大約克種豬抗腹瀉新品系導(dǎo)入新血緣

龍清孟，熊勝利，代興洪，馮文武，侯 萍，金 敏，王錦鳳，龔 菲，申金蓉，冉雪琴（.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 55008；.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 55005）

大約克種豬抗腹瀉新品系導(dǎo)入新血緣

龍清孟1，熊勝利1，代興洪1，馮文武1，侯 萍1，金 敏1，王錦鳳1，龔 菲1，申金蓉1，冉雪琴2（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550018；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

引起斷奶前后仔豬腹瀉的主要致病菌是豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC），而F4ac型是ETEC中流行性最為廣泛的類型。試驗在貴州省種畜禽測定中心種豬場內(nèi)進(jìn)行，試驗豬群為已經(jīng)選育出的美系大約克抗腹瀉專門化新品系，試驗?zāi)康氖菍σ呀?jīng)培育出的美系大約克抗腹瀉專門化新品系，導(dǎo)入加系大約克血緣，避免新品系在閉鎖選育中出現(xiàn)近親衰退。2016年7月引種，9月9日對引進(jìn)的22頭加系大約克種豬采樣，送往貴州大學(xué)動物科學(xué)院對豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13進(jìn)行基因型鑒別。結(jié)果顯示，GG基因型頻率為13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率0.477 3、A基因頻率0.522 7。在保留引進(jìn)加系大約克血統(tǒng)需要的前提下，將腹瀉抗性基因GG型個體直接選入美系大約克抗腹瀉新品系群體，同時，盡可能保留繁殖性能較為優(yōu)秀的GA、AA基因型個體，與原有的美系抗腹瀉種豬按照不同選配組合方案進(jìn)行配種：GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀，在世代選育中逐漸加大后代腹瀉抗性有利基因型GG個體選留力度，將腹瀉抗性有利基因GG型個體選入抗腹瀉新品系中，最終實現(xiàn)腹瀉抗性有利基因血緣更新，并純繁推廣。

引進(jìn)加系；大約克種豬；抗腹瀉基因；腹瀉抗性新品系；導(dǎo)入新血緣

腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac是引發(fā)新生仔豬和斷奶前仔豬腹瀉的最主要致病菌[1-2]。F4ac型是腸毒素性大腸桿菌ETEC（F4）菌毛3種血清型（F4ab型、F4ac型、F4ad型）中致病性最強(qiáng)、流行性最廣的一類[3-4]。在世界范圍內(nèi)，腸毒素性大腸桿菌（ETEC）感染導(dǎo)致的仔豬腹瀉每年都給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。在養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的瑞典、英國和丹麥，新生仔豬腹瀉的發(fā)生率分別為75.0%、50.5%和36.6%[7-8]。我國仔豬腹瀉的發(fā)生率也很高，2012年對國內(nèi)某省4 118個養(yǎng)豬場戶進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率高達(dá)18.31%、死亡率在10.44%～57.01%之間[9-10]。早年在豬流行性腹瀉病毒還沒被大量報道之前，我國仔豬腹瀉的發(fā)生率全年平均高達(dá)46.5%[11]，個別地區(qū)甚至更高。近年來更是出現(xiàn)豬流行性腹瀉病毒和ETEC混合感染導(dǎo)致仔豬大面積發(fā)生腹瀉和死亡的事件。因此，進(jìn)行腸毒性大腸桿菌（ETEC）F4ac腹瀉基因的選育，培育抗腹瀉新品系，可以從種源上最大限度控制新生仔豬及斷奶前仔豬的腹瀉發(fā)生率，從而提高豬場的經(jīng)濟(jì)效益和國外引進(jìn)種豬的使用價值。

