新疆核桃野生種及4 個(gè)栽培品種的遺傳多樣性分析

張宏祥， 張明理，2，①， 桂東偉， 姜 黎

(1. 中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所 中國科學(xué)院干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830011；2. 中國科學(xué)院植物研究所， 北京 100093； 3. 新疆策勒荒漠草地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站， 新疆 策勒 848300)

新疆核桃野生種及4 個(gè)栽培品種的遺傳多樣性分析

張宏祥1， 張明理1，2，①， 桂東偉3， 姜 黎1

(1. 中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所 中國科學(xué)院干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830011；2. 中國科學(xué)院植物研究所， 北京 100093； 3. 新疆策勒荒漠草地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測(cè)研究站， 新疆 策勒 848300)

以新疆地區(qū)種植的4個(gè)核桃(JuglansregiaLinn.)栽培品種(包括新栽培品種‘溫185’和‘新新2’以及老栽培品種‘新豐’和‘扎343’)及鞏留野核桃自然保護(hù)區(qū)生長(zhǎng)的野生核桃為研究對(duì)象，對(duì)其cpDNA的psbK-psbI區(qū)間和mtDNA的COX2 intron Ⅰ區(qū)間以及nrDNA的ITS和ETS區(qū)間的DNA片段序列進(jìn)行了比較分析，并對(duì)其MP、ML和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行了分析；此外，還基于SSR分子標(biāo)記結(jié)果對(duì)其進(jìn)行了遺傳多樣性指數(shù)、UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳分組分析。結(jié)果表明：野生種與4個(gè)栽培品種的cpDNA和mtDNA片段序列無堿基變異，而其nrDNA的片段序列卻存在3個(gè)堿基變異，但4個(gè)栽培品種間無堿基變異。以麻核桃(J.hopeiensisHu)為外類群，基于上述4個(gè)DNA片段序列構(gòu)建的MP、ML和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果一致，均表現(xiàn)為4個(gè)栽培品種聚為一組，而野生種和麻核桃則分別單獨(dú)聚為一組。野生種的觀測(cè)雜合度、預(yù)期雜合度和固定指數(shù)分別為0.383、0.448和0.153，4個(gè)栽培品種的上述3個(gè)遺傳多樣性指數(shù)分別為0.428～0.576、0.423～0.619和-0.043～0.234?；赟SR分子標(biāo)記結(jié)果的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹和分組數(shù)為5的遺傳分組結(jié)果均表明：野生種和品種‘溫185’分別單獨(dú)為一組；品種‘新新2’和‘新豐’為一組；而品種‘扎343’也單獨(dú)為一組，但與品種‘新新2’和‘新豐’遺傳關(guān)系較近。遺傳分組結(jié)果還表明：分組數(shù)為3更利于明確品種‘扎343’的分組地位，此時(shí)，其與品種‘新新2’和‘新豐’為一組。綜合分析結(jié)果表明：核桃4個(gè)栽培品種間的遺傳差異較小，且老栽培品種的遺傳多樣性總體上高于新栽培品種；野生種與栽培品種間具有明顯的遺傳差異，說明在育種或栽培過程中核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性可能會(huì)逐漸降低，并且，該野生種可為核桃的分子育種提供天然的基因庫資源。

核桃； 野生種； 栽培品種； 遺傳多樣性； DNA片段序列； SSR分子標(biāo)記

核桃(JuglansregiaLinn.)又名胡桃，隸屬胡桃屬(JuglansLinn.)，為“世界四大堅(jiān)果”樹種之一，擁有悠久的栽培歷史。在選育過程中，核桃新品種通常較老品種具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。但是，隨著核桃新品種的不斷選育，為了達(dá)到形態(tài)和遺傳的一致性，各品種間的遺傳多樣性卻逐漸喪失。這種現(xiàn)象已經(jīng)在一些動(dòng)物的育種過程中得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[2-4]。然而，從種質(zhì)資源角度來看，被替代的一些核桃老品種的某些特殊遺傳特性仍可用于培育核桃新品種或改良已有的核桃品種，因此，對(duì)于選育核桃新品種而言，保護(hù)和利用好新、老品種的種質(zhì)資源十分重要。相關(guān)研究人員已經(jīng)對(duì)核桃與其同屬近緣種間的親緣關(guān)系[5-6]、野生種群間的遺傳多樣性[7-8]以及栽培品種間的親緣關(guān)系[9-11]等進(jìn)行了研究，認(rèn)為核桃與泡核桃(J.sigillataDode)間存在遺傳滲入[5]，且其栽培品種存在多個(gè)屬于不同地理和生態(tài)類型的遺傳組[10-11]。但是，這些研究并沒有對(duì)核桃新品種與老品種間的親緣關(guān)系及其與野生種間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，而明確上述關(guān)系對(duì)于培育核桃新品種及其品種改良均具有重要作用。

