尼莫地平對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響

王琳 王濤 梁迎春 寧方波 趙芳芳 張馨娜 張磊

尼莫地平對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響

王琳 王濤 梁迎春 寧方波 趙芳芳 張馨娜 張磊

目的探究尼莫地平對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）模型大鼠腦干組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)情況影響。方法選取54只Wistar大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組6只，SAH組24只和SAH-尼莫地平組24只，使用枕大池二次注血法建立SAH模型，SAH-尼莫地平組注射尼莫地平，分別檢測(cè)三組大鼠基底動(dòng)脈的最大血流速度以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAATs）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果SAH組第1、7、14天的基底動(dòng)脈最大血流速度（Vba）顯著高于對(duì)照組，SAH-尼莫地平組第1、7天的Vba顯著高于對(duì)照組，SAH-尼莫地平組在第1、7、14天的Vba顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SAH組第1天的EAAT-1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）顯著低于對(duì)照組，第21天顯著高于對(duì)照組；SAH-尼莫地平組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的EAAT-1/GAPDH值均顯著高于對(duì)照組，第1、7、14天顯著高于SAH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SAH組第1、7天的EAAT-2/GAPDH顯著低于對(duì)照組，SAH-尼莫地平組第14、21天的EAAT-2/GAPDH顯著高于對(duì)照組，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于SAH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SAH組第1、7天的EAAT-3/GAPDH顯著低于對(duì)照組，SAH-尼莫地平組第1天的EAAT-3/GAPDH值均顯著高于對(duì)照組，第1、7天顯著高于SAH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論使用尼莫地平可有效增加大鼠腦干中EAATs的表達(dá)水平，從而緩解腦血管痙攣，治療SAH。

尼莫地平；蛛網(wǎng)膜下腔出血；谷氨酸運(yùn)轉(zhuǎn)體

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）又稱為原發(fā)性SAH，是指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，約占急性腦卒中的10%[1,2]。SAH通常還會(huì)誘發(fā)腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS），SAH具有較高的死亡率，是一種非常嚴(yán)重的常見疾病[3]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在維持正常的腦功能中起著重要作用[4]。谷氨酸通過離子型谷氨酸受體（ionotropic glutamate receptor，iG1uR）和促代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mG1uR）發(fā)揮作用，谷氨酸的清除途徑為通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamate transporter，EAATs：EAAT1、EAAT2、EAAT3）轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[5]。研究表明若谷氨酸水平過高與中樞神經(jīng)細(xì)胞受損密切相關(guān)，EAATs則可清除活化的谷氨酸使其保持在一定的水平[6]。尼莫地平是治療SAH最為常用的藥物之一，其作用方式可能與提高EAATs的水平有關(guān)，但是尼莫地平的具體作用機(jī)制尚不完全明確[7]。本實(shí)驗(yàn)通過研究尼莫地平對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠腦干組織中EAATs表達(dá)水平的影響，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

采用枕大池二次注血法制備大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型：Wistar大鼠54只，其中雌性27只，雄性27只，體質(zhì)量（250±20）g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，其中對(duì)照組6只；SAH組24只；SAH-尼莫地平組24只。每組均雌雄各半，每組大鼠體質(zhì)量、性別等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

二、方法

SAH大鼠模型的制備方法為枕大池二次注血法，使用10%的水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，劑量為0.35 mg/100 g，腹腔注射，麻醉起效后將其俯臥固定，將頭部毛發(fā)去除，使用安爾碘消毒，在眼球后靜脈叢抽取0.15 ml無抗凝自體血后向枕大池注射，48 h重復(fù)此過程，對(duì)照組則注射生理鹽水[8]。建立SAH模型后0.5 h對(duì)SAH-尼莫地平組大鼠注射尼莫地平（Bayer Vital GmbH，國(guó)藥準(zhǔn)字J20050050），劑量為0.2 mg/kg，腹腔注射，之后每日注射一次，進(jìn)行21 d。

三、觀察指標(biāo)

1.大鼠基底動(dòng)脈血流速度：使用多普勒超聲檢測(cè)基底動(dòng)脈的最大血流速度（maximum blood flow velocity of basilar artery，Vba），分別在開始注射尼莫地平的第1、7、14、21天進(jìn)行，以此來判斷大鼠CVS程度。