本中心豬場曾對引進(jìn)美國大約克種豬基礎(chǔ)豬群采耳樣組織，送往江西農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行抗腹瀉基因檢測研究，結(jié)果顯示，大約克種豬在MUC13基因的腹瀉抗性等位基因GG型的頻率為16.79%（23/137），G基因頻率為0.46，腹瀉易感不利等位基因（A）基因頻率為0.54[12-13]。這一檢測結(jié)果表明，利用分子育種技術(shù)輔助育種，兼顧選留表型和生產(chǎn)性能優(yōu)秀個體，逐世代加大GG純合抗性個體的選留比例，逐步淘汰AA和AG易感基因型個體，可使育種豬群中有利基因頻率提高，最終建立抗K88（F4ac）腹瀉專門化品系。近年來，測定中心的技術(shù)人員，致力于研究國外引進(jìn)種豬抗性新品系的培育工作及推廣應(yīng)用。種豬場在世代選育中采用抗腹瀉基因檢測技術(shù)，保留腹瀉抗性有利基因GG型個體，組建核心群種豬抗腹瀉新品系，建立大約克種豬抗腹瀉選育示范點。測定中心技術(shù)人員開展了大約克種豬6個不同基因型的組合配種方案：GG♂×GG♀、GA♀×GG♂、GA♂×GA♀、AA♂×GG♀、AA♂×GA♀、AA♂×AA♀，在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下，跟蹤觀察其哺乳仔豬腹瀉發(fā)生率、腹瀉致死率、其他原因致死率、斷奶成活率，結(jié)果表明，不同組合選配所生仔豬在哺乳期間的腹瀉發(fā)生率相應(yīng)為2.71%、26.44%、46.18%、30.32%、40.96%、44.14%，其后代腹瀉致死率相應(yīng)為0、3.07%、6.49%、3.94%、11.65%、12.5%，其哺乳仔豬其他原因致死率相應(yīng)為0.78%、1.92%、2.67%、1.97%、4.42%、5.08%，其斷奶成活率相應(yīng)為 99.22%、95.02%、90.84%、94.09%、83.94%、82.42%[12]。研究表明，組合選配優(yōu)秀情況依次為GG♂×GG♀>GA♀× GG♂>AA♂×GG♀>GA♂×GA♀>AA♂×GA♀>AA♂×AA♀。在初步建立大約克抗腹瀉新品系的基礎(chǔ)上，2016年7月引進(jìn)加系大約克種豬22頭，導(dǎo)入新血緣。引進(jìn)種豬抗腹瀉基因檢測及不同基因型個體選配計劃如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心2016年7月新引進(jìn)的5月齡加系大約克種豬22頭，在隔離觀察期滿、健康檢查各項指標(biāo)合格后，9月9日采用前腔靜脈采血（22份），送貴州大學(xué)動物科學(xué)院冉雪琴教授的實驗室進(jìn)行抗腹瀉基因的檢測研究。每份血樣10 mL（全血），于離心管中-20℃保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒制備基因組DNA，作為PCR檢測的模板。

1.2 主要試驗儀器設(shè)備

①離心機(jī)（Avanti-J30I），美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)；②制冰機(jī)（banshen），美國Grant公司生產(chǎn)；③凝膠成像系統(tǒng)（GelDocXR），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；④熒光定量PCR儀（MyCycler），美國Bio-rad公司生產(chǎn)；⑤標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺（SW-CJ-IFD），上海錦星科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；⑥電泳儀（DYY．III2穩(wěn)壓電泳儀），北京六一儀器廠生產(chǎn)；⑦-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司生產(chǎn)；⑧水浴恒溫鍋（SHZ-82），中國金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的豬MUC13基因序列設(shè)計4條特異性引物（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，基因組DNA（100 ng/μL）1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足10 μL體積。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 試驗結(jié)果

2.1 基因型檢測結(jié)果

將電泳得到的83 bp條帶定為G基因，173 bp條帶定為A基因；那么只有1條173 bp條帶的樣品則定義為AA基因型個體，只有1條83 bp條帶的樣品則定義為GG基因型個體，而既有173 bp條帶、又有83 bp條帶的樣品則為雜合的AG基因型。圖1為AA基因型和GG基因型檢測結(jié)果。

圖1 引進(jìn)加系大約克種豬抗腹瀉有利基因GG型及易感基因AA型

2.2 克隆測序

將得到的173 bp和83 bp兩種條帶分別切膠回收，連接T-載體，送基因公司克隆測序。根據(jù)峰的移動位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，證實擴(kuò)增片段確為MUC13基因，位于內(nèi)含子7當(dāng)中，并證實相應(yīng)位置的堿基確為G或A。

