桔霉素生物合成及調(diào)控的研究進(jìn)展

吳申懋，于華寧*

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436；2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436；3.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200436；4.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436)

桔霉素生物合成及調(diào)控的研究進(jìn)展

吳申懋1,2,3,4，于華寧1,2,3,4*

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200436；2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436；3.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200436；4.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436)

桔霉素是一種聚酮類化合物，同時(shí)也是一種常見的真菌毒素，具有腎毒性和潛在的致癌致畸風(fēng)險(xiǎn)，是青霉屬、曲霉屬、紅曲霉屬等的次級(jí)代謝產(chǎn)物。桔霉素的存在嚴(yán)重影響了真菌發(fā)酵工程的安全性，對(duì)食品安全造成了嚴(yán)重的威脅。因此，如何減少或抑制桔霉素的產(chǎn)量已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。近年來， 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多研究者對(duì)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成及其調(diào)控進(jìn)行了研究。文章重點(diǎn)介紹了桔霉素生物合成途徑及相關(guān)基因的研究進(jìn)展， 為減少真菌發(fā)酵過程中桔霉素的產(chǎn)量，提供更優(yōu)良的工業(yè)用菌株的參考和借鑒。

桔霉素;聚酮合酶;紅曲霉

桔霉素(citrinin)是一種真菌毒素，由Raistrick H和Hetherington A C于1931首次在Penicilliumcitrinum中分離得到[1]，并在1948年由Whalley W B鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)(見圖1)[2]。

桔霉素的化學(xué)名為4,6-二氫-8-羥基-3,4,5-三甲基-6-氧-3-H-2-苯吡-7-羧酸，呈黃色晶體狀。作為一種真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，桔霉素具有抑菌作用，但同時(shí)在哺乳動(dòng)物中被證實(shí)對(duì)腎臟有一定毒性，攝入會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟增大、腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞壞死等癥狀，同時(shí)還具有潛在的致畸風(fēng)險(xiǎn)[3-8]。有研究表明目前生活中攝入桔霉素的主要來源是谷物及谷物為原料的食品，見表1[9]。

表1 桔霉素在食品原料中的污染Table 1 The contamination of citrinin in food ingredients

近年來，真菌毒素在食品中的危害正越來越受到重視，相關(guān)機(jī)構(gòu)普遍重視，日本針對(duì)食品和保健食品中桔霉素的含量已做出規(guī)定，不得超過200 μg/kg。

歐盟的食品安全局(European Food Safety Authority)雖然未對(duì)食品中的桔霉素含量做出確切規(guī)定，但也對(duì)桔霉素的腎毒性及可能具有的基因毒性和致畸可能性表示了關(guān)注。

目前的研究發(fā)現(xiàn)桔霉素可由青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅曲霉屬(Monascus)等代謝產(chǎn)生。這幾類真菌均為重要的工業(yè)用菌種，過高的桔霉素產(chǎn)量會(huì)對(duì)食品的質(zhì)量和安全造成嚴(yán)重的影響，因此如何減少或抑制桔霉素的產(chǎn)生成為許多研究者研究的重點(diǎn)方向。

近年來，隨著真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法的成熟、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)的興起，越來越多的技術(shù)正在被運(yùn)用于真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分析，桔霉素的生物合成及相關(guān)功能基因的研究也取得了不少成果。本文就桔霉素生物合成及相關(guān)的調(diào)控基因的研究進(jìn)展做了綜述。

1 桔霉素的生物合成途徑

桔霉素是一種聚酮類化合物，對(duì)于真菌聚酮體代謝產(chǎn)物的合成途徑，目前已經(jīng)有很多相關(guān)研究。與青霉屬產(chǎn)生的其他聚酮類化合物洛伐他丁(Lovastatin)和莫那可林(Monacolin K)一樣，桔霉素合成的前體是乙酰CoA和丙二酰CoA。Hajjaj等[10]的研究通過同位素示蹤方法追蹤標(biāo)記化合物在合成過程中的積累，認(rèn)為桔霉素在聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)的作用下，1分子的乙酰CoA和4分子的丙二酰CoA縮合成四酮體(Tetraketide)，然后繼續(xù)與乙酰CoA縮合，通過甲基化、縮合、還原、甲氧基化、還原、氧化和脫水等步驟生成桔霉素(見圖2中a)。

圖2 紅曲霉中桔霉素可能的生物合成過程Fig.2 The possible biosynthesis process of citrinin in Monascus spp.

