瓊脂-孔洞擴(kuò)散法測定物質(zhì)抑菌活性中相關(guān)影響因素的探討

李萍，張?zhí)m，舒展，胡矗垚，閆靜坤，汪青青

(天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384)

瓊脂-孔洞擴(kuò)散法測定物質(zhì)抑菌活性中相關(guān)影響因素的探討

李萍，張?zhí)m，舒展，胡矗垚，閆靜坤，汪青青

(天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384)

以肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油為試樣，討論樣品加入量、濃度、打孔直徑及評價指標(biāo)對瓊脂-孔洞擴(kuò)散法測定物質(zhì)抑菌活性的影響。結(jié)果表明：抑菌活性與樣品加入量和濃度都呈正相關(guān)，9,11 mm孔徑的加液量分別為50～70 μL 和70～90 μL比較適宜，應(yīng)用2倍或3倍梯度稀釋法可進(jìn)行定量分析，較快找到被測物質(zhì)對供試菌種的最小抑菌濃度。采用樣品抑菌圈直徑與空白抑菌圈直徑的差值作為抑菌活性的評價指標(biāo)比抑制率更加合理。GC-MS分析表明：索氏和超聲波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分別為60.93%和37.86%。肉桂醛的抑制活性好于索氏和超聲波提取的肉桂油，說明肉桂醛也是肉桂油的主要抗菌成分之一。肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油均對細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是酵母，對霉菌的抑制作用較弱，但濃度為333.33 mg/mL的3種試樣對黑曲霉的抑制率分別為60.00%，52.63%和47.06%，展現(xiàn)了一定的抑菌效果。肉桂油作為天然植物源抗菌劑用于食品保鮮領(lǐng)域具有一定的參考價值。

抑菌活性；瓊脂-孔洞擴(kuò)散法；樣品加入量；樣品濃度；孔徑大??；評價指標(biāo)

抑菌活性是許多物質(zhì)可以作為防腐劑用于食品保鮮的重要原因。隨著人們對化學(xué)防腐劑可能給人類健康和環(huán)境帶來副作用的關(guān)注，科研人員對天然物質(zhì)的抑菌活性及其在食品保鮮上的應(yīng)用展開了大量研究[1-3]。目前，評價物質(zhì)抑菌活性的方法有：濾紙片法、牛津杯法、瓊脂-孔洞擴(kuò)散法等。濾紙片法是將浸泡過一定濃度藥液的濾紙片貼在含菌平板培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈，測量直徑，評價抑菌活性[4,5]，此法的缺陷是如果濾紙片粘附不牢固，會導(dǎo)致抑菌圈輪廓模糊，測量誤差較大，且濾紙片吸收的藥液量不好控制，結(jié)果重復(fù)性較差；牛津杯法是向垂直置于培養(yǎng)基表面的牛津杯中注入藥液，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈，測量直徑，評價抑菌活性[6,7]，此法所得抑菌圈輪廓清晰，結(jié)果可靠，但缺點(diǎn)是多個濃度測定時牛津杯需要個數(shù)較多，價格昂貴，操作成本高。瓊脂-孔洞擴(kuò)散法，又稱打孔法，是用打孔器在含菌平板上打孔，向孔中加入樣品溶液，培養(yǎng)后觀察有無抑菌圈，測量直徑，評價抑菌活性，此法操作簡單，成本低，所得抑菌圈輪廓清晰，結(jié)果可靠，在物質(zhì)的抑菌活性評價中得到廣泛應(yīng)用[8,9]。然而，在打孔法的實(shí)際操作中，往往由于樣品加入量、濃度、打孔直徑及評價指標(biāo)等因素的影響，即使是對相同物質(zhì)進(jìn)行抑菌活性的測定，不同文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果也會存在較大差異，可比性較差。

先前實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)肉桂醛及肉桂皮提取物對多種微生物具有抑菌活性[10]。因此，本文以肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油為試樣，對瓊脂-孔洞擴(kuò)散法測定物質(zhì)抑菌活性中的相關(guān)影響因素，如樣品加入量、濃度、打孔直徑、評價指標(biāo)等進(jìn)行探討，旨在為此法的可操作性和提高不同實(shí)驗(yàn)人員對相同物質(zhì)抑菌活性測定結(jié)果的可比性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

供試樣品：肉桂醛，純度 98%，上海阿拉丁試劑有限公司；索氏提取的肉桂油，根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法制備；超聲波提取的肉桂油，根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法制備。菌種：惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、釀酒酵母、黑曲霉，均由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供，4 ℃斜面保存，用前活化。

