丹參注射液對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-9、TIMP-1表達的影響

徐西林，張曉峰，吳興杰 ，呂航，夏聯(lián)恒，李小東，宿慧，劉沛然，王順

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參注射液對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-9、TIMP-1表達的影響

徐西林1，張曉峰2，吳興杰1，呂航1，夏聯(lián)恒1，李小東1，宿慧1，劉沛然1，王順1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察丹參注射液對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-9、TIMP-1表達情況的影響。方法：取12只6月齡新西蘭大白兔關節(jié)軟骨作體外細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后軟骨細胞隨機分為正常組、模型組、玻璃酸鈉組、丹參組4組。采用Western blot法測定軟骨細胞內(nèi)MMP-9、TIMP-1蛋白表達，RT-PCR檢測軟骨細胞內(nèi)MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA相對表達量。結果：Western Blot檢測結果：相對正常組，OA模型組的軟骨細胞組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；玻璃酸鈉組MMP-9、TIMP-1蛋白表達低于空白模型組(P<0.05)，丹參組MMP-9、TIMP-1蛋白表達低于空白模型組(P<0.01)；丹參組MMP-9蛋白表達低于玻璃酸鈉組，TIMP-1蛋白表達高于玻璃酸鈉組。熒光定量PCR檢測結果：與空白組相比，OA模型組家兔關節(jié)軟骨組織MMP-9 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)，MMP-9/TIMP-1失衡；治療后，與OA模型組相比，玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)；與玻璃酸鈉組相比丹參組MMP-9mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)。結論：丹參注射液能夠有效糾正MMP-9和TIMP-1在骨性關節(jié)炎軟骨組織中異常表達，減輕軟骨損傷，有效治療骨性關節(jié)炎。

丹參注射液；軟骨細胞；MMP-9；TIMP-1

骨性關節(jié)炎(Osteoathritis，OA)是一種以關節(jié)軟骨損害為特征的退行性病變，臨床表現(xiàn)關節(jié)軟骨破壞、滑膜細胞增生、滑膜炎等，多累及膝關節(jié)。隨著我國人口老齡化，OA發(fā)病率呈上升趨勢，55～64歲人群的發(fā)病率高達40%，嚴重影響人們的健康[1]，目前針對缺乏有效治療方法預防及延緩本病的發(fā)病和致殘。研究表明[2]基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)之間的異常表達是影響OA重要因素，如能有效抑制MMP活性，可能會減輕軟骨損傷，延緩骨性關節(jié)炎病變進展。

我們采用丹參注射液關節(jié)腔注射治療OA，可以顯著緩解疼痛、腫脹等癥狀，延緩膝關節(jié)軟骨退變，其療效機制尚不清楚，是否與MMP/TIMP表達相關，值得進一步研究。本實驗通過觀察丹參注射液治療軟骨細胞中的MMP-9和TIMP-1表達的變化，分析丹參注射液對MMP-9/TIMP-1的影響，探究丹參注射液治療OA的療效機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

12只6月齡健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量(2.1±0.1)kg，雌雄各半，天津裕達實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供，許可證號：SCXK(津)2016-0001，一籠一兔喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周。實驗方案符合醫(yī)學實驗動物倫理委員會要求。

1.2 主要藥物儀器

丹參注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準字Z33020177)，玻璃酸鈉(阿拉丁,批號：K1513011)，一抗二抗去除液(wanleibio)，全蛋白提取試劑盒(wanleibio)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(wanleibio)，SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(wanleibio)，MMP-9(wnlaeibio)，TIMP-1 antibody(wnlaeibio)，羊抗兔IgG-HRP(wanleibio)，內(nèi)參抗體β-actin(wanleibio)，Super M-MLV(BioTeke)，高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke)，50×TAE(Amresco)，2×PowerTaqPCRMasterMix(BioTeke)，SYBR Green(Solarbio)。

1.3 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型)，超速冷凍離心機(H-2050R)，雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)，酶標儀(ELX-800)，超純水系統(tǒng)(NW10LVF)，微量移液器(Proline)，真空干燥箱(DZF-6050)，紫外分光光度計(NANO 2000),熒光定量PCR儀(Exicycler 96)。

