腌菜中亞硝酸鹽含量的測定

謝微，陳秋娟，何星存，羅楊合，朱東建

(1.賀州學院 食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；2.賀州學院 化學與生物工程學院，廣西 賀州 542899)

腌菜中亞硝酸鹽含量的測定

謝微1，陳秋娟2*，何星存1，羅楊合1，朱東建1

(1.賀州學院 食品科學與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899；2.賀州學院 化學與生物工程學院，廣西 賀州 542899)

以α-萘胺為顯色劑，采用可見分光光度法，測定賀州市八步區(qū)幾種腌菜中亞硝酸鹽的含量。該方法的線性方程為A=1.4307C+0.0037，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，檢測限為1.5 μg/L，亞硝酸鹽回收率為94.78%～99.53%。結(jié)果顯示：該方法線性較好，操作簡便，精密度高，5個樣品中亞硝酸鹽的含量均沒有超標。

可見分光光度法；腌菜；α-萘胺；亞硝酸鹽

亞硝酸鹽俗稱工業(yè)用鹽，是一種白色或微黃色的結(jié)晶或顆粒狀粉末，無臭，味微咸澀，易潮解，并易溶于水、液氮，微溶于甲醇等有機溶劑。亞硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境中，特別是存在于食物中，比如蔬菜、糧食、肉類、魚類、蛋類都含有一定量的亞硝酸鹽[1]。亞硝酸鹽廣泛應(yīng)用于工業(yè)中，如可作防銹劑；在食品方面也有著廣泛的應(yīng)用，如在食品加工生產(chǎn)中，亞硝酸鹽可以作為增色劑和防腐劑[2]。亞硝酸鹽在工業(yè)和食品方面給人類帶來了利益和方便，但亞硝酸鹽也是一種強致癌的物質(zhì)。長期食用含有亞硝酸鹽的食物會使血液中血紅蛋白攜氧能力降低，從而引發(fā)組織缺氧，同時還可能會使血壓降低，或者血管擴張[3]。另外，亞硝酸鹽還能與胃中的含氮類物質(zhì)發(fā)生作用轉(zhuǎn)化成亞硝胺[4]。當體內(nèi)的亞硝胺含量達到一定的量時，就可以引發(fā)胃癌、食管癌和肝癌等，對人體產(chǎn)生極大的危害[5]。

長期以來，由于腌菜能夠長時間貯存，并且具有獨特的風味而廣受市民的喜愛，腌菜在市場上隨處可見。研究表明：蔬菜是一種極易富集硝酸鹽的食品，蔬菜在腌制過程中，由于微生物以及硝酸還原酶的作用，使得硝酸鹽還原成亞硝酸鹽[6]。因此，控制腌菜中的亞硝酸鹽含量很有必要。

目前測定亞硝酸鹽含量的方法有很多種，常用的方法是鹽酸萘乙二胺分光光度法[7]、催化光度法[8]、離子色譜法[9]等，這些方法靈敏度較高，但操作復(fù)雜，并且反應(yīng)條件需要嚴格控制，對環(huán)境因素也比較敏感。還有一些新興的測定方法如催化動力學法[10]、膠束增效紫外分光光度法[11]、漫反射光譜法[12]等，這些方法測定亞硝酸鹽精密度較高，但是操作復(fù)雜，并且儀器較大，價格高，測定時間也較長，不適合推廣使用。

本次課題采用的是在弱酸的情況下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生重氮化合物，再與α-萘胺耦合，形成紫紅色的偶氮化合物，測定其吸光度。本次測定廣西賀州市八步區(qū)部分腌菜的亞硝酸鹽含量，旨在給當?shù)厥忻裉峁┯袃r值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大頭菜、榨菜、梅菜、腌蘿卜：購于陽光市場；涼拌菜：購于泰興超市。

亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、α-萘胺、四硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉：以上藥品均為分析純；實驗用水為超純水。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101-1電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試劑的配制

20% 鹽酸溶液：量取54.8 mL 36.5%鹽酸至100 mL燒杯中，加水至100 mL刻度線。

1 mg/mL亞硝酸鈉標準儲備溶液：準確稱取0.5000 g 亞硝酸鈉于100 mL燒杯中，先加入少量水溶解，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，做儲備液。

5 μg/mL亞硝酸鈉標準工作溶液：量取5.00 mL 1 mg/mL亞硝酸鈉標準溶液于1000 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