2.3 引進(jìn)加系大約克種豬抗腹瀉基因檢測結(jié)果

由表2可知，GG型個體3頭（1公2母），GA型個體15頭（全部為母豬），AA型個體4頭（1公3母）。

表2 22頭新引進(jìn)的5月齡加系大約克種豬抗腹瀉基因檢測結(jié)果及選配計劃

2.4 MUC13基因的基因型頻率和基因頻率

由表3可知，新引進(jìn)的5月齡加系大約克GG基因型13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/ 22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率47.73%、A基因頻率52.27%。

表3 新引進(jìn)22頭加系大約克豬MUC13基因的基因型頻率和基因頻率

3 分析與討論

3.1 抗性新品系建立后導(dǎo)入新的血緣

在純種繁育場已建立健全血統(tǒng)、系譜完整的抗性新品系，并且在抗腹瀉新品系穩(wěn)定的情況下，通過引種導(dǎo)入新血緣，避免重蹈閉鎖選育的覆轍。

（1）首先，通過對引進(jìn)加系大約克種豬的檢測，明確豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13的基因型。

本次研究結(jié)果顯示，引進(jìn)加系大約克種豬在MUC13基因GG基因型頻率13.64%（3/22）、GA基因型頻率68.18%（15/22）、AA基因型頻率18.18%（4/22），G基因頻率0.477 3、A基因頻率0.522 7，這一檢測結(jié)果與美系大約克種豬GG基因型頻率為16.79%（23/137）、GA基因型頻率59.12%（81/137）、AA基因型頻率24.10%（33/137），G基因頻率為0.46、A基因頻率為0.54[12-13]的結(jié)果基本一致。

（2）其次，在明確豬群受體MUC13基因型的基礎(chǔ)上，優(yōu)先考慮選配方案為GG♂×GG♀。

在考慮引進(jìn)種豬的血統(tǒng)、繁殖性能、表型等指標(biāo)的前提，將新引進(jìn)加系大約克與原有美系大約克或新引進(jìn)加系之間，按照GG♂×GG♀選配，加大世代抗腹瀉基因GG型個體選育力度，每年根據(jù)血統(tǒng)需要選留體型外貌、生產(chǎn)性能等優(yōu)秀的個體作為后備種豬，進(jìn)入腹瀉抗性新品系群體。

（3）再次，將新引進(jìn)加系大約克與原有美系大約克、或加系與加系豬、美系與美系之間依次考慮GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♀×AA♂、GA♂×AA♀、GA♂×GA♀等配種方案。

依據(jù)前人的研究結(jié)果和我們的檢測分析，對后備種豬和基礎(chǔ)種豬進(jìn)行選擇時，選育時首先把生產(chǎn)性能、體型外貌都表現(xiàn)優(yōu)秀的GG基因型個體作為種公豬和種母豬進(jìn)行擴(kuò)繁。本研究根據(jù)生產(chǎn)需要，盡可能保全豬場血統(tǒng)，對繁殖性能、體型外貌優(yōu)秀的GA型、AA型個體，可考慮采用GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、AA♂×GG♀、GG♂×AA♀、GA♂×GA♀等配種方案，最終選留到抗腹瀉基因GG型優(yōu)秀個體，再逐步淘汰基因GA型、AA型個體。

3.2 大約克種豬腹瀉抗性新品系的選育需要足夠長的時間

測定中心對自己豬場繁殖群的研究表明，豬腸毒素性大腸桿菌（ETEC）F4ac的受體基因MUC13抗腹瀉有利基因GG基因型頻率和G基因頻率大約克繁殖群分別為16.79%（23/137）、0.47；在杜洛克繁殖群分別高達(dá)86.05%（37/43）、0.92；而在長白豬繁殖群中分別為40.74%（11/27）、0.47[13]。這一結(jié)果說明，在抗腹瀉有利基因GG基因型頻率和G基因頻率上，大約克豬群<長白豬群<杜洛克豬群，在世代選育中，大約克比長白豬群、杜洛克豬群較難選育出純合腹瀉抗性GG型個體，完全建立抗腹瀉新品系的時間相對較長。

