丹紅提取物對脊髓型頸椎病的治療機制初探

楊家祥，楊環(huán)瑋，董軍格，于健，胡亞南，梁君，唐艷閣

（1.河北省中醫(yī)院骨傷一科，石家莊 050000；2.河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，河北 秦皇島 066000；3.河北省中醫(yī)院骨傷二科，石家莊 050000；4.河北省保定市兒童醫(yī)院外科，河北 保定 071000；5.河北省石家莊市平山縣大吾鄉(xiāng)衛(wèi)生院，石家莊 050408；6.河北省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050000）

丹紅提取物對脊髓型頸椎病的治療機制初探

楊家祥1，楊環(huán)瑋2，董軍格1，于健3，胡亞南4，梁君5，唐艷閣6

（1.河北省中醫(yī)院骨傷一科，石家莊 050000；2.河北省秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，河北 秦皇島 066000；3.河北省中醫(yī)院骨傷二科，石家莊 050000；4.河北省保定市兒童醫(yī)院外科，河北 保定 071000；5.河北省石家莊市平山縣大吾鄉(xiāng)衛(wèi)生院，石家莊 050408；6.河北省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊 050000）

目的探討丹紅提取物對大鼠脊髓型頸椎病動物模型的治療作用機制。方法取SD大鼠30只，建立大鼠脊髓型頸椎病動物模型，將大鼠分為正常對照組、模型組和實驗組。實驗組每天給予丹紅提取物，正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水。于給藥前及給藥4周后進行改進Rivlin斜板實驗，檢測大鼠的運動功能。給藥4周后處死大鼠，檢測椎間盤組織中白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和bcl-2的表達情況。結(jié)果斜板實驗表明，給藥4周后實驗組斜板度數(shù)有所增加，且大于模型組。處死大鼠后發(fā)現(xiàn)模型組細胞因子的表達量高于實驗組，bcl-2的表達量低于實驗組。結(jié)論丹紅提取物可以緩解脊髓型頸椎病。

丹紅提取物；脊髓型頸椎?。谎装Y；凋亡

脊髓型頸椎病通常表現(xiàn)為肢體麻木、無力或者行走障礙，這些癥狀對患者的生活及工作有嚴重影響，對患者健康威脅極大［1］。脊髓受壓迫的主要病理變化可以表現(xiàn)為頸椎間盤退變突出或增生性骨刺［2-3］。中醫(yī)藥在脊髓型頸椎病的治療中有其獨特優(yōu)勢，這些優(yōu)勢主要表現(xiàn)為選擇多樣、適應(yīng)證廣泛、不良反應(yīng)少和經(jīng)濟簡便等［4-6］。

丹紅提取物具有活血化瘀和通脈舒絡(luò)等作用，目前已有研究［7］指出，丹紅提取物可對脊髓型頸椎病的患者有一定治療作用，但是具體機制并未見詳細報道。

本研究構(gòu)建大鼠脊髓型頸椎病模型，觀察丹紅提取物對大鼠的行動狀態(tài)、炎性細胞因子和凋亡相關(guān)蛋白的影響，探討丹紅提取物緩解脊髓型頸椎病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，8～10周齡，雌雄各半（雌雄均分開喂養(yǎng)），購自河北省中醫(yī)院實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品：丹紅提取物由中國藥科大學(xué)提供。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）購自上海麥倉生物技術(shù)有限公司。ELISA檢測試劑盒購自上海麗臣商貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建：將實驗動物分為3組，對照組、模型組和實驗組（中藥治療組），每組各10只。除正常對照組外，其余大鼠均在頸椎間盤后緣植入BMP與載體的復(fù)合制劑，以使椎間盤組織退變、骨化，并對頸段脊髓造成慢性壓迫，制成理想的脊髓型頸椎病動物模型［8］。用10%水合氯醛（300 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，碘伏消毒，于頸前正中偏右做縱行切口，長約2～3 cm，顯露椎體前方及椎間隙。在X線引導(dǎo)下，確認頸C4～5椎間隙，向椎間隙注入BMP 0.1 mL后縫合。于造模成功后第2天開始給藥，實驗組以5.6 mL/（kg·d）的劑量給予丹紅提取物［9］，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水，共給藥4周。

1.2.2 改進Rivlin斜板試驗：將大鼠以正、反2個方向置于可調(diào)節(jié)橡膠面斜板上，分別測定其在斜板上停留10 s的最大傾斜角度，2個方向的角度取平均值得到該動物斜板試驗的功能角度。每只大鼠測3次，取平均值。