新疆是中國重要的核桃種植區(qū)和野生核桃分布地，具有豐富的核桃種質(zhì)資源。目前，新疆地區(qū)種植了多個(gè)優(yōu)良的核桃品種，尤以‘溫185’(‘Wen185’)和‘新新2’(‘Xinxin2’)等薄皮核桃品種為代表。另外，在新疆鞏留野核桃自然保護(hù)區(qū)還分布有原始野生核桃種群。鑒于此，作者對(duì)新疆地區(qū)種植的4個(gè)核桃栽培品種(包括2個(gè)新栽培品種和2個(gè)老栽培品種)和鞏留野核桃自然保護(hù)區(qū)生長(zhǎng)的野生核桃cpDNA的psbK-psbI區(qū)間和mtDNA的COX2 intron Ⅰ區(qū)間以及nrDNA的ITS和ETS區(qū)間的DNA片段序列進(jìn)行比較分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并對(duì)上述5個(gè)供試材料進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，在SSR分子標(biāo)記結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳多樣性指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳分組分析，以期明確供試核桃野生種與4個(gè)栽培品種間的親緣關(guān)系，并評(píng)估其遺傳多樣性，以揭示人工選育對(duì)核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性的影響，為核桃遺傳育種研究提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的2個(gè)核桃新栽培品種‘溫185’和‘新新2’以及2個(gè)核桃老栽培品種‘新豐’(‘Xinfeng’)和‘扎343’(‘Za343’)植株均種植在新疆溫宿核桃林場(chǎng)，并且均從溫宿木本糧油林場(chǎng)核桃園的早實(shí)核桃實(shí)生群體中選育而來[12]，供試的核桃野生種植株則生長(zhǎng)在新疆鞏留野核桃自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，5個(gè)材料依次編號(hào)為1、2、3、4、5，采樣植株數(shù)分別為25、25、18、17、19。每個(gè)植株選取1枚嫩葉，共采集104枚葉片，將采集的葉片立即放入裝有硅膠的自封袋中干燥并帶回實(shí)驗(yàn)室，于室溫條件下保存、備用。

擴(kuò)增反應(yīng)使用的所有試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，所有引物合成和序列分析也均由該公司完成；使用的PCR儀為ABI Verit96梯度PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取 每個(gè)單株取經(jīng)硅膠干燥的葉片約50 mg，采用CTAB法[13]提取葉片中的基因組總DNA。

1.2.2 DNA片段序列的擴(kuò)增和分析 每個(gè)材料隨機(jī)選取5個(gè)單株的基因組總DNA樣品，對(duì)mtDNA的COX2 intron Ⅰ區(qū)間、cpDNA的psbK-psbI區(qū)間以及nrDNA的ITS和ETS區(qū)間的DNA片段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積為30 μL，擴(kuò)增體系的具體組分和擴(kuò)增程序均按照Zhang等[14]的條件完成，4個(gè)DNA片段擴(kuò)增使用的引物序列見表1。對(duì)擴(kuò)增出的所有DNA片段進(jìn)行測(cè)序，將所有原始序列進(jìn)行人工校正和Clustal X比對(duì)[15]，并將獲得的DNA片段序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號(hào)為KY809038至KY809057)。

表1 用于新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種不同DNA片段擴(kuò)增的引物序列

Table 1 Sequences of primers used for amplifying different DNA fragments of four cultivars and one wild species ofJuglansregiaLinn. in Xinjiang

DNA片段DNAfragment引物序列(5′→3′) Primersequence(5′→3′)正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerCOX2intronⅠ區(qū)間COX2intronⅠintervalGTTTACTATGGTCAGTGCAGTGCCGCTTAAGCTTCCCCGGTTpsbK-psbI區(qū)間psbK?psbIintervalTTAGCCTTTGTTTGGCAAGAGAGTTTGAGAGTAAGCATITS區(qū)間ITSintervalAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGCTCCTCCGCTTATTGATATGCETS區(qū)間ETSintervalGTATGCAACACAGGAACCCGGTATTCGGATGATGTTGGC