4 g/L對氨基苯磺酸溶液：稱取2.000 g對氨基苯磺酸固體溶于500 mL 20%鹽酸中，混勻，置于棕色瓶中，避光保存。

2 g/L α-萘胺溶液：準確稱取0.5000 g α-萘胺固體，先用少量95%酒精溶解，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，再用95% 酒精定容，搖勻。

硼砂飽和溶液：稱取25 g四硼酸鈉固體溶于500 mL溫水中，冷卻至室溫。

0.25 mol/L亞鐵氰化鉀溶液：準確稱取10.6190 g亞鐵氰化鉀固體，溶于水中并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

1 mol/L乙酸鋅溶液：準確稱取21.9000 g乙酸鋅固體，加入3 mL冰醋酸，加水溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

0.01 mol/L 氫氧化鈉溶液：稱取0.04 g 氫氧化鈉固體于100 mL燒杯中，加水至100 mL刻度線，攪拌溶解。

1.3 樣品處理

準確稱取 2.5000 g 經(jīng)粉碎均勻的腌菜樣品，置于250 mL燒杯中，加入 12.5 mL硼砂飽和溶液，攪拌均勻，加入約100 mL 70 ℃左右的水，并在沸水浴中加熱15 min，取出冷卻到室溫，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，再加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液和5 mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)，加水定容，加入1 g活性炭[13]，搖勻，靜置，吸走上層脂肪并進行抽濾，濾液備用[14]。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗原理

樣品經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀、除去脂肪后，在弱酸的情況下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，重氮鹽再與α-萘胺試劑發(fā)生耦合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物，亞硝酸鹽特效試劑α-萘胺溶液作顯色劑，能夠成功地避免實驗中其他陰陽離子的影響[15]。反應(yīng)式如下：

反應(yīng)1：

反應(yīng)2：

1.4.2 標準曲線的繪制方法

分別吸取一定量的5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，分別加入一定量的 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，在一定的溫度下，調(diào)節(jié)溶液的pH為5，搖勻，靜置，再加入一定量的2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，搖勻，靜置，于1 cm比色皿中，在最大吸收波長處測定吸光度，以亞硝酸鈉標準溶液濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 樣品的測定

吸取40 mL濾液置于50 mL容量瓶中，加入一定量的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，在一定的溫度下，調(diào)節(jié)溶液的pH，搖勻，靜置，再加入一定量的2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，搖勻，靜置，于1 cm比色皿中，在最大吸收波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大波長的確定

反應(yīng)1：吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置3～5 min，加水至刻度，搖勻，于1 cm比色皿中，做光譜掃描，結(jié)果見圖1。

反應(yīng)2：吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置3～5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，搖勻，靜置15 min，于1 cm比色皿中，做光譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)1和反應(yīng)2的波長Fig.1 The wavelength of reaction 1 and reaction 2

由圖1可知，反應(yīng)1在紫外區(qū)267 nm處吸光度達到最大，而在可見區(qū)無吸收。反應(yīng)2在可見區(qū)520 nm處吸光度達到最大，故選擇267 nm和520 nm分別為反應(yīng)1和反應(yīng)2的最適宜測定波長，為了更好考察反應(yīng)條件對反應(yīng)體系的影響。

2.2 反應(yīng)條件的確定

2.2.1 反應(yīng)1的反應(yīng)條件的確定

2.2.1.1 反應(yīng)時間的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置時間分別是1，2，3，4，5，6 min，加水至刻度線，混勻，于1 cm比色皿中，在267 nm處測量吸光度。以反應(yīng)時間t為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖2。

圖2 反應(yīng)時間的影響Fig.2 The influence of reaction time

由圖2可知，隨著反應(yīng)時間的延長，體系的吸光度逐漸增大，當反應(yīng)時間為4 min時，吸光度急劇增大；當反應(yīng)到5 min時，吸光度達到最大值；當反應(yīng)時間大于5 min后，吸光度急劇下降。表明在5 min時，反應(yīng)已充分完成。因此，選擇5 min為反應(yīng)1的最佳反應(yīng)時間。

2.2.1.2 反應(yīng)溫度的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，搖勻，溫度分別控制在10，15，20，25，30，35 ℃，靜置5 min，加水至刻度線，混勻，于1 cm比色皿中，在267 nm處測量吸光度。以反應(yīng)溫度T為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度的影響Fig.3 The influence of reaction temperature

由圖3可知，體系的吸光度隨著溫度的升高而增大，當溫度升到25 ℃時，體系的吸光度達到最大，隨后再升高溫度，吸光度反而緩慢下降，而20～35 ℃之間的吸光度相差不大，較穩(wěn)定。故選擇25 ℃為反應(yīng)1 的最佳溫度。