2.大鼠腦干組織中EAATs水平：檢測(cè)3組大鼠腦干中EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA水平，使用RT-PCR法。在進(jìn)行超聲檢查后，取腦干標(biāo)本80 mg，提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物大小700 bp，序列GAPDH-F：5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTAT GT-3′，GAPDH-R：5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGA AGTC-3′；EAAT-1引物大小572 bp，序列：EAAT-1-F：5′-CCCGGAAGAACCCCTGGGTTT-3′，EAAT-1-R：5′-GTTCATTGTCCTGGGCAATCA-3′；EAAT-2引物大小為328 bp，序列：EAAT-2-F：5′-GGGTCATGCTGG ATGGAGGT-3′，EAAT-2-R：5′-CGTGTCGTCATAAAC GGACTG-3′；EAAT-3引物大小為572 bp，序列：EAAT-3-F：5′-GACTGGGAAATATTCCGCAACT-3′，EAAT-3-R：5′-CGCACAGCGGAATGTAACTGG-3′。反應(yīng)條件：（1）變性：94℃，30 s；（2）退火：56℃，30 s；（3）延伸：72℃，30 s。其中GAPDH循環(huán)26次，EAAT循環(huán)35次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，性別以（百分?jǐn)?shù)）的形式表示，統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)；體重、Vba，EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA表達(dá)水平及EAAT-2/GAPDH值的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、3組大鼠Vba比較

與對(duì)照組相比，SAH組Vba發(fā)生了明顯變化，第1、7、14天的Vba值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第21天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，SAH-尼莫地平組第1、7天的Vba顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第14、21天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與SAH組相比，SAH-尼莫地平組在第1、7、14天的Vba值顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第21天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳細(xì)內(nèi)容見表1。

二、大鼠腦干EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA表達(dá)水平

通過核酸電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于EAAT-1，SAH組第1天的EAAT-1/GAPDH值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第14、21天顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而SAH-尼莫地平組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的EAAT-1/GAPDH值均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且第1、7、14天顯著高于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體內(nèi)容見表2。

對(duì)于EAAT-2，SAH組第1、7天的EAAT-2/ GAPDH值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而SAH-尼莫地平組第14、21天的EAAT-2/ GAPDH值均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于SAH組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體內(nèi)容見表3。

對(duì)于EAAT-3，SAH組第1、7天的EAAT-3/ GAPDH值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。而SAH-尼莫地平組第1天的EAAT-3/ GAPDH值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；并且第1、7天顯著高于SAH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體內(nèi)容見表4。

討論

CVS是SAH的常見并發(fā)癥，SAH可導(dǎo)致CVS從而阻礙腦部微循環(huán)誘發(fā)腦缺血，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。目前對(duì)于CVS的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，因此，探索CVS的發(fā)病機(jī)制對(duì)治療SAH有著重大意義[9]。目前的研究表明，CVS的發(fā)病機(jī)制可能有很多，其中主要包括一氧化氮含量降低、內(nèi)皮素-1含量的增加、氧合血紅蛋白的局部血管收縮作用、蛋白激酶C過度活化、以及離子通道的活性變化等[10]。

谷氨酸作為神經(jīng)體統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它的大量積累也是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損的關(guān)鍵因素之一，也與SAH有著密切關(guān)系[5,6]。但細(xì)胞外液中沒有可以代謝谷氨酸的途徑，谷氨酸的清除只能通過EAAT攝取，因此EAAT水平也是CVS的重要原因。EAAT有三種亞型EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3，EAAT-1、EAAT-2主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜表面，EAAT-3主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞膜表面，他們可攝取谷氨酸從而防止其神經(jīng)毒性作用[11,12]。尼莫地平是一種1,4-二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，容易透過血腦屏障，對(duì)腦組織受體有高度選擇選性[13]。它可有效地阻止鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，從而抑制平滑肌收縮，達(dá)到解除血管痙攣的目的[14,15]。

表1 3組大鼠基底動(dòng)脈的最大血流速度比較（）

表1 3組大鼠基底動(dòng)脈的最大血流速度比較（）

與對(duì)照組相比，aP＜0.05，其具體統(tǒng)計(jì)值為：ta1=7.485，P=0.000；ta2=11.635，P=0.000；ta3=4.452，P=0.000；ta4=4.982，P=0.000；ta5=8.364，P=0.000；與SAH組相比，bP＜0.05，其具體統(tǒng)計(jì)值為：tb1=3.755，P=0.004；tb2=7.326，P=0.000；tb3=6.853，P=0.000