但是最新的研究對(duì)此提出了其他解釋(見圖2中b)：He Yi 等[11]認(rèn)為乙酰CoA在PKS的作用下，生成結(jié)合?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)的起始復(fù)合物，然后在絲氨酸水解酶(Serine Hydrolase)、氧化還原酶(Oxidoreductase)、乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase)、短鏈脫氫酶(short-chain dehydrogenases，SDR)的作用下生成桔霉素。

2 桔霉素合成及調(diào)控基因的研究

在真菌的次級(jí)代謝途徑中，需要很多酶的參與和調(diào)控，這些酶的編碼基因常被發(fā)現(xiàn)緊密排列在染色體相鄰的位置上，形成一個(gè)共同參與合成調(diào)控的基因[12]。在桔霉素等聚酮化合物的生物合成過程中，PKS基因簇起了一個(gè)關(guān)鍵作用。目前通過基因克隆等方法，對(duì)PKS基因的結(jié)構(gòu)和功能已有了一個(gè)較為全面的了解。但對(duì)位于PKS基因簇的上下游，參與調(diào)控和影響桔霉素合成的其他調(diào)控基因仍有待進(jìn)一步的研究。

真菌的PKS基因是一個(gè)復(fù)雜的基因簇，完整的PKS包含多個(gè)功能模塊，由多個(gè)酶和蛋白構(gòu)成(見圖3)，其中包括：酮脂酰基合酶(β-ketoacylsynthase，KAS)、?；D(zhuǎn)移酶(acyl transferase，AT)、?；d體蛋白(acyl carrier protein，ACP)、甲基轉(zhuǎn)移酶(C-methyl transferase domain，C-Met)等[13]。

圖3 聚酮合酶基因簇的功能結(jié)構(gòu)Fig.3 The functional structure of polyketide synthases cluster

2005年，Shimizu等[14]對(duì)紫紅曲霉(Monacuspurpureus)PKS的全長基因進(jìn)行了克隆，得到了13 kb的基因片段。他們發(fā)現(xiàn)PKS基因的轉(zhuǎn)錄量與桔霉素的合成量成正比，而在利用同源重組敲除PKS基因的菌株中，桔霉素的合成被抑制。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)紫紅曲霉的PKS基因附近存在5個(gè)可能參與合成的開放閱讀框(orf1～orf5)，其中orf2(ctnA基因)的敲除會(huì)導(dǎo)致PKS基因表達(dá)的顯著下調(diào)并嚴(yán)重影響桔霉素的產(chǎn)量[15]。

在此基礎(chǔ)上，Wang等[16]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)紫紅曲霉時(shí)以藍(lán)光照射，能顯著提高桔霉素的產(chǎn)量。用RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)光照射下orf1，orf3，orf4基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)，而PKS基因的表達(dá)量卻沒有顯著變化，推測(cè)在藍(lán)光照射條件下PKS基因并不是控制桔霉素產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。Li等[17]以原生質(zhì)體CaCl2/PEG法敲除了位于orf2和PKS之間的orf4(ctnB基因)。結(jié)果表明：3個(gè)轉(zhuǎn)化子的桔霉素產(chǎn)量均大幅降低，但紅曲霉及黃色素的產(chǎn)量與野生型相比并沒有顯著差異。隨后Li等[18]克隆了(Monascusaurantiacus)PKS基因簇附近的片段，分析后發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因(ctnG)與米曲霉(Aspergillusoryzae)中的β-碳酸酐酶具有較高的相似性。利用同源重組敲除該基因后，桔霉素的產(chǎn)量下降了50%，色素的產(chǎn)量減少了23%，推測(cè)ctnG基因可能與色素及桔霉素的前體丙二酰CoA的合成途徑有關(guān)。國內(nèi)的郭季冬和崔華[19,20]利用基因重組技術(shù)敲除了紅曲霉PKS基因簇上游的orf3基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株桔霉素產(chǎn)量分別降低了96%和87%，同時(shí)與野生株相比，突變株的色素產(chǎn)量也有了顯著提高，推測(cè)是由于桔霉素合成途徑的阻斷導(dǎo)致底物向色素途徑轉(zhuǎn)移，從而提高色素產(chǎn)量。

Patrick等的研究發(fā)現(xiàn)在馬爾尼菲青霉(Penicilliummarneffei)中，沉默PKS基因上游的4個(gè)開放閱讀框(rp1～rp4)會(huì)導(dǎo)致PKS基因的表達(dá)下調(diào)，其中rp1可能是PKS基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。研究者分別沉默了rp1～rp4和PKS基因，并使用超高效液質(zhì)聯(lián)用分析次級(jí)代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明rp1～rp4和PKS基因的沉默均會(huì)導(dǎo)致色素產(chǎn)量的降低，但只有rp1和PKS基因被沉默時(shí)，桔霉素的產(chǎn)生被抑制，國內(nèi)研究者也對(duì)紅曲霉進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，但在敲除了紅曲霉PKS基因后，發(fā)現(xiàn)其桔霉素的產(chǎn)量降低，但色素的產(chǎn)量卻有提高[21]。