純種大約克抗腹瀉新品系在世代選育中，需要考慮保全種豬血統(tǒng)、兼顧生產(chǎn)性能及表型等指標(biāo)。因此，在兼顧種豬血統(tǒng)、生產(chǎn)性能、體型外貌選育基礎(chǔ)上，不僅需要保留抗腹瀉有利基因GG型個體，同時有必要將生產(chǎn)性能、體型外貌都表現(xiàn)優(yōu)秀的腹瀉易感基因型GA、AA型個體先保留下，按照GG♂×GA♀、GA♂×GG♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀、GA♂×GA♀等選配組合，最終選育出該血統(tǒng)抗腹瀉GG型后代作為后備種豬，再逐步淘汰腹瀉易感基因型GA型父本、母本，建立血統(tǒng)較為完善的新品系。對以上5個組合選配的后代，如果采用整窩仔豬都作抗腹瀉基因檢測，那么，檢出GG型的個體長大后也不一定能作為后備豬，這一方法增加了新品系選育的成本；如果是按照常規(guī)選育選留后備豬，再對選留后備豬采樣作抗腹瀉基因檢測，所選留的豬不一定都檢出抗腹瀉基因GG型個體，可能只有一定比例的后備豬檢出抗腹瀉GG型，所以采用這種選育方案就需要選留足夠數(shù)量的后備豬，因為不一定在F1代中檢出GG型個體，可能在F2代甚至F3代中才能選留到抗腹瀉基因型GG個體作為后代。因此，大約克多個血統(tǒng)抗腹瀉新品系的選育，需要相對足夠長的時間（3～6年），才能圓滿完成選育研究任務(wù)。

3.3 雜交利用

抗性新品系進(jìn)行雜交利用，其后代的腹瀉抗性情況有待于進(jìn)一步深入研究。

[1]唐建紅，鄧政，林峰，等.抗仔豬斷奶前腹瀉豬專門化新品系的培育[J].豬業(yè)科學(xué)，2013（10）：102-105.

[2]Kolotilin I,Kaldis A,Devriendt B,et al．Production of a subunit vaccine candidate against porcine post-weaning diarrhea inhigh-biomass transplastomic tobacco[J].PLoS One,2012,7(8): e42405.

[3]Joller D,Jorgensen C B,Bertschinger H U,et al.Vogeli P Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13[J].Animal Genetics,2009,40(5): 749-752.

[4]Ren J,Yah X,Ai H,et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs[J].PLoS One,2012,7(9):e44573.

[5]Zhang Francis D H.Genetic fusions of heat-labile toxoid(LT) and Heat-stable toxin b(STb)of porcine enterotoxigenic Escherichiacolielicitprotectiveanti-LTandanti-STbantibodies[J]. Clinical and Vaccine Immunology,2010,l7(8):1223-1231.

[6]Zanello G Berri M,Dupont J,et al.Saccharomyces cerevisiae modulates immune gene expressions and inhibits ETEC mediated ERK1/2 and p38 signaling pathwaysinintestinal epithelial ceils[J].PLoSOne,2011,6(4):e18573.

[7]Pearce G P.Epidemiology of entericdisease in grower-finisherpigs:apostal surveyof pig producers inEngland[J].The Veterinary record,1999,144:338-342.

[8]Johansen M,Alban L,Kj?rsgaard H D,et al.Factors Influencing the Weight Gain of Piglets[C]//Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress.(Iowa,U.S.A), 2002,1:227.

[9]趙明軍，閏若潛，盛敏，等.仔豬腹瀉病流行形勢與防控措施[J].養(yǎng)豬，2013（2）：109-110.

[10]龍清孟，熊勝利，龔菲，等.從規(guī)?；i場仔豬死亡數(shù)據(jù)分析研究提高仔豬成活率對策[J].豬業(yè)科學(xué)，2014（8）：113-116.

[11]王紅寧.仔豬腹瀉成因及綜合防治技術(shù)措施[J].中國畜牧雜志，2006，42（6）：58-60.

[12]熊勝利，龍清孟，陳大芳，等.對引進(jìn)美國SPF大約克種豬抗腹瀉后代選育探討[J].養(yǎng)豬，2013（5）：49-50.