2 實驗方法

2.1 模型的制備

在無菌條件下，取12只兔膝關節(jié)軟骨，加少許10%FCS DMEM培養(yǎng)液，剪碎，離心取沉渣加0.1%Ⅱ型膠原酶，0.2%胰酶組成的消化液，在37℃消化3 h后，將細胞懸液過濾，離心后，接種培養(yǎng)瓶37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗研究用三代軟骨細胞，實驗前用甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞。

2.2 實驗分組及藥物處理

取三代培養(yǎng)的軟骨細胞，用含10%小牛血清培養(yǎng)液配成2×105/mL的細胞懸液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，采用SNP(2 mmol/L的硝普鈉(SNP))誘導軟骨細胞凋亡模型建立后進行分組，接種于96孔培養(yǎng)板，每組3孔，分別加入同體積藥液。

分組為①正常組：未經(jīng)任何處理的正常培養(yǎng)的軟骨細胞；②模型組：SNP單獨處理軟骨細胞；③玻璃酸鈉組：細胞中加入玻璃酸鈉100 μg/mL，24 h后加入SNP；④丹參組：向細胞中加入含5%丹參注射液的培養(yǎng)液，24 h后加入SNP。上述各組在加藥后，培養(yǎng)24 h后進行相關指標檢測。

2.3 觀察指標及測定

Western blot檢測：采用Western blot法檢測軟骨細胞MMP-9、TIMP-1蛋白表達。按照試劑盒說明，提取每組標本軟骨細胞的總蛋白。取每組300 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h。用相應一抗(1∶500)與PVDF膜4℃孵育過夜，洗去3次后，相應二抗(1∶5 000)37℃孵育45 min。最后ECL發(fā)光劑顯影，暗室中觀察。以β-actin作為內(nèi)參照，凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的灰度分析。

RT-PCR檢測：RT-PCR檢測軟骨細胞MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA相對表達。采用高純總RNA快速提取試劑盒提取每組軟骨細胞的總RNA，所得RNA樣本進行反轉錄以得到對應的cDNA。利用ExicyclerTM 96熒光定量儀(BIONEER)進行熒光定量分析,引物信息見表1。反應條件，95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，退火30 s，60℃延伸30 s，40個循環(huán)；引物信息見表1；以β-actin作為內(nèi)參照；采用2-△△CT方法分析熒光定量分析儀得到的數(shù)據(jù)。

表1 引物信息表

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 Western Blot檢測結果

相對正常組，OA模型組的軟骨細胞組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)；玻璃酸鈉組MMP-9、TIMP-1蛋白表達低于空白模型組(P<0.05)，丹參組MMP-9、TIMP-1蛋白表達低于空白模型組(P<0.01)；丹參組MMP-9蛋白表達低于玻璃酸鈉組，TIMP-1蛋白表達高于玻璃酸鈉組。檢測到MMP-9蛋白條帶位于78 kDa，內(nèi)參照β-actin反應條帶位于43 kDa處；TIMP-1蛋白條帶位于21 kDa，內(nèi)參照β-actin反應條帶位于43 kDa處(見圖1、2、表2)。

圖1 各組兔軟骨細胞MMP-9蛋白表達的Western Blot檢測結果

3.2 熒光定量PCR檢測結果

與空白組相比，OA模型組家兔關節(jié)軟骨組織MMP-9 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)，MMP-9/TIMP-1失衡，證實OA發(fā)病與MMP-9/TIMP-1失衡相關。治療后，與OA模型組相比，玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)；與玻璃酸鈉組相比丹參組MMP-9mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達量顯著升高(P<0.01)(見表3)。

圖2 各組兔軟骨細胞TIMP-1蛋白表達的Western Blot檢測結果

組別MMP-9TIMP-1正常組1.00±0.001.00±0.00OA模型組3.03±0.08#3.65±0.09#玻璃酸鈉組2.69±0.09#▲2.88±0.10##▲丹參組2.09±0.08#▲▲*3.11±0.09#▲▲*