2.2.1.3 反應(yīng)pH的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為1，2，3，4，5，6，7，搖勻，溫度控制在25 ℃，靜置5 min，加水至刻度線，混勻，于1 cm比色皿中，在267 nm處測量吸光度。以溶液pH為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖4。

圖4 反應(yīng)pH的影響Fig.4 The influence of reaction pH

由圖4可知，隨著pH的增大，吸光度逐漸增大，當pH達到4時，吸光度急劇增大；當pH為5時，吸光度達到最大值；當反應(yīng)pH>5時，吸光度急劇下降。表明pH為5時，反應(yīng)已充分完成。因此，選擇pH 5為反應(yīng)1的最佳反應(yīng)pH值。

2.2.1.4 顯色劑用量的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液的量分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，調(diào)節(jié)pH為5，溫度控制在25 ℃，搖勻，靜置時間為5 min，加水至刻度線，混勻，于1 cm比色皿中，在267 nm處測量吸光度。以顯色劑用量V為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖5。

圖5 顯色劑用量的影響Fig.5 The influence of chromogenic agent dosage

由圖5可知，隨著顯色劑用量的增加，吸光度逐漸增大，當顯色劑用量為2.0 mL時，吸光度達到最大值，反應(yīng)能夠充分完成；當顯色劑用量大于2.0 mL后，吸光度沒有上升反而下降。因此，選擇顯色劑用量2.0 mL為反應(yīng)1的最佳顯色劑用量。

2.2.2 反應(yīng)2的反應(yīng)條件的確定

2.2.2.1 反應(yīng)時間的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，搖勻，溫度控制在25 ℃，靜置時間為5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，搖勻，靜置時間分別為5，10，15，20，25，30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測量吸光度。以反應(yīng)時間t為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖6。

圖6 反應(yīng)時間的影響Fig.6 The influence of reaction time

由圖6可知，隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度緩慢增大，當反應(yīng)時間為30 min時，吸光度達到最大值，反應(yīng)能夠充分完成；當反應(yīng)時間繼續(xù)延長時，吸光度沒有上升反而下降。因此，選擇30 min為反應(yīng)2的最佳反應(yīng)時間。

2.2.2.2 反應(yīng)溫度的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，搖勻，溫度控制在25 ℃，靜置5 min，加水至刻度，混勻，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，溫度控制在10，15，20，25，30，35，40 ℃，搖勻，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測量吸光度。以溫度T為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖7。

圖7 反應(yīng)溫度的影響Fig.7 The influence of reaction temperature

由圖7可知，吸光度隨著溫度的上升而增大，當溫度達到20 ℃時，吸光度達到最大值，再升高溫度，體系的吸光度反而下降，且25 ℃后的吸光度趨于穩(wěn)定。故選擇20 ℃為反應(yīng)2 的最佳溫度。

2.2.2.3 反應(yīng)pH的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2.00 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，搖勻，溫度控制在25 ℃，靜置5 min，再加入2.00 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，控制pH為1，2，3，4，5，6，7，溫度控制在20 ℃，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測量吸光度。以反應(yīng)pH為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖8。

圖8 反應(yīng)pH的影響Fig.8 The influence of reaction pH

由圖8可知，溶液的吸光度隨pH的變化影響不大，且原溶液的pH值為4。因此，選擇pH 4為反應(yīng)2的最佳反應(yīng)pH值。

2.2.2.4 顯色劑用量的影響

吸取5.00 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，溫度控制在25 ℃，搖勻，靜置時間為5 min，再加入2 g/L α-萘胺溶液，用量分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，加水至刻度，控制pH為4，溫度控制在20 ℃，搖勻，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測量吸光度。以顯色劑用量V為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制曲線，見圖9。

圖9 顯色劑用量的影響Fig.9 The influence of chromogenic agent dosage

由圖9可知，隨著顯色劑用量的增大，吸光度緩慢增大，顯色劑用量為2.0 mL時，吸光度達到最大值，反應(yīng)能夠充分完成；當顯色劑用量大于2.0 mL后，吸光度沒有上升而是緩慢下降。因此，選擇顯色劑用量2.0 mL為反應(yīng)2的最佳顯色劑用量。

2.3 標準曲線的繪制

分別吸取0，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，分別加入2.0 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，溫度控制在25 ℃，搖勻，靜置時間為5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，溫度控制在20 ℃，搖勻，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測定吸光度。以亞硝酸鈉標準溶液濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，見圖10。