1.2.3 ELISA：將取出的椎間盤組織沖洗干凈，用濾紙吸干水分，稱重后剪碎，每100 mg組織加入1 mL PBS稀釋，勻漿后離心取上清液。按照試劑盒說明書進行實驗操作，最后于450 nm處測定吸光度后計算結(jié)果。

1.2.4 Western blotting：將取出的椎間盤組織沖洗干凈，用濾紙吸干水分，稱重后剪碎，每100 mg組織加入1 mL RIPA裂解提取蛋白。提取蛋白后，每個樣本取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳、電泳結(jié)束后100 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗（1∶200）4℃過夜，二抗（1∶1 000）室溫1 h。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、bcl-2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體以及相關(guān)二抗均購自SANTA公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，差異性檢驗使用非配對t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹紅提取物對脊髓型頸椎病大鼠運動功能的影響

構(gòu)建大鼠脊髓型頸椎病模型后，對照組、模型組和實驗組大鼠分別進行改進Rivlin斜板實驗，通過斜板度數(shù)對大鼠的運動功能進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后模型組和實驗組大鼠的斜板度數(shù)均顯著低于對照組，說明實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。丹紅提取物治療4周后的大鼠斜板度數(shù)明顯高于模型組，說明丹紅提取物可以緩解脊髓型頸椎病導(dǎo)致的大鼠運動功能障礙，見表1。

表1 大鼠給藥前后Rivlin斜板度數(shù)Tab.1 Rivlin oblique plate number degree of rats before and af?ter administration

表1 大鼠給藥前后Rivlin斜板度數(shù)Tab.1 Rivlin oblique plate number degree of rats before and af?ter administration

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Group n Before After 4 weeks Control 10 56.98±2.17 58.12±2.01 Model 10 35.54±1.141） 32.22±0.781）Experiment 10 36.02±1.211），2） 50.57±2.311），2）

2.2 丹紅提取物對脊髓型頸椎病大鼠炎性細胞因子表達的影響

模型組和實驗組大鼠的IL-6和TNF-α表達均高于對照組大鼠（P＜0.05），實驗組大鼠經(jīng)丹紅提取物治療4周后IL-6和TNF-α表達明顯低于模型組（P＜0.05）。說明丹紅提取物可以降低脊髓型頸椎病大鼠模型炎性細胞因子的釋放，在一定程度上緩解脊髓型頸椎病，見表2，圖1。

表2 3組大鼠椎間盤組織中IL?6和TNF?α的含量Tab.2 The expression of IL?6 and TNF?α in the intervertebral disc of different groups

表2 3組大鼠椎間盤組織中IL?6和TNF?α的含量Tab.2 The expression of IL?6 and TNF?α in the intervertebral disc of different groups

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Group n IL-6 TNF-α Control 10 0.56±0.04 0.73±0.07 Model 10 1.31±0.131） 1.44±0.241）Experiment 10 0.94±0.091），2） 0.87±0.111），2）

2.3 丹紅提取物對脊髓型頸椎病大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖1 3組大鼠椎間盤組織中IL?6和TNF?α的表達情況Fig.1 The expression of IL?6 and TNF?α in the intervertebral disc of different groups

模型組和實驗組大鼠的bcl-2表達均低于對照組大鼠（P＜0.05），實驗組大鼠經(jīng)丹紅提取物治療4周后bcl-2的表達明顯高于模型組（P＜0.05）。說明丹紅提取物可以減少脊髓型頸椎病大鼠模型凋亡蛋白bcl-2的表達，見表3，圖2。

表3 3組大鼠椎間盤組織中bcl?2含量Tab.3 The expression of bcl?2 in the intervertebral disc of differ?ent groups

表3 3組大鼠椎間盤組織中bcl?2含量Tab.3 The expression of bcl?2 in the intervertebral disc of differ?ent groups

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

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圖2 3組大鼠椎間盤組織中bcl?2的表達情況Fig.2 The expression of bcl?2 in the intervertebral disc of differ?ent groups

