芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用研究＊

王東超，魏穎，高佳琪，劉一冰，屈玲霞，劉永巧，徐暾海＊＊，劉銅華

芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用研究＊

王東超1,2,3，魏穎1,2,3，高佳琪1,2,3，劉一冰1，屈玲霞1,2,3，劉永巧1,2,3，徐暾海1,2,3＊＊，劉銅華2,3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100029；3．北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京100029）

目的：探討糖痹康顆粒中主要成分芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞（Schwann Cells，SCs）的影響作用。方法：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的葡萄糖對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞的影響的研究，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培養(yǎng)時(shí)間為48 h的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)設(shè)立芍藥內(nèi)酯苷高中低組（100 μM、20 μM、4 μM），模型組，維生素C組（100 μM），正常組，利用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量和熒光顯微鏡定性觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)ROS狀態(tài)以及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，48 h后，模型組與正常組有明顯的差異P＜0.01；芍藥內(nèi)酯苷給藥組與模型組相比，P＜0.01；芍藥內(nèi)酯苷可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。通過(guò)檢測(cè)ROS熒光含量，發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷100、20、4 μM與模型組（Glu 150 mM）相比，各組P＜0.01，表明芍藥內(nèi)酯苷可以減輕雪旺細(xì)胞內(nèi)ROS，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)論：芍藥內(nèi)酯苷可以通過(guò)增加雪旺細(xì)胞增殖，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)雪旺細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

糖痹康顆粒芍藥內(nèi)酯苷雪旺細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)

糖痹康顆粒（專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?00810167551.1）主要由黃芪、桂枝、黃連、延胡索、雞血藤、黃芩、女貞子、水蛭9味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀通絡(luò)之功效，治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）具有良好的臨床效果[1-3]。雪旺細(xì)胞（SCs）是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中有利于神經(jīng)修復(fù)的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，支持和保護(hù)軸突，維持著神經(jīng)軸突的微環(huán)境，形成髓鞘，加速神經(jīng)軸突的傳導(dǎo)速度，對(duì)神經(jīng)有營(yíng)養(yǎng)作用，在周?chē)窠?jīng)損傷、再生和修復(fù)中，起著重要的作用。因此，SCs成為國(guó)內(nèi)外研究周?chē)窠?jīng)病變的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)建立高糖誘導(dǎo)SCs致氧化應(yīng)激模型，以維生素C為對(duì)照，利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡測(cè)定活性氧（ROS）含量，研究糖痹康顆粒中主要成分芍藥內(nèi)酯苷對(duì)氧化應(yīng)激SCs模型的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

Glomax multi酶標(biāo)儀（美國(guó)promega公司），HERA cell 150i CO2孵育箱（美國(guó)Thermo scientific公司），IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Sigma臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），R200D型分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；HDL型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 試藥與試劑

雪旺細(xì)胞株CRL-2942TM（美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)，ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州）；維生素C（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S05J6G1，HPLC≥99%）；Gibco?高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen公司）；澳洲胎牛血清（FBS）（美國(guó)ORIGIN公司）；青霉素-鏈霉素混合液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；胰蛋白酶-EDTA溶液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；cck-8（日本同仁化學(xué)研究所）；D（+）-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：S08J6G1，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；ROS試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20161118）；96孔板，6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Fisher scientific公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 高糖體外誘導(dǎo)Sc損傷模型的建立

在96孔板中加入100 μL的Sc細(xì)胞懸液（1× 105個(gè)/mL）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2）；鏡下觀(guān)察細(xì)胞，匯合率達(dá)到80%以上，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，分別加入葡萄糖濃度為50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、175 mM的DMEM培養(yǎng)基，加D-Glu進(jìn)行配制；每組8個(gè)復(fù)孔，設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組如下：①正常對(duì)照組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為25 mM的DMEM培養(yǎng)基；②50 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為50 mM的DMEM培養(yǎng)基；③75 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為75 mM的DMEM培養(yǎng)基；④100 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為100 m MDMEM培養(yǎng)基；⑤125 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為125 m MDMEM培養(yǎng)基；⑥150 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為150 mMDMEM培養(yǎng)基；⑦175 mM葡萄糖組：含細(xì)胞、含D-葡萄糖濃度為175 mMDMEM培養(yǎng)基。

Sc細(xì)胞在不同濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分為12、24、48、72、96 h；12、24、48、72、96 h后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行OD值的檢測(cè)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為以下幾組：高藥組：100 μM芍藥內(nèi)酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)基；中藥組：20 μM芍藥內(nèi)酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)基；低藥組：4 μM芍藥內(nèi)酯苷，150 mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)基；模型組：150 mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)基；陽(yáng)性組：100 μM維生素C，150 mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)基；正常組：正常25 mM葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基。

2.3 芍藥內(nèi)酯苷治療高糖損傷Sc細(xì)胞活性檢測(cè)