注：與正常組相比，#P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與玻璃酸鈉組相比，*P<0.01

表3 膝骨關節(jié)炎模型兔軟骨組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA相對表達量

注：與正常組相比，#P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01；與玻璃酸鈉組相比，*P<0.01

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為OA主要由于軟骨細胞、細胞外基質(zhì)(ECM)、軟骨下骨的失衡[3-4]，其中MMPs和TIMPS異常表達起著重要作用。OA在關節(jié)軟骨受損時，軟骨細胞、滑膜細胞會分泌大量MMPs，打破MMP/TIMP平衡，導致軟骨基質(zhì)降解，關節(jié)軟骨抗應力能力也隨之下降，最終遭到關節(jié)軟骨的破壞[5]。因此MMPs與TIMPs之間失衡，是骨性關節(jié)炎重要發(fā)病機制。

MMPs是具有降解幾乎所有細胞外基質(zhì)功能的一族酶，MMP-9主要降解明膠和基底膜膠原，在細胞與基質(zhì)間粘附起著重要的作用[6-7]。姜海軍[2]應用ELISA法檢測OA患者和健康人血清MMP-9的含量，發(fā)現(xiàn)二者存在顯著差異。管劍龍等[8]的研究結果也證實這一點，MMP-9通過影響關節(jié)軟骨的正常合成與代謝平衡導致關節(jié)軟骨的退變。Mohtai等[9]發(fā)現(xiàn)OA患者MMP-9 mRNA表達明顯增高，認為MMP-9表達增高可能造成關節(jié)軟骨的破壞。吳振彪等[10]在臨床中也發(fā)現(xiàn)OA患者血清中MMP-9濃度顯著高于正常人。Janusz等[11]觀察到MMP抑制劑可以減輕OA動物模型的關節(jié)軟骨損傷，推測抑制MMP活性可能是防治OA的重要方法。

TIMPs由關節(jié)滑膜和軟骨細胞合成，正常狀態(tài)下與MMPs結合成1∶1的復合物，從而抑制大部分MMPs的活性，是維持軟骨基質(zhì)正常代謝、轉化的重要調(diào)節(jié)因子[12]。MMPs與TIMPs能夠相互結合和制約，使MMPs/TIMPs維持在平衡狀態(tài)，阻止MMPs降解關節(jié)軟骨內(nèi)蛋白多糖[13]。Hegemann N等[14]發(fā)現(xiàn)，雖然OA軟骨MMP-9和TIMP-1分泌均顯著增加，但TIMP -1增加低于MMP-9，影響MMP-9和TIMP-1的平衡性，因此造成膝關節(jié)軟骨退變。

研究結果顯示，正常組、玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9/TIMP-1表達保持基本平衡，意味著MMP-9與TIMP-1動態(tài)平衡是保護軟骨細胞的關鍵。雖然模型組MMP-9、TIMP-1表達均增加，但TIMP-1的增加低于MMP-9，破壞了MMP-9/TIMP-1平衡，因而造成關節(jié)軟骨損傷和破壞。玻璃酸鈉組、丹參組軟骨細胞的MMP-9顯著降低，TIMP-1顯著升高，是維持了MMP/TIMP-1動態(tài)平衡。而丹參組在維持MMP/TIMP-1平衡方面明顯優(yōu)于玻璃酸鈉組，因此丹參注射液臨床療效也優(yōu)于玻璃酸鈉。

本研究通過觀察丹參注射液對SNP誘導膝骨關節(jié)炎體外模型軟骨細胞的影響，發(fā)現(xiàn)丹參注射液能有效糾正MMP-9和TIMP-1異常表達，為丹參注射液治療OA提供了有效理論依據(jù)。

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2016-12-11

2016-12-28

黑龍江省自然科學基金(H2015024)；哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目(青年后備人才)(2015RAQYJ098)

徐西林(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師,從事骨壞死與骨關節(jié)疾病的臨床與基礎研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0021-04