1.2.3 SSR分子標(biāo)記分析 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]設(shè)計(jì)SSR引物，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終篩選出具有多態(tài)性且容易擴(kuò)增的5對(duì)SSR引物，并在引物序列的5′端添加熒光信號(hào)，各引物序列見表2。對(duì)供試所有單株的基因組總DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積為30 μL，擴(kuò)增體系的具體組分和擴(kuò)增程序也按照Zhang等[14]的條件完成。對(duì)所有擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，并通過GeneMapper軟件對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行校正。

表2 用于新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種SSR分子標(biāo)記分析的引物序列

Table 2 Sequences of primers used for SSR molecular marker analysis of four cultivars and one wild species ofJuglansregiaLinn. in Xinjiang

引物編號(hào)Primercode引物序列(5′→3′) Primersequence(5′→3′)正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerWGA001ATTGGAAGGGAAGGGAAATGCGCGCACATACGTAAATCACWGA004TGTTGCATTGACCCACTTGTTAAGCCAACATGGTATGCCAWGA032CTCGGTAAGCCACACCAATTACGGGCAGTGTATGCATGTAWGA321TCCAATCGAAACTCCAAAGGGTCCAAAGACGATGATGGAWGA376GCCCTCAAAGTGATGAACGTTCATCCATATTTACCCCTTTCG

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

首先，基于測(cè)定的DNA片段序列確定核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種間的堿基變異信息；然后，以麻核桃(J.hopeiensisHu)為外類群，基于測(cè)定的4個(gè)DNA片段序列數(shù)據(jù)，使用MEGA 6.0 軟件[18]、采用MP、ML和UPGMA 3種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用靴帶檢驗(yàn)法計(jì)算各分支的靴帶支持率，重復(fù)計(jì)算1 000次。

基于SSR分子標(biāo)記結(jié)果，運(yùn)用GenAlEx 6.5軟件[19]計(jì)算每個(gè)核桃栽培品種和野生種的遺傳多樣性指數(shù)，包括差異等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度和固定指數(shù)；根據(jù)SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算不同樣品間的遺傳距離，運(yùn)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹。

基于SSR分子標(biāo)記結(jié)果，運(yùn)用STRUCTURE 2.3軟件[20]進(jìn)行Bayesian遺傳結(jié)構(gòu)分析。分組數(shù)(K)設(shè)為1～8，分別進(jìn)行10次獨(dú)立運(yùn)算；Burn-in指數(shù)設(shè)為100 000，并執(zhí)行500 000步的Markov Chain Monte Carlo模擬；依據(jù)估算模型的后驗(yàn)概率〔lnP(D)〕，按照Evanno等[21]的方法計(jì)算ΔK值，并根據(jù)ΔK值的最大值來確定供試核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的最優(yōu)分組數(shù)。運(yùn)用CLUMPP 1.1.2軟件[22]將STRUCTURE 2.3軟件的10次運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行合并，并采用DISTRUCT 1.1軟件[23]制圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 DNA片段序列的擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在基于新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的4個(gè)DNA片段序列比對(duì)后構(gòu)建的聯(lián)合數(shù)據(jù)矩陣中，序列總長(zhǎng)度為2 678 bp。在母系遺傳的cpDNA和mtDNA片段序列中，4個(gè)栽培品種與野生種間無堿基變異；而在雙親遺傳的nrDNA片段序列中，野生種與4個(gè)栽培品種間存在3個(gè)堿基變異，但4個(gè)栽培品種間無堿基變異。

比較結(jié)果顯示：基于上述4個(gè)DNA片段序列的聯(lián)合數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用MP、ML和UPGMA方法構(gòu)建的新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)的聚類結(jié)果完全一致。由圖1可見：供試核桃的4個(gè)栽培品種聚為一組，而野生種和外類群麻核桃則分別單獨(dú)聚為一組，并且，系統(tǒng)發(fā)育樹中各分支的靴帶支持率均很高。

2.2 基于SSR分子標(biāo)記的相關(guān)分析

2.2.1 遺傳多樣性指數(shù)分析 新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種4個(gè)遺傳多樣性指數(shù)(包括等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、預(yù)期雜合度和固定指數(shù))的比較結(jié)果見表3。