1.2 藥品與儀器

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析純；正己烷：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，酵母用酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，霉菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

移液槍 德國Eppendorf公司；滅菌鍋(DX-35BI型)、DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Thermo Scientific MSC-Advantage Ⅱ級生物安全柜 德國Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；打孔器1套。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測定肉桂油中肉桂醛的含量

索氏和超聲波提取的肉桂油用正己烷稀釋進(jìn)樣。色譜和質(zhì)譜條件參見文獻(xiàn)，采用NIST2008標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，利用峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對百分含量。

1.3.2 抑菌活性的測定

1.3.2.1 菌懸液的制備

細(xì)菌用平板稀釋法測定菌落數(shù)，酵母菌用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)[13]，分別用無菌生理鹽水稀釋，制成含菌數(shù)為107cfu/mL的菌液。霉菌用無菌生理鹽水沖洗并收集孢子，制成孢子數(shù)為107個/mL的菌液。

1.3.2.2 瓊脂-孔洞擴(kuò)散法測定抑菌活性

滅菌培養(yǎng)基冷至50 ℃，加入5 mL菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中(直徑9 cm)，每皿15～20 mL，放置40 min，使培養(yǎng)基固化。用無菌打孔器在培養(yǎng)基上均勻打孔，向孔中加入試樣，DMF作空白對照。細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母菌28 ℃培養(yǎng)48 h，霉菌25 ℃培養(yǎng)72 h。測量抑菌圈直徑(單位mm)，每個濃度重復(fù)3次，計(jì)算樣品抑菌圈直徑(D)與空白抑菌圈直徑(d)的差值，同時按公式(1)計(jì)算樣品對菌種的抑制率。

公式(1)

1.3.3 樣品加入量對抑菌活性的影響

3種供試樣品用DMF作溶劑，配制的初始濃度均為1000.00 mg/mL，采用3倍梯度稀釋法配制系列溶液。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明：肉桂醛對細(xì)菌的抑制活性比酵母和霉菌強(qiáng)，索氏和超聲波提取的肉桂油對供試菌種的抑制活性均小于肉桂醛，因此，為了得到大小適中的抑菌圈，便于測量，細(xì)菌(惡臭假單胞菌和枯草芽孢桿菌)實(shí)驗(yàn)時肉桂醛濃度為12.35 mg/mL，酵母(啤酒和釀酒)和霉菌(黑曲霉)實(shí)驗(yàn)時肉桂醛濃度為37.04 mg/mL。索氏和超聲波提取的肉桂油對5種供試菌種實(shí)驗(yàn)濃度均為111.11 mg/mL。3種樣品加入量分別為30,50,70,90 μL，打孔直徑為9 mm，討論濃度和孔徑一定的條件下，樣品加入量的變化對抑菌活性的影響。

1.3.4 樣品濃度對抑菌活性的影響

3種供試樣品用DMF作溶劑，配制的初始濃度分別為1000.00 mg/mL，采用梯度稀釋法配制系列溶液。3種樣品對供試菌種實(shí)驗(yàn)濃度均為333.33，166.67,83.33,41.67 mg/mL。3種樣品加入量都為40 μL，打孔直徑為9 mm，討論加入量和孔徑一定的條件下，樣品濃度的變化對抑菌活性的影響。

1.3.5 打孔直徑對抑菌活性的影響

細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時肉桂醛濃度為12.35 mg/mL，酵母和霉菌實(shí)驗(yàn)時肉桂醛濃度為37.04 mg/mL。索氏和超聲波提取的肉桂油對供試菌種實(shí)驗(yàn)濃度均為111.11 mg/mL。樣品加入量都為40 μL，打孔直徑分別為7,9,11,13 mm，討論樣品加入量和濃度一定的條件下，打孔直徑的變化對抑菌活性的影響。

1.3.6 抑菌活性評價指標(biāo)的選擇

討論采用樣品抑菌圈直徑(D)與空白抑菌圈直徑(d)的差值即(D-d)值和抑制率兩種指標(biāo)對抑菌活性評價的合理性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品加入量對抑菌活性的影響

打孔法測定物質(zhì)抑菌活性時，孔中物質(zhì)向四周擴(kuò)散，在孔洞周圍出現(xiàn)的抑菌圈越大，說明此物質(zhì)對該菌抑制活性越強(qiáng)，反之越小。