3 討論

中醫(yī)藥治療脊髓型頸椎病的手段有很多，主要有中藥內(nèi)服外敷、針刺、牽引、穴位注射、艾灸和聯(lián)合應(yīng)用多種治療手段的綜合療法等。其中中藥內(nèi)服外敷是最主要的治療方式。詹運開［10］通過對40例脊髓型頸椎病患者采用活絡(luò)效靈湯內(nèi)服治療后的效果進行觀察，發(fā)現(xiàn)藥物治療有效率為87.6%，證明中藥活絡(luò)效靈湯對于脊髓型頸椎病有很好的治療效果。很多研究證實，中藥可以改善脊髓型頸椎病患者的血液循環(huán)，消除炎癥，減少神經(jīng)細胞壞死及凋亡，調(diào)節(jié)酶活性，清除自由基損害，減少NO生成，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子含量。

脊髓型頸椎病可以導(dǎo)致運動功能的障礙［11-12］，大鼠的改良Rivlin斜板實驗結(jié)果顯示，大鼠脊髓型頸椎病模型構(gòu)建成功后模型組大鼠的斜板度數(shù)明顯降低，經(jīng)丹紅提取物治療4周后斜板度數(shù)升高明顯，與模型組對照差異顯著（P＜0.05），這說明丹紅提取物對脊髓型頸椎病大鼠的運動功能的恢復(fù)可有一定作用。

IL-6和TNF-α均是炎性細胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多個過程，可以促進炎癥反應(yīng)中的白細胞附壁、血管通透性增加、滲出等過程。脊髓型頸椎病中椎間盤組織中的IL-6和TNF-α可引起炎癥細胞的聚集，加速頸椎間盤的退變［13］。本研究在脊髓型頸椎病造模后的模型大鼠椎間盤中檢測出的IL-6和TNF-α含量均高于正常大鼠，印證了脊髓型頸椎病可以促進炎性細胞因子的釋放，經(jīng)過治療后的實驗組大鼠椎間盤中的IL-6和TNF-α表達含量有所下降，這說明丹紅提取物可以通過降低炎性細胞因子的釋放來對脊髓型頸椎病起到治療作用。

近年來各種研究［14-15］表明脊髓在缺血損傷以及創(chuàng)傷后均可發(fā)生一定程度的細胞凋亡現(xiàn)象，脊髓型頸椎病可以導(dǎo)致細胞凋亡的產(chǎn)生。有研究者在脊髓型頸椎病大鼠模型中通過TUNEL標記法及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)有大量膠質(zhì)細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因bcl-2的表達下調(diào)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)模型構(gòu)建成功后大鼠椎間盤內(nèi)的bcl-2表達明顯下調(diào)，在丹紅提取物治療后bcl-2的表達有所上升，說明凋亡情況得到了緩解，從另一個角度說明丹紅提取物可以緩解脊髓型頸椎病。

本研究表明，丹紅提取物可以在一定程度上緩解脊髓型頸椎病，為臨床上脊髓型頸椎病的治療提供了更多的選擇與理論基礎(chǔ)。

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（編輯 于 溪）

Mechanism of Dan Hong Treatment of Cervical Spondylotic Myelopathy

YANG Jiaxiang1，YANG Huanwei2，DONG Junge1，YU Jian3，HU Yanan4，LIANG Jun5，TANG Yange6

（1.Department of Orthopaedics，Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Respiration，Qinhuangdao City Chinese Medicine Hospital，Qinhuangdao 066000，China；3.Department of Orthopaedics of Hebei Provincial Hospital，Shijiazhuang 050000，China；4.Department of Surgery，Baoding City Children’s Hospital，Baoding 071000，China；5.Dawu Health Center，Pingshan Country，Shijiazhuang 050408，China；6.Department of Endocrinology，Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic mechanism of Dan Hong in a rat model of cervical spondylotic myelopathy（CSM）.Meth?odsThirty Sprague-Dawley rats were divided into an experimental group（n=10），a CSM model group（n=10），and a control group（n=10）. The CSM model group

a Dan Hong injection，while the control and experimental groups received an injection of an equivalent volume of physiological saline.The motor function of the rats was assessed before administration and at 4 weeks after administration，at which time the rats were sacrificed.The expression of cytokines and bcl-2 was detected by ELISA and Western blotting.ResultsFour weeks after treatment，the number of oblique plates in the experimental group increased.Additionally，the expression of cytokines（IL-6 and TNF-α）in the CSM model group was higher and the expression of bcl-2 was lower.ConclusionDan Hong injection can reduce the inflammatory response and reduce cell apoptosis in CSM.

Dan Hong；cervical spondylotic myelopathy；inflammation；apoptosis

R681

A

0258-4646（2017）08-0710-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.009

河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃（2016030）

楊家祥（1982-），男，主治醫(yī)師，碩士.

唐艷閣，E-mail：148059182@qq.com

2017-01-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：