此外，也有研究報(bào)道G蛋白信號(hào)通路作為真菌中普遍存在的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能也參與了桔霉素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[22,23]。李利等[24]發(fā)現(xiàn)在紅曲霉菌株M7中，G蛋白α亞基編碼基因(Mga1)被敲除后，桔霉素的產(chǎn)量提高了9倍，色素的產(chǎn)量也提高了71%。說明Mga1編碼的G蛋白亞基可能與桔霉素和色素合成過程中的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

3 影響桔霉素產(chǎn)量的因素

由于桔霉素對(duì)腎臟的毒性及潛在的致畸和致癌可能，許多研究者都致力于篩選無桔霉素或桔霉素產(chǎn)量較低的菌株，并研究外部發(fā)酵條件對(duì)菌株桔霉素產(chǎn)量的影響。

許多研究者發(fā)現(xiàn)桔霉素的產(chǎn)量與培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧量有關(guān)。Schmidt等[25]發(fā)現(xiàn)在Cu2+誘導(dǎo)下的氧脅迫環(huán)境中，隨著Cu2+濃度的上升，青霉屬Penicilliumverrucosum的次級(jí)代謝產(chǎn)物由赭曲霉素A逐漸向桔霉素轉(zhuǎn)化。并證實(shí)了Penicilliumverrucosum與紫紅曲霉相同，當(dāng)cAMP的量上升時(shí)，桔霉素的產(chǎn)生受到抑制，這說明桔霉素的合成可能受到cAMP/PKA信號(hào)通路的調(diào)控。推測(cè)桔霉素具有抗氧化性，可應(yīng)對(duì)氧脅迫及氧損傷。這一結(jié)果與Hajjaj等[26]的研究相符，他們控制了紫紅曲霉(Monascusruber)發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量并發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中溶氧上升時(shí)，紅曲色素和桔霉素的產(chǎn)量顯著上升，且桔霉素產(chǎn)量上升大于色素。國內(nèi)的朱宏軍[27]也發(fā)現(xiàn)紅曲中桔霉素的含量與培養(yǎng)基中的自由基含量成正相關(guān)，同時(shí)也觀察到當(dāng)超氧化物歧化酶(SOD)活性提高時(shí)，桔霉素的產(chǎn)量顯著下降。研究者嘗試在紅曲培養(yǎng)基中人工添加抗氧化劑如β-胡蘿卜素、維生素C、EDTA等，結(jié)果表明添加后桔霉素的含量均下降了90%以上，同時(shí)提高了50%的色價(jià)。推測(cè)是由于紅曲色素和桔霉素合成途徑部分重合，當(dāng)桔霉素合成被抑制時(shí)相應(yīng)的色素產(chǎn)量就會(huì)上升。邢淑婕等[28]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)紅曲培養(yǎng)基的裝液量從75 mL提升至200 mL時(shí)，桔霉素的產(chǎn)量下降了90%。馬博雅等[29]在有氧與缺氧條件下分別培養(yǎng)紅曲霉，并監(jiān)測(cè)相關(guān)基因表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與有氧培養(yǎng)相比，無氧狀態(tài)下的紅曲霉桔霉素產(chǎn)量低40.16%，且orf2基因的表達(dá)量總是低于有氧條件，orf7基因的表達(dá)量總是高于有氧條件，因此推測(cè)桔霉素的合成被orf7基因的表達(dá)抑制，而與orf2基因的表達(dá)成正相關(guān)，這與之前國外Shimizu等的研究結(jié)果一致。

Hajjaj等[30]研究了培養(yǎng)基中不同的氨基酸對(duì)紫紅紅曲胞外桔霉素和色素的影響。他發(fā)現(xiàn)除了賴氨酸外，紫紅紅曲在以其他12種常見氨基酸為氮源時(shí)均能生長，當(dāng)培養(yǎng)基中唯一氮源為甘氨酸、酪氨酸、組氨酸時(shí)，色素的產(chǎn)量較高，桔霉素的產(chǎn)量較少；當(dāng)?shù)礊楣劝彼帷⒈彼?、脯氨酸時(shí)桔霉素產(chǎn)量較高。其中以組氨酸為氮源時(shí)，150 h培養(yǎng)后紅曲色素的產(chǎn)量可達(dá)到715 mg/L，桔霉素未檢出。研究者推測(cè)桔霉素可能被組氨酸代謝過程中積累的過氧化氫所降解[31]。