[13]熊勝利，龍清孟，陳大芳，等.抗病育種技術(shù)在引進(jìn)美國SPF種豬后代選育中應(yīng)用探究[J].養(yǎng)豬，2014（3）：73-74.

（感謝貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院冉雪琴教授對項目研究的大力幫助！）

（編輯：富春妮）

白面包和全麥面包哪個更好

【美國《發(fā)現(xiàn)》月刊網(wǎng)站6月6日文章】題：面包之爭：工業(yè)白面包還是手工全麥面包？（作者 卡爾·恩格爾金）

做三明治時更加健康的選擇是哪個：工業(yè)加工的白面包，還是手工制作的全麥面包？

對于想知道這種熱烈爭論的問題明確而且非黑即白答案的人，我們要先表示歉意。答案是兩個都好，因人而異。

這個結(jié)論來自以色列的魏茨曼科學(xué)研究所，該研究所近期對比了吃白面包或全麥面包以獲得大量卡路里的飲食方式的短期健康影響。在隨機(jī)化的試驗中，科學(xué)家要求20名健康的人增加一周的面包攝入量—從每天占卡路里攝入量的10%提升到占25%。一半的參與者食用工業(yè)的白面包補(bǔ)充面包攝入量，而另一半吃當(dāng)?shù)孛姘隃?zhǔn)備的全麥面包。

第一周結(jié)束后，所有參與者在所謂的清除階段的兩周內(nèi)完全不吃面包。然后再重復(fù)試驗，但這次是第一周吃白面包的人改吃全麥面包，吃全麥面包的人改吃白面包。

在每一個試驗階段之前、之中和之后，研究人員檢測了參與者的一系列健康指標(biāo)：清晨血糖水平、炎癥和組織損傷的標(biāo)記、膽固醇水平、腎和肝的各種酶以及維生素和礦物質(zhì)水平。研究人員還采集了每個人的糞便樣本，以評估每個人的微生物情況，也就是每個人肚子里的細(xì)菌。

簡而言之，每個人的結(jié)果都不同。一些人在轉(zhuǎn)變?yōu)槌园酌姘院笮玛惔x反應(yīng)變得更好，而其他人在吃全麥面包的時候表現(xiàn)更好。研究人員把整組數(shù)據(jù)放在一起平均以后，結(jié)果沒有什么用—白面包和全麥面包之間不存在臨床上具有顯著意義的區(qū)別。6日研究人員把該成果發(fā)表在《細(xì)胞-代謝》月刊上。

但是有個重要的解釋：所有參與者都攝入了同樣量的碳水化合物，而全麥面包所含的碳水化合物較少，因此表明參與者吃的全麥面包多于白面包。

該研究的作者之一亞伯拉罕·利維說：“我們沒有考慮到你會吃多少是建立在你感覺多飽的基礎(chǔ)上，所以還需要進(jìn)一步研究?！?/p>

研究人員表示，他們的研究鼓勵大家不要聽信一些不合理的理論，也不要跟從統(tǒng)一的飲食建議，而是更應(yīng)該關(guān)注每個人的不同之處。2015年，魏茨曼科學(xué)研究所的同一個團(tuán)隊要求800個人吃完全相同的東西，每個人代謝食物方式都不同。換句話說，對一個人來說健康的飲食可能對另一個人來說就不健康。

該研究的作者之一埃蘭·埃利納夫說：“迄今為止，食物的營養(yǎng)價值都是基于最基本的科學(xué)計算出來的，不存在適合所有人的單一飲食方式?！?/p>

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2017-06-17）

S828.8

A

1002-1957(2017)04-0053-04

2017-06-06收稿，2017-07-03修回

貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)課題[黔科合NY字（2012）3061號]；貴州省農(nóng)委2009年立項—引進(jìn)美國良種豬場口蹄疫、豬瘟等重大傳染性疾病防控技術(shù)研究

龍清孟（1973-），女，貴州松桃人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事引進(jìn)國外良種豬的選種選育、疫病防控與技術(shù)推廣工作. E-mail:lqingmeng@sina.com

冉雪琴（1968-），女，重慶人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向為動物生理學(xué)與分子生物學(xué).E-mail:rxueq@yahoo.com.cn