孫祥榮,許 可,劉曙東
TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患病的相關(guān)性研究
孫祥榮,許 可,劉曙東
目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP-3)啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。方法 選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例(病例組),同時(shí)選取健康自愿者400名作為對照組。分析TIMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)-915位點(diǎn)(rs2234921)多態(tài)性。結(jié)果 TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)-915位點(diǎn)(rs2234921)PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后,有3種基因型,包括GG型、AG型和AA型;病例組和對照組基因型及等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%,明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)-915位點(diǎn)(rs2234921)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死易感性有關(guān),有望成為高危人群篩選標(biāo)志以及干預(yù)靶點(diǎn)。
腦梗死;動(dòng)脈粥樣硬化;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3;基因多態(tài)性
動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生發(fā)展,可以導(dǎo)致病人腦血管的阻塞,進(jìn)而導(dǎo)致腦梗死或者腦出血的發(fā)生,臨床預(yù)后較差。流行病學(xué)研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病率接近0.06%~0.16%,在部分地區(qū)的發(fā)病率可進(jìn)一步上升[1]。 基礎(chǔ)研究顯示,基因水平的變化對于腦梗死的發(fā)生具有重要的影響,相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或者調(diào)節(jié)水平活性的改變,可以通過促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,促進(jìn)脂質(zhì)或者泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)皮組織中的沉積,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的進(jìn)展[2- 3]?;|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(matrix metalloproteinase 3,TIMP-3)可以影響到動(dòng)脈血管內(nèi)皮組織中膠原成分的降解,促進(jìn)單核細(xì)胞的浸潤等,進(jìn)而參與到腦梗死的發(fā)生過程中[4-6]。為了進(jìn)一步揭示TIMP-3的基因多態(tài)性對于腦梗死發(fā)生的影響,本研究選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例,探討TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性。
1.1 一般資料 選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例(病例組),其中男性221例,女性173例;年齡43歲~84歲(65.40歲±8.79歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):診斷符合缺血性卒中診治指南中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2];均經(jīng)頭顱CT、MRI確診;均為初次發(fā)病,相互間無血緣關(guān)系;病人及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):有癥狀性腦梗死、梗死后出血和腦出血;有系統(tǒng)性炎性疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病、結(jié)核、腫瘤性卒中等。同時(shí)選取健康自愿者400名(對照組),男性244名,女性156名,年齡41歲~82歲(64.84歲±10.22歲)。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
1.2 檢測方法 取凍存的血清保存液體,按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離,每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿,進(jìn)行裂解操作,4 ℃冰水采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌,再次10 000 r/min離心5 min,得到RNA。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3 min,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL,37 ℃水浴60 min,室溫放置5 min使其完全溶解,使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版,在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP,使得總體積達(dá)20 μL,上機(jī),反應(yīng)條件為:93℃2 min、93℃ 1 min。
2.1 基因型分析 TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)-915位點(diǎn)(rs2234921)PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后,有3種基因型,包括GG型、AG型和AA型。詳見圖1。
注:M為DNA標(biāo)記物;1,5為GG型;2,4為GA型;3為AA型
圖1 電泳結(jié)果