表1 樣品加入量對(D-d)值的影響

樣品加入量(μL)菌種惡臭假單胞菌枯草芽孢桿菌啤酒酵母釀酒酵母黑曲霉肉桂醛3016．50±0．2915．50±0．2913．50±0．5812．25±0．297．00±0．585019．50±0．5819．00±0．5018．00±0．7617．75±0．769．00±0．877021．50±0．5020．75±0．7619．50±0．5819．00±0．8711．50±0．299024．25±0．5023．75±0．5022．25±0．2921．50±0．7614．00±0．50索氏肉桂油3013．50±0．2912．50±010．00±0．769．00±1．155．75±0．295016．75±0．7614．00±0．8713．50±1．1510．00±1．267．00±0．507019．00±0．5817．00±0．2915．75±0．7612．75±0．878．25±1．029020．75±0．7619．75±0．2917．75±0．8714．00±0．879．50±0．50超聲肉桂油3010．00±1．049．25±0．588．00±0．297．00±0．293．00±0．765014．50±0．2912．50±1．1512．25±0．878．00±0．505．00±0．297017．50±1．2615．00±1．0414．50±0．2911．00±0．766．25±09019．00±017．00±1．1516．50±0．8713．00±0．768．00±0．29

圖1 樣品加入量對抑制率的影響 注：(a)為肉桂醛，(b)為索氏肉桂油，(c)為超聲肉桂油。

由表1、和圖1可知，當(dāng)樣品濃度和打孔直徑一定的條件下，隨著加入量的增加，3種樣品對同種微生物的(D-d)值和抑制率都明顯增大，抑菌活性增強(qiáng)，說明在達(dá)到完全抑制供試菌種之前，抑菌效果與樣品加入量呈正相關(guān)。此外，在加入量相同時，3種樣品均對細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是酵母，對霉菌的抑制作用較弱。還可以看出，無論采用(D-d)值還是抑制率作為評價指標(biāo)，相同加入量的3種試樣對5種微生物的抑制活性排序均為：肉桂醛>索氏肉桂油>超聲肉桂油，說明肉桂醛是肉桂油的主要抗菌成分之一，這與Siddiqua等和李京晶等[14]報(bào)道的結(jié)果一致。GC-MS分析表明：索氏和超聲波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分別為60.93%和37.86%，這也是索氏提取的肉桂油抗菌效果好于超聲波法的有力證明。

樣品加入量對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片見圖2。瓊脂-孔洞擴(kuò)散法抑菌圈形狀完整，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖2 樣品加入量對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片

打孔法的實(shí)際操作中，樣品加入量過少會導(dǎo)致抑菌圈過小，甚至沒有抑菌圈，容易造成實(shí)驗(yàn)人員對被測物質(zhì)抑菌活性的錯誤推斷；樣品加入量過多會導(dǎo)致在打孔直徑一定的條件下，加樣及平板倒置培養(yǎng)時藥液容易溢出，因此，樣品加入量應(yīng)當(dāng)適宜。9，11 mm是實(shí)驗(yàn)時經(jīng)常采用的孔徑大小。以每皿傾倒15～20 mL培養(yǎng)基為例，9 mm孔徑時，樣品加入量30 μL剛好鋪滿孔底部，50 μL約占孔洞1/2容積，70 μL約占2/3容積，100 μL可填滿孔洞，因此加液量為50～70 μL比較適宜；同理，11 mm孔徑時，加液量為70～90 μL比較適宜。

2.2 樣品濃度對抑菌活性的影響

樣品濃度的變化對抑菌活性的影響結(jié)果見表2和圖3。

表2 樣品濃度對(D-d)值的影響

圖3 樣品濃度對抑制率的影響 注：(a)為肉桂醛，(b)為索氏肉桂油，(c)為超聲肉桂油。

由表2和圖3可知，在樣品加入量和打孔直徑一定的條件下，隨著濃度的增加，3種供試樣品(D-d)值和抑制率都明顯增大，抑菌活性增強(qiáng)，說明在達(dá)到完全抑制供試微生物之前，抑菌效果與樣品濃度呈正相關(guān)，這與Muthuswamy等和Aly等[15]報(bào)道的結(jié)果一致。此外，雖然肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油對黑曲霉抑制作用比細(xì)菌和酵母弱，但加樣量為40 μL時，濃度為333.33 mg/mL的3種試樣對黑曲霉的抑制率分別為60.00%，52.63%和47.06%，展現(xiàn)了一定的抑菌效果，說明肉桂油作為天然植物源抗菌劑用于食品保鮮領(lǐng)域具有一定的參考價值。還可以看出，無論采用(D-d)值(見表2)還是抑制率(見圖3)作為評價指標(biāo)，在樣品加入量一定時，相同濃度的3種試樣對5種微生物的抑制活性排序均為：肉桂醛>索氏肉桂油>超聲肉桂油，這與樣品加入量對抑菌活性的影響結(jié)果一致。