康碧玉等[32,33]發(fā)現(xiàn)在紅曲霉發(fā)酵過程中的pH受氮源的影響較大，發(fā)酵液的最終pH是影響桔霉素和色素合成的關(guān)鍵因素。隨著發(fā)酵液的pH增大(pH 3.0～5.5)，胞外的色素濃度也增高。當(dāng)發(fā)酵液最終pH低于3.0時(shí)，桔霉素的生物合成被抑制。同時(shí)有研究者發(fā)現(xiàn)：紫紅紅曲的桔霉素和色素產(chǎn)量在pH 5.5上升至pH 8.0時(shí)，下降了90%和60%[34]，說明過酸(<3.0)或過堿(>8.0)的環(huán)境均能有效抑制桔霉素的合成。岳建明等[35]的研究也發(fā)現(xiàn)添加0.3 mol/L NH4+的(NH4)2SO4的發(fā)酵液中桔霉素含量降為0.05 mg/L，較對(duì)照組降低88.6%，說明在培養(yǎng)基中添加銨鹽可以通過降低pH的方式減少桔霉素的產(chǎn)生。

Tan等[36]在紫紅紅曲培養(yǎng)基中添加4%的乙醇后，發(fā)現(xiàn)紅曲的桔霉素產(chǎn)量從38 mg/kg減少至2 mg/kg，但菌體干重卻上升50%，說明聚酮類化合物的產(chǎn)量減少并非通過抑制菌體生長而是改變了紅曲的代謝通路。此外，研究者以2D-PAGE分析加入4%乙醇后對(duì)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)除了聚酮合酶相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào)外，乙醛脫氫酶和脂肪酸合酶的表達(dá)也有顯著下調(diào)。推測(cè)乙醇對(duì)于桔霉素產(chǎn)量的下調(diào)不僅靠阻斷聚酮合酶合成的通路，同時(shí)也降低了聚酮類化合前體(乙酰CoA)的合成。

張曉偉等[37]發(fā)現(xiàn)分別以藍(lán)光和日光照射8 h后，桔霉素的保存率為64%和76%；而以紫外光照射5 min后，桔霉素的降解就會(huì)達(dá)到50%。推測(cè)由于桔霉素的最大吸收峰在330 nm波長處，可以吸收紫外和藍(lán)光的光量子，從而導(dǎo)致桔霉素的降解。

4 展望

近年來，隨著超高效液相色譜等分離技術(shù)的發(fā)展，對(duì)桔霉素合成過程中的步驟已有了較為全面的研究，但是桔霉素的合成調(diào)控的詳細(xì)機(jī)理仍未得到闡明。許多的研究已發(fā)現(xiàn)桔霉素的合成并非僅依靠PKS基因簇，可能涉及到多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用，包括跨膜的G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、cAMP信號(hào)通路等。這些研究說明桔霉素的合成與外界環(huán)境之間的緊密聯(lián)系，為下一步通過特定的培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件定向調(diào)節(jié)真菌桔霉素產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

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[36]Ya-Yun Tan,Wei-Hsuan Hsu,Tsung-Wei Shih,et al.Proteomic insight into the effect of ethanol on citrinin biosynthesis pathway inMonascuspurpureusNTU 568[J].Food Research International,2014,64:733-742.

[37]張曉偉,王昌祿,陳勉華,等.理化因子對(duì)紅曲色素色價(jià)的影響及桔霉素的光降解性[J].食品科學(xué),2013,34(15):17-21.

Research Progress on Biosynthesis and Regulation of Citrinin

WU Shen-mao1,2,3,4, YU Hua-ning1,2,3,4*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Shanghai 200436, China;2.Shanghai EngineeringResearch Center of Dairy Biotechnology, Shanghai 200436, China;3.Synergetic InnovationCenter of Food Safety and Nutrition Dairy Research Institute, Shanghai 200436, China;4.Bright Dairy & Food Co., Ltd., Shanghai 200436, China)

Citrinin is one of the well-known mycotoxins and polyketides, which has been proved to be nephrotoxic and potentially embryocidal and carcinogenic. It is a secondary metabolite produced by several fungal strains belonging to the generaPenicillium,AspergillusandMonascus. The contamination of citrinin now threatens the food safety and fungus fermentation. Therefore, how to reduce and eliminate the production of citrinin has become a hot topic.In recent years, with the development of molecular biological approaches, many researchers have explored the biosynthesis and regulation of fungal secondary metabolites. The latest achievements are summarized in this paper, which has set up the foundation for reducing the production of citrinin in fungus fermentation and providing high-efficient industrial fungal strains.

citrinin;polyketide synthase;Monascus

2017-02-03 *通訊作者

上海優(yōu)秀技術(shù)帶頭人項(xiàng)目(14XD1420300)

吳申懋(1989-)，男，碩士，研究方向：微生物與食品安全；

于華寧(1981-)，男，博士，研究方向：微生物與食品安全。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.039

1000-9973(2017)08-0175-06