圖10 標準曲線Fig.10 The standard curve

由標準曲線可知回歸方程為A=1.4307C+0.0037，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，線性較好。

2.4 樣品的測定

吸取40 mL濾液置于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，溫度控制在25 ℃，搖勻，靜置時間為5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，控制pH為4，溫度控制在20 ℃，搖勻，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測定吸光度，平行5次。不同類型腌菜樣品中亞硝酸鹽含量測定的結(jié)果見表1。

表1 腌菜中亞硝酸鹽含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of nitrite content in pickles

由表1可知，不同的腌菜中亞硝酸鹽的含量存在著較大的差異。在所測的5種腌菜中，亞硝酸鹽含量最高的大頭菜為4.9529 mg/kg，其次的榨菜、涼拌菜分別為4.4295，4.3082 mg/kg，含量最低的梅菜為0.6378 mg/kg。其中亞硝酸鹽含量最低的梅菜和含量最高的大頭菜，其含量相差8倍。腌制食品中的亞硝酸鹽含量的國家標準為20 mg/kg[16]，由此可知，本次測量的腌菜樣品中亞硝酸鹽含量均沒有超標。

2.5 檢測限的確定

用水代替樣品濾液在相同條件下測定吸光度，平行20次。以20次測定的試劑空白標準差的3倍表示該方法的檢測限，為1.5 μg/L。

2.6 精密度試驗

吸取5.0 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，置于50 mL容量瓶中，分別加入2.0 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，調(diào)節(jié)pH為5，溫度控制在25 ℃，搖勻，靜置時間為5 min，再加入2.0 mL 2 g/L α-萘胺溶液，加水至刻度，調(diào)節(jié)pH為4，溫度控制在20 ℃，搖勻，靜置30 min，于1 cm比色皿中，在520 nm處測定吸光度，平行5次。精密度試驗測定的結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗測定結(jié)果Table 2 Determination results of precision test

由表2可知，通過重復(fù)測定標樣7次，計算吸光度的重復(fù)性，得亞硝酸鹽的相對標準偏差RSD為0.29%，小于2%，滿足分析實驗的精密度要求，說明該實驗精密度良好。

2.7 回收率試驗

取濾液2份,分別加入2.5，5.0 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，測定吸光度，平行3次。根據(jù)工作曲線計算出其含量，求回收率。以榨菜為例，其回收率試驗測定的結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，通過對2個不同加標量的分析，測得亞硝酸鹽的回收率為97.99%～99.53%，平均回收率為98.48%，相對標準偏差RSD為0.43%。故該方法有較高的準確性和可靠性。

3 結(jié)論

分光光度法測定5種腌菜中的亞硝酸鹽含量在0.6378～4.9529 mg/kg。所有樣品均在國家標準范圍之內(nèi)，均不超標。賀州市八步區(qū)陽光市場部分腌菜可以放心食用。

本次實驗法測定腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量是一個不錯的選擇，不僅設(shè)備簡單、操作快捷，而且靈敏度高、結(jié)果準確，具有推廣價值。

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Determination of Nitrite Content in Pickles

XIE Wei1, CHEN Qiu-juan2*, HE Xing-cun1, LUO Yang-he1, ZHU Dong-jian1

(1.Research Institute of Food Science & Engineering Technology, Hezhou University,Hezhou 542899, China;2.School of Chemical and Biological Engineering,Hezhou University, Hezhou 542899, China)

The content of nitrite in pickles from Babu District of Hezhou City is determined by visible spectrophotometry with α-naphthylamine as chromogenic agent. The linear equation is A=1.4307C+0.0037, the correlation coefficient R2=0.9998, the detection limit is 1.5 μg/L, the recovery rate of nitrite is 94.78%～99.53%. The results show that the method exhibits good linearity, easy operation and high precision. The content of nitrite in five samples doesn't exceed the standard.

visible spectrophotometry；pickles；α-naphthylamine；nitrite

2017-02-16 *通訊作者

廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目(KY2016LX381)；廣西高校科學技術(shù)研究項目(KY2015LX477)；賀州學院教學質(zhì)量與教學改革工程項目(hzxyjg201636，hzxyjg201541)；賀州學院校級課題(2014ZC28)

謝微(1984-)，女，壯族，助理研究員，碩士，研究方向：分析檢測；

陳秋娟(1983-)，女，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取、純化與分析。

TS255.53

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.025

1000-9973(2017)08-0114-06