2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 病例組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),說明病例組和對照組樣本具有代表性。詳見表1。
表1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)
2.3 兩組基因型及等位基因比較 病例組和對照組基因型及等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%,明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表2。
表2 兩組基因型及等位基因分布比較 例(%)
腦血管或者頸部動(dòng)脈血管內(nèi)皮的長期損傷,影響到了內(nèi)皮細(xì)胞的正常代謝,導(dǎo)致脂質(zhì)細(xì)胞、低密度脂蛋白或者三酰甘油的沉積,血管內(nèi)皮的粥樣硬化性改變較為明顯,血管的狹窄較為嚴(yán)重。一項(xiàng)匯集了192例樣本量的臨床隨訪研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的腦梗死發(fā)生占到了各種病因腦梗死的35%以上,且其病情進(jìn)展較為迅速,病人病死率較高,遠(yuǎn)期致殘率或者生存預(yù)后較差[7-8]。而對于腦梗死病人相關(guān)基因表達(dá)水平的生物學(xué)標(biāo)志物研究,可以為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的基因治療提供理論依據(jù),并可以為揭示腦梗死的發(fā)病機(jī)制提供參考。
TIMP-3作為蛋白酶抑制劑家族成員,其持續(xù)性的活化或者轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的上調(diào),在影響到動(dòng)脈血管內(nèi)皮的過氧化損傷、加劇細(xì)胞炎癥因子的浸潤,黏附低密度脂蛋白等方面,均發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。TIMP-3的啟動(dòng)子水平的多態(tài)性演變,在調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄活性,影響到沉默子的表達(dá)等方面具有一定的作用,最終可以影響到TIMP-3蛋白的表達(dá)參與到多種生物進(jìn)程中[9- 10]。TIMP-3在心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的發(fā)生中具有一定的積極作用,已有研究探討了TIMP-3在促進(jìn)急性冠脈綜合征發(fā)生中的作用,認(rèn)為高表達(dá)的TIMP-3可以加劇病人心肌細(xì)胞的缺血程度[11-12],但對于TIMP-3多態(tài)性在腦梗死中的研究不足。兩組病例中的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),提示兩組基因型表達(dá)中G及A位點(diǎn)的表達(dá)符合正太分布規(guī)律,無異常突變導(dǎo)致的臨床資料的選擇偏倚產(chǎn)生,提示了本次研究的科學(xué)性。
在本次研究中, TIMP-3擴(kuò)增后進(jìn)行分析,可以發(fā)現(xiàn)其主要包括3種基因型,GG型、AG型和AA型,提示G基因型的表達(dá)或者A基因型的可能是促進(jìn) TIMP-3對于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要因素,G基因型的表達(dá)或者A基因型多態(tài)性位點(diǎn)的變化,可以在影響到TIMP蛋白羧基末端的轉(zhuǎn)錄活性,改變其四級空間結(jié)構(gòu)的修飾,或者通過磷酸化進(jìn)而影響到TIMP的生物活性,加劇其對于粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)作用。鄭周等[13-14]前瞻性收集分析研究了82例樣本,發(fā)現(xiàn)G基因型的異常表達(dá)或者等位位點(diǎn)的異常,是加劇腦梗死病人腦組織缺血性壞死的重要因素,且G基因型的位點(diǎn)突變效應(yīng)越為明顯,腦梗死病人遠(yuǎn)期的生存預(yù)后越差,相關(guān)性較為顯著,這與本研究的結(jié)論較為相似。另外,更為重要的是,在分析不同等位基因的表達(dá)過程中,本研究發(fā)現(xiàn)病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%,均明顯高于其他基因型,特別是A基因型或者等位基因,提示GG或者G等位基因的表達(dá),是促進(jìn)粥樣硬化性腦梗死發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素,GG或者G等位基因的表達(dá)可以在下列因素方面影響到腦梗死的發(fā)生:①GG或者G等位基因的高表達(dá),加劇了TIMP-3蛋白對于Ⅳ型膠原纖維蛋白的降解作用,影響到了動(dòng)脈血管的中層結(jié)構(gòu),導(dǎo)致血管容易發(fā)生破裂出血或者栓塞;②GG或者G等位基因在抑制啟動(dòng)子序列中不同可轉(zhuǎn)錄區(qū)的活性上,具有顯著的影響,持續(xù)性的啟動(dòng)子區(qū)域的激活效應(yīng),上調(diào)了下游脂質(zhì)代謝紊亂的可能性,特別是低密度脂蛋白的代謝異??梢赃M(jìn)一步影響到腦梗死的發(fā)生。
綜上所述,TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)-915位點(diǎn)(rs2234921)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死易感性有關(guān),有望成為高危人群篩選標(biāo)志以及干預(yù)靶點(diǎn)。
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(本文編輯王雅潔)
川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院( 四川南充 637099),E-mail:yangshuangyanoi@163.com
信息:孫祥榮,許可,劉曙東.TIMP-3啟動(dòng)子區(qū)基因的多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患病的相關(guān)性研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2017,15(15):1930-1932.
R743.33 R255.2
B
10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.040
1672-1349(2017)15-1930-03
2017-06-08)