樣品濃度對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片見圖4。

圖4 樣品濃度對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片

打孔法的實(shí)際操作中，樣品初始濃度過小會導(dǎo)致抑菌圈過小，甚至沒有抑菌圈，容易造成實(shí)驗(yàn)人員對被測物質(zhì)抑菌活性的錯誤推斷；樣品初始濃度也不宜過大，因?yàn)橛行┚N的培養(yǎng)時間較短(如細(xì)菌，24 h)，在樣品加入量一定的條件下，高濃度的樣品在短時間內(nèi)有可能不會完全擴(kuò)散開，導(dǎo)致其抑菌圈直徑有時沒有下一個相鄰稀釋梯度的樣品大，且樣品初始濃度過大還會增加后續(xù)尋找最小抑菌濃度的工作量。因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)初步了解樣品抑菌活性后，應(yīng)該選擇適宜的樣品初始濃度，采用2倍或3倍梯度稀釋法配制系列樣品溶液可進(jìn)行定量分析，較快找到被測物質(zhì)對供試微生物的最小抑菌濃度。

2.3 打孔直徑對抑菌活性的影響及抑菌活性評價指標(biāo)的選擇

圖5 打孔直徑對抑制率的影響 注：(a)為肉桂醛，(b)為索氏肉桂油，(c)超聲肉桂油。

前面在討論樣品加入量和濃度對物質(zhì)抑菌活性的影響時，采用(D-d)值和抑制率作為評價指標(biāo)都可以得到相同結(jié)果，即隨著樣品加入量和濃度的增加，(D-d)值和抑制率都呈現(xiàn)增大的趨勢。由圖5(b)和圖5(c)可知，索氏和超聲波提取的肉桂油在加入量和濃度一定的條件下，采用抑制率作為評價指標(biāo)，隨著打孔直徑的增加，樣品對5種微生物的抑制率都呈現(xiàn)下降趨勢，即打孔直徑越大，抑制率越小，說明抑制率的數(shù)值與打孔直徑密切相關(guān)。

表3 打孔直徑對(D-d)值的影響

樣品打孔直徑(mm)菌種惡臭假單胞菌枯草芽孢桿菌啤酒酵母釀酒酵母黑曲霉肉桂醛718．00±0．5815．75±0．7615．25±0．5811．75±0．769．50±1．15917．00±1．1516．00±1．0414．75±0．8713．00±0．298．50±0．501117．00±0．7616．00±0．5814．00±0．2913．25±0．589．00±1．041317．00±0．7616．50±1．1515．50±0．8713．75±0．769．50±0．58索氏肉桂油715．00±0．2912．50±0．5811．75±0．769．75±1．316．25±0914．75±0．4713．25±1．1312．00±010．00±0．846．50±1．151114．75±0．2913．00±0．6111．50±0．2910．75±1．156．00±0．761315．25±0．5813．75±0．7611．25±0．589．75±0．766．00±0超聲肉桂油710．75±0．2910．50±1．159．00±0．878．00±0．504．00±0．29910．25±1．139．75±0．508．50±0．848．00±1．154．25±0．291111．00±0．769．00±1．158．50±0．878．00±0．585．00±0．291311．50±0．589．00±1．049．00±0．878．50±0．584．50±0．29

由表3可知，采用(D-d)值作為評價指標(biāo)，在加入量和濃度一定的條件下，隨著打孔直徑的增加，樣品對5種微生物的(D-d)值都變化不大，說明(D-d)值與打孔直徑基本無關(guān)。肉桂醛采用抑制率(見圖5a)和(D-d)值(見表3)作為評價指標(biāo)與索氏和超聲波提取的肉桂油體現(xiàn)出相同的規(guī)律。因此，采用樣品抑菌圈直徑(D)與空白抑菌圈直徑(d)的差值，即(D-d)值作為物質(zhì)抑菌活性的評價指標(biāo)可以排除打孔直徑對抑菌活性評價的影響，更加合理。其優(yōu)勢在于具有同一性，即在樣品加入量和濃度相近的條件下，可以根據(jù)(D-d)值直接比較不同實(shí)驗(yàn)人員對相同物質(zhì)抑菌活性的測定結(jié)果。