在96孔板中加入100 μL的SCs細(xì)胞懸液（1× 105個(gè)/mL）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀(guān)察細(xì)胞，匯合率達(dá)到80%以上，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每組10個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組。SCs細(xì)胞在不同藥物濃度的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48 h。48 h后，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8溶液，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行O.D值的檢測(cè)。

2.4 芍藥內(nèi)酯苷治療高糖損傷Sc細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

2.4.1 熒光顯微鏡定性檢測(cè)

在6孔板中加入2 mL的SCs細(xì)胞懸液（1× 105個(gè)/mL）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀(guān)察細(xì)胞，匯合率達(dá)到80%以上，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每組3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組。SCs細(xì)胞在不同藥物濃度的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48 h。按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4.2 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)

在6孔板中加入2 mL的SCs細(xì)胞懸液（1× 105個(gè)/mL）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5%CO2）。鏡下觀(guān)察細(xì)胞，匯合率達(dá)到80%以上，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸出，每組3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)分組。SCs細(xì)胞在不同藥物濃度的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)48 h。按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞增殖與葡萄糖濃度成濃度依賴(lài)，隨著葡萄糖濃度的增加細(xì)胞平均存活率逐漸降低，細(xì)胞增殖率降低。同一葡萄糖濃度，細(xì)胞增殖與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)表1可發(fā)現(xiàn)，濃度為175 mM葡萄糖在任何一個(gè)時(shí)間段均與正常組有顯著的差別，P＜0.01，表明該濃度對(duì)雪旺細(xì)胞造成很大損傷，不能采用該濃度。而濃度為50 mM、75 mM的葡萄糖96 h前與正常組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05），表明這兩個(gè)濃度在96 h前對(duì)雪旺細(xì)胞沒(méi)有損傷。100 mM濃度的葡萄糖在72 h才有特別明顯的細(xì)胞損傷（P＜0.01），125 mM、150 mM濃度的葡萄糖在48 h也有明顯損傷（P＜0.01），為了增加氧化損傷程度，故選擇150 mM，48 h作為模型條件[4,5]。

表1 不同葡萄糖濃度對(duì)雪旺細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（xˉ,n=6）

表2 不同葡萄糖濃度下雪旺細(xì)胞平均存活率表/%

圖1 不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞平均存活率的影響

圖2 AF干預(yù)雪旺細(xì)胞cck-8結(jié)果圖

3.2 芍藥內(nèi)酯苷治療高糖損傷雪旺細(xì)胞的活性檢測(cè)

結(jié)果表明，如圖2所示，48 h后，模型組與正常組有明顯的差異（P＜0.01）；芍藥內(nèi)酯苷100、20、4 μM組與模型組相比，P＜0.01，表明各組均可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖，減少高糖對(duì)雪旺細(xì)胞的損傷作用且高濃度促進(jìn)作用強(qiáng)于低濃度。

3.3 熒光顯微鏡觀(guān)察SCs內(nèi)ROS狀態(tài)

通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察SCs細(xì)胞內(nèi)ROS熒光狀態(tài)，可直觀(guān)觀(guān)察到模型組熒光強(qiáng)度高于正常組，表明模型可用。同時(shí)，給藥組各個(gè)熒光強(qiáng)度均弱于模型組，表明芍藥內(nèi)酯苷可以緩解SCs的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCs內(nèi)ROS含量

如圖所示，與正常組（Glu 25 mM）相比，各組P＜0.01；芍藥內(nèi)酯苷100、20、4 μM與模型組（Glu 150 mM（相比，各組P＜0.01，表明芍藥內(nèi)酯苷可以減輕雪旺細(xì)胞內(nèi)ROS，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)。

4 討論

DPN是常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但是高血糖是發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。高血糖時(shí)，細(xì)胞線(xiàn)粒體電子傳遞超負(fù)荷和血管內(nèi)皮細(xì)胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活，使ROS產(chǎn)生過(guò)量，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使促氧化與抗氧化失衡，造成細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激在DPN中的作用：①神經(jīng)細(xì)胞受損，由神經(jīng)內(nèi)膜產(chǎn)生的ROS對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有直接毒性作用；②ROS作為一種信號(hào)分子，能夠激活一系列的異常途徑的信號(hào)通路，直接或者間接作用，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損壞死或者凋亡。在高糖環(huán)境下大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞p38絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）、腫瘤壞死因子-α和可溶性血管間內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1水平上調(diào)，降低SOD，增加ROS和MDA。而且高糖在其他方面也會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的正常功能。如Lipin-1在脂質(zhì)的合成代謝及其基因表達(dá)方面占有重要角色，對(duì)骨骼肌、脂肪組織和外周神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響機(jī)體糖脂代謝[6,7]。Lipin-1缺失可導(dǎo)致胰島素抵抗、外周神經(jīng)病變、脂質(zhì)代謝異常[8]，也可引起成熟的外周神經(jīng)的神經(jīng)外膜組成成分缺失，從而影響周?chē)窠?jīng)髓鞘的形成，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢[9]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可以降低體外培養(yǎng)的SCs增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在降低細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也伴隨著Lipin-1蛋白水平的下降。NGF可以誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)合成，蛋白磷酸化，維持神經(jīng)的正常功能，也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)因子。當(dāng)神經(jīng)未受損傷時(shí)，雪旺細(xì)胞不會(huì)分泌NGF，但是當(dāng)神經(jīng)受損時(shí)，雪旺細(xì)胞就會(huì)分泌NGF，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和增生[10]。研究發(fā)現(xiàn)，NGF蛋白與其受體水平的減少在高糖刺激所引起的外周神經(jīng)損傷和修復(fù)過(guò)程中有重要作用[11]。雪旺細(xì)胞是由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化生成的膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)損傷和修復(fù)的過(guò)程中具有重要的作用。