SAH后1 d 7 d 14 d 21 d對(duì)照組6 25.42±4.26 25.67±3.56 26.36±2.86 25.73±3.75 24.76±4.53 SAH組6 25.19±4.86 40.35±2.64a155.85±3.64a234.73±4.68a325.67±6.76 SAH-尼莫地平組6 24.35±4.64 34.35±4.76a4b142.15±4.25a5b226.85±5.35b324.74±3.38組別只數(shù)SAH前

表3 3組大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-2/甘油醛-3-磷酸脫氫酶比較

表4 3組大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-3/甘油醛-3-磷酸脫氫酶比較

本研究發(fā)現(xiàn)，建立模型后，SAH組和SAH-尼莫地平組的Vba均顯著升高，說明大鼠在建模后發(fā)生了CVS，并且和SAH-尼莫地平組的流速顯著低于SAH組，說明尼莫地平的使用有效的緩解了大鼠的CVS的癥狀。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在SAH早期，SAH組的3種EAAT水平均顯著低于對(duì)照組，說明EAAT-1、EAAT-2、EAAT-3 mRNA的表達(dá)水平在SAH早期顯著下調(diào)，使得谷氨酸在細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)累積。而SAH-尼莫地平組的EAAT-1、EAAT-2以及早期EAAT-3 mRNA的表達(dá)水平顯著高于SAH組，說明尼莫地平的使用有效促進(jìn)了3種EAAT的表達(dá)，增加神經(jīng)原細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面的EAATs，增加對(duì)谷氨酸的攝取，緩解CVS并治療SAH，這與SAH-尼莫地平組的Vba顯著低于SAH組的數(shù)據(jù)具有一致性。

綜上所述，EAAT-1、EAAT-2和EAAT-3可能參與了大鼠CVS的形成，并且尼莫地平的使用可有效增加EAATs的表達(dá)水平，從而緩解CVS，治療SAH，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of nimodipine on glutamate transporter expression of SAH model rats

Wang Lin,Wang Tao,Liang Yingchun,Ning Fangbo,Zhao Fangfang,Zhang Xinna,Zhang Lei.Department of Neurosurgery,Tai’an City Central Hospital,Tai’an 271000,China

Zhang Xinna,Email:57670593@qq.com

Objective To investigate the effects of Nimodipine on the expression of glutamate transporter in the brain stem of subarachnoid hemorrhage(SAH)rats.Methods Fifty-four Wistar rats were randomly divided into control group(n=6),SAH group(n=24)and SAH-Nimodipine group(n=24). SAH model was established by injecting blood twice.The level of glutamate transporter(EAATs)mRNA and the maximal blood flow velocity of basilar artery in rats were detected by injection of Nimodipine. Results The Vba of SAH group was significantly higher than that of control group at 1,7 and 14 d(P< 0.05).The Vba of SAH-Nimodipine group was significantly higher than that of control group at 1 and 7 d (P<0.05).The Vba of 1,7 and 14 d were significantly lower than those of the control group(P<0.05). EAAT-1/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)of SAH group was significantly lower than that of control group at 1 d(P<0.05),and 21 d significantly higher than that of control group(P<0.05). The EAAT-1/GAPDH of SAH-Nimodipine group was significantly higher than that of the control group at 4 time points(P<0.05);the 1,7 and 14 d were significantly higher than SAH group(P<0.05).The EAAT-2/GAPDH of SAH group was significantly lower than that of the control group at 1 and 7 d(P<0.05),and the EAAT-2/GAPDH of SAH group was significantly higher than that of SAH group at 14 d and 21 d after SAH-Nimodipine treatment(P<0.05).The EAAT-3/GAPDH of SAH group was significantly lower than that of the control group at 1 and 7 d(P<0.05).The EAAT-3/GAPDH of SAH group wassignificantly higher than that of SAH group at 1 and 7 d after SAH-nimodipine treatment(P＜0.05). Conclusion Nimodipine can effectively increase the expression of EAATs,thereby relieving cerebral vasospasm,treatment of SAH.

Nimodipine;Subarachnoid hemorrhage;Excitatory amino acid transporters

2017-03-05）

（本文編輯：張麗）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.04.009

271000泰安，山東省泰安市中心醫(yī)院放射科

張馨娜，Email：57670593@qq.com

王琳,王濤,梁迎春,等.尼莫地平對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(4):226-229.