打孔直徑對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片見圖6。

圖6 打孔直徑對抑菌活性影響的培養(yǎng)皿照片

打孔法的實(shí)際操作中，7 mm孔徑較小，樣品加入量有限，有時甚至不出現(xiàn)抑菌圈；13 mm孔徑過大，樣品加入量需要較多，不僅造成浪費(fèi)，而且有時產(chǎn)生的抑菌圈過大，容易出現(xiàn)相鄰稀釋梯度的抑菌圈發(fā)生部分重合的現(xiàn)象，影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。9，11 mm是實(shí)驗(yàn)經(jīng)常采用的孔徑大小，且操作時同一個平板中打孔個數(shù)以4～5個比較適宜。

3 結(jié)論

瓊脂-孔洞擴(kuò)散法操作簡便、成本低、準(zhǔn)確性較高，是測定物質(zhì)抑菌活性的常用方法之一。本文以肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油為試樣，討論樣品加入量、濃度、打孔直徑及評價指標(biāo)對瓊脂-孔洞擴(kuò)散法的影響，結(jié)論如下：在達(dá)到完全抑制供試菌種之前，抑菌活性與樣品加入量和濃度都呈正相關(guān)，9，11 mm孔徑的加液量分別為50～70，70～90 μL比較適宜。在選擇適宜樣品初始濃度前提下，應(yīng)用2倍或3倍梯度稀釋法可進(jìn)行定量分析，較快找到被測物質(zhì)對供試菌種的最小抑菌濃度。采用樣品抑菌圈直徑(D)與空白抑菌圈直徑(d)的差值，即(D-d)值作為抑菌活性的評價指標(biāo)比抑制率更加合理。GC-MS分析表明：索氏和超聲波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分別為60.93%和37.86%。肉桂醛的抑制活性好于索氏和超聲波提取的肉桂油，說明肉桂醛也是肉桂油的主要抗菌成分之一。肉桂醛、索氏和超聲波提取的肉桂油均對細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是酵母，對霉菌的抑制作用較弱，但濃度為333.33 mg/mL的3種試樣對黑曲霉的抑制率分別為60.00%，52.63%，47.06%，展現(xiàn)了一定的抑菌效果，說明肉桂油作為天然植物源抗菌劑用于食品保鮮領(lǐng)域具有一定的參考價值。

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Study on the Related Factors of Antimicrobial Activity byAgar-Hole Diffusion Method

LI Ping, ZHANG Lan, SHU Zhan, HU Chu-yao, YAN Jing-kun, WANG Qing-qing

(College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

The effects of sample additive amount, sample concentration, pore size and evaluation index on the antimicrobial activity of substances by agar-hole diffusion method are discussed in the paper using cinnamaldehyde,soxhlet and ultrasonic cinnamon extracts as materials.The results reveal that the antimicrobial activity is positively correlated with the amount and concentration of samples, and the appropriate additive amount of samples is 50～70 μL for 9 mm pore size and 70～90 μL for 11 mm pore size respectively. Moreover, 2 or 3 times gradient dilution method could be used for quantitative analysis to quickly find the minimum inhibitory concentration of the tested substances against the tested strains. In addition, it is more reasonable to use the difference between the inhibition zone diameter of the sample and the control than the inhibition rate as the evaluation index for determining antimicrobial activity.Cinnamaldehyde is the major component in cinnamon oil identified by GC-MS,and the content is 60.93%for soxhlet extract and 37.86% for ultrasonic extract respectively. Cinnamaldehyde shows better antimicrobial activity than soxhlet and ultrasonic extracts, which indicates that cinnamaldehyde is also one of the predominant antibacterial components in cinnamon oil. Cinnamaldehyde, soxhlet and ultrasonic cinnamon extracts all show the strongest inhibitory effect on bacteria, followed by yeast and the inhibition of mold is weaker, however, the inhibitory rates againstAspergillusnigerare 60.00%, 52.63% and 47.06% for the above three samples respectively at a concentration of 333.33 mg/mL, which shows a degree of inhibitory effect against the tested mold. It could be concluded that cinnamon oil could be explored as a good source of natural compound with significant antimicrobial activity for the development of food preservation.

antimicrobial activity；agar-hole diffusion method；sample additive amount；sample concentration；pore size；evaluation index

2017-02-10

李萍(1979-)，女，天津人，講師，碩士，研究方向：香辛料有效成分的提取和應(yīng)用。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.010

1000-9973(2017)08-0047-06