圖3 SCs內(nèi)ROS熒光狀態(tài)

在本實(shí)驗(yàn)前期研究中，已通過(guò)CCK-8法檢驗(yàn)芍藥內(nèi)酯苷對(duì)SCs的毒性范圍是小于500 μM，并且高中低給藥濃度已做過(guò)相關(guān)機(jī)制研究，所以最終選取100、20、4 μM，對(duì)細(xì)胞活性也無(wú)影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥內(nèi)酯苷可以緩解SCs氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能與芍藥內(nèi)酯苷可以降低細(xì)胞炎性因子TNF-α和IL-1β，抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性，減少激活的p38 MAPK信號(hào)通路的研究報(bào)道相關(guān)。

圖4 各組熒光強(qiáng)度圖

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的葡萄糖對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞的影響，建立了以150 mmol·L-1D-葡萄糖，培養(yǎng)時(shí)間為48 h的氧化應(yīng)激模型，通過(guò)設(shè)立芍藥內(nèi)酯苷高中低組（100、20、4 μM），模型組，陽(yáng)性藥組（100 μM），正常組，利用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量和熒光顯微鏡定性觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)ROS狀態(tài)以及CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明芍藥內(nèi)酯苷可以改善雪旺細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，為糖痹康顆粒藥效作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

圖5 ROS流式熒光圖

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Study onAlbiflorinActivity in Protection of Schwann Cells in Rats’Sciatic Nerve

Wang Dongchao1,2,3,Wei Ying1,2,3,Gao Jiaqi1,2,3,Liu Yibing1,Qu Lingxia1,2,3, Liu Yongqiao1,2,3,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2.Key Laboratory on Health Cultivation of the Ministry of Education,Beijing 100029,China; 3.Beijing Key Laboratory of Health Cultivation,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to study the albiflorin activity of Tang-Bi-Kang(TBK)granules in protecting Schwann cells(SCs)of rat’s sciatic nerve.The establishment of SCs oxidative stress model was the condition of 150 mmol×L-1 D-glucose with different concentrations.And the incubation time was 48 h.The experiment groups were the high-dose, middle-dose and low-dose(100 μM,20 μM,4 μM)albiflorin group,the model group,the vitamin C(100 μM)group, and the normal group.Flow cytometry was used to detect the content of ROS in SCs.Fluorescence microscope was used to observe the condition of ROS fluorescence in SCs.And CCK-8 was used to detect the cell activity.The results showed that by using CCK-8 to detect cell proliferation,after 48 h,there was a significant difference between the model group and the normal group(P＜0.01);the albiflorin group compared with the model group(P＜0.01).It indicated that albiflorin can promote the proliferation of SCs.Detecting the ROS fluorescence content,it showed that compared with the model group(Glu 150 mM),the 100 μM,20 μM,and 4 μM albiflorin group,it was P＜0.01 for each group.It showed that albiflorin could relieve the ROS in SCs and alleviate oxidative stress.It was concluded that albiflorin can increase the proliferation of SCs and improve the state of oxidative stress with the protection of SCs.

Tang-Bi-Kang granules，albiflorin,Schwann cells,neuroprotection

10.11842/wst.2017.05.013

R285.5

A

（責(zé)任編輯：郭嫦娥，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-05-20

＊科學(xué)技術(shù)部國(guó)家重大新藥創(chuàng)制科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09102201-001）：治療糖尿病周?chē)窠?jīng)病變藥物糖痹康臨床前研究，負(fù)責(zé)人：劉銅華；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)—中醫(yī)藥干預(yù)糖尿病及其并發(fā)癥研究團(tuán)隊(duì)（2011-CXTD-19），負(fù)責(zé)人：劉銅華。

＊＊通訊作者：徐暾海，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥活性成分及其質(zhì)量控制研究。