)哮喘的治療效果顯著[15]。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠BALF及血清中IL-17A及IL-17F水平明顯上升，過(guò)量的IL-17A及IL-17F誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致Th1/Th2比例及Th17 /Treg細(xì)胞失衡,從而介導(dǎo)氣道高炎癥反應(yīng)。上述細(xì)胞因子參與哮喘的氣道炎癥病變的發(fā)生，也是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)因素。對(duì)于干預(yù)和調(diào)節(jié)其在體內(nèi)的分泌水平，可減輕或干預(yù)哮喘疾病的發(fā)生及發(fā)展。哮喘小鼠經(jīng)射干麻黃湯的高、中、低濃度干預(yù)治療后， BALF及血清中IL-17A及IL-17F泌明顯降低，氣道、血管周圍和肺泡間隔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：射干麻黃湯可能是通過(guò)降低IL-17A及IL-17F細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)，來(lái)達(dá)到緩解哮喘氣道高炎癥反應(yīng)的作用，來(lái)起到治療哮喘的目的。

[1] Strickland D H,Holt P G.T regulatory cells in childhood asthma[J].Trends in Immunology,2011,32(9):420-427.

[2] Lindén A, Adachi M. Neutrophilic airway inflammation and IL-17[J].Allergy, 2002, 57(9):769-775.

[3] Maalmi H, Beraies A, Charad R, et al. IL-17A and IL-17F genes variants and susceptibility to childhood asthma in Tunisia[J]. Journal of Asthma Official Journal of the Association for the Care of Asthma,2014,51(4):348-354.

[4] 湯家銘,陳民利.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2012:21.

[5] Shi Y H, Shi G C, Wan H Y, et al. Coexistence of Th1/Th2 and Th17/Treg imbalances in patients with allergic asthma[J].中華醫(yī)學(xué)雜志(英文版),2011,124(13):1951-1956.

[6] 姜暉,陳霞霞,王金艷,等.川芎嗪對(duì)小鼠哮喘模型Th17細(xì)胞的調(diào)控作用以及對(duì)Th17、Treg細(xì)胞平衡的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2014,30(10):1339-1343.

[7] 胡華元,胡剛,陳思.轉(zhuǎn)錄因子BCL11B通過(guò)TGF-β_1調(diào)控支氣管哮喘患者IL-17A的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué),2014,35(23):3660-3662.

[8] 劉靜.Th17細(xì)胞參與調(diào)控哮喘小鼠中性粒細(xì)胞性氣道炎癥的分子機(jī)制研究[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué),2011.

[9] 何麗霞,吳賽春,李秀存,等.化痰活血方對(duì)哮喘小鼠IL-17A和IL-13的影響[J].中成藥,2016,38(3):490-494.

[10] 羅智熹.霧化吸入滅活草分枝桿菌對(duì)哮喘小鼠模型白細(xì)胞介素-17F表達(dá)的影響[D].南寧：廣西醫(yī)科大學(xué),2014.

[11] 胡偉林，趙珊珊，涂明利，等.疏風(fēng)化痰方對(duì)咳嗽變異性哮喘臨床療效及氣道炎性因子的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(5):81-84.

[12] 張?zhí)煊?，谷繼偉，沈慶明.定喘湯加減聯(lián)合孟魯司特鈉治療小兒咳嗽變異性哮喘的臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2017,34(1):113-115.

[13] 焉石.自擬祛風(fēng)平喘湯對(duì)風(fēng)痰閉阻型支氣管哮喘患者細(xì)胞免疫功能的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(1):91-93.

[14] 張樹(shù)君,張帆.宣肺平喘方穴位敷貼聯(lián)合免疫治療寒熱錯(cuò)雜型兒童支氣管哮喘50例[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(4):94-96.

[15] 楊碩,羅光偉,萬(wàn)軍,等.射干麻黃湯對(duì)哮喘患者氣道高反應(yīng)性的影響[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015，(3):21-23.

The Influence of Shegan Mahuang Decoction on the Expressions of IL-17A and IL-17F in Acute Asthma Mice

SUI Bo-wen1,ZHAI Ping-ping2,LI Ming-hu2,LI Ming-shuang2,WANG Da2,PENG Xian-zhu2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the influence of Shegan Mahuang Decoction on the expression of IL-17A and IL-17F in the lung tissue of acute asthma mice, and to further elaborate its mechanism of treating asthma. Methods: A total of 60 mice were randomly divided into six groups, namely the control group(group A), the asthma model group (group B), different concentration groups of Shegan Mahuang decotion (group C, group D, and group E), and Dexamethasone group(group F). The pathological changes of lung tissue were observed under microscope with HE staining method, levels of IL-17A and IL-17F were tested in serum, and the levels of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA in lung tissue were detected by reverse transcription polymerase chain reaction. Results:The expressions of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA in group B were significantly higher than those in group A(P<0.01). Compared to group B, they were both decreased in group C, group D, and group E(P<0.05), in which the changes in group C was most significant, closing to group F. The level changes of IL-17A and IL-17F had similar trend to the changes of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA. Conlusion:Shegan Mahuang decoction may achieve the treating effect on asthma by reducing the production of IL-17A and IL-17F.

Shegan Mahuang decoction; Asthma mice model; IL-17A; IL-17F

2016-10-07

2017-02-15

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H201317)

隋博文(1979-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療呼吸系統(tǒng)疾病。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0053-04