1： ‘溫185’ ‘Wen185’； 2： ‘新新2’ ‘Xinxin2’； 3： ‘新豐’ ‘Xinfeng’； 4： ‘扎343’ ‘Za343’； 5： 野生種 Wild species； 6： 麻核桃Juglans hopeiensis Hu. 每個(gè)分支上的3個(gè)數(shù)據(jù)依次代表MP、ML和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹的靴帶支持率 Three datums above each branch successively indicate bootstrap values of MP， ML and UPGMA phylogenetic trees.圖1 基于4個(gè)DNA片段序列的新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of four cultivars and one wild species of Juglans regia Linn. in Xinjiang based on four DNA fragment sequences

編號(hào)1)Code1)等位基因數(shù)Allelenumber觀測(cè)雜合度Observedheterozygosity預(yù)期雜合度Expectedheterozygosity固定指數(shù)Fixationindex1240 428±0 1840 423±0 1210 0742240 576±0 1590 539±0 074-0 0433170 555±0 1480 569±0 0940 1034160 516±0 1250 619±0 0860 2345180 383±0 0780 448±0 0760 153

1)1： ‘溫185’ ‘Wen185’； 2： ‘新新2’ ‘Xinxin2’； 3： ‘新豐’ ‘Xinfeng’； 4： ‘扎343’ ‘Za343’； 5： 野生種 Wild species.

由表3可見：新栽培品種‘溫185’和‘新新2’的等位基因數(shù)最多，均為24；老栽培品種‘新豐’和‘扎343’的等位基因數(shù)較少，分別為17和16；野生種的等位基因數(shù)居中，為18?！滦?’的觀測(cè)雜合度最高(0.576)，野生種最低(0.383)，‘新豐’和‘扎343’較高，而‘溫185’較低；‘扎343’的預(yù)期雜合度最高(0.619)，‘溫185’最低(0.423)，‘新豐’和‘新新2’較高，而野生種較低；‘新新2’的固定指數(shù)為-0.043，其余3個(gè)栽培品種和野生種的固定指數(shù)均為正值，其中，‘扎343’的固定指數(shù)最高(0.234)，野生種和‘新豐’次之(分別為0.153和0.103)，說明‘扎343’、‘新豐’和野生種具有較高水平的近交繁殖特征。

2.2.2 UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹分析 基于SSR分子標(biāo)記構(gòu)建的新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

1： ‘溫185’ ‘Wen185’； 2： ‘新新2’ ‘Xinxin2’； 3： ‘新豐’ ‘Xinfeng’； 4： ‘扎343’ ‘Za343’； 5： 野生種 Wild species.圖2 基于SSR分子標(biāo)記的新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 UPGMA phylogenetic tree of four cultivars and one wild species of Juglans regia Linn. in Xinjiang based on SSR molecular marker

由圖2可見：在構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹中，野生種和新栽培品種‘溫185’分別單獨(dú)為一組；新栽培品種‘新新2’與老栽培品種‘新豐’為一組；老栽培品種‘扎343’也單獨(dú)為一組，但是其與‘新新2’和‘新豐’的遺傳關(guān)系較近。

2.2.3 遺傳分組分析 STRUCTURE 2.3軟件的分析結(jié)果表明：后驗(yàn)概率〔lnP(D)〕隨分組數(shù)(K)的增大而逐漸升高(圖3-A)，根據(jù)ΔK值確定的最優(yōu)分組數(shù)為5(圖3-B)。

遺傳分組結(jié)果表明：K值為5時(shí)，新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的分組結(jié)果(圖4-A)與其基于SSR分子標(biāo)記結(jié)果的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果相同，即野生種單獨(dú)為一組；新栽培品種‘溫185’單獨(dú)為一組；新栽培品種‘新新2’與老栽培品種‘新豐’為一組；老栽培品種‘扎343’的分組比較混亂(內(nèi)部個(gè)體形成2組，其中一組與品種‘新新2’和‘新豐’一組近緣，另一組則單獨(dú)為一組)，或單獨(dú)為一組?？梢?，K值為5的分組結(jié)果不利于明確品種‘扎343’的分組地位。

為了更清晰地明確品種‘扎343’的分組地位，對(duì)K值為3時(shí)的分組情況進(jìn)行了分析(圖4-B)，結(jié)果表明：品種‘扎343’、‘新新2’和‘新豐’為一組，而野生種和品種‘溫185’分別單獨(dú)為一組。

lnP(D)： 后驗(yàn)概率 Posterior probability； K： 分組數(shù) Cluster number.圖3 新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的分組分析Fig. 3 Analysis on cluster of four cultivars and one wild species of Juglans regia Linn. in Xinjiang

1： ‘溫185’ ‘Wen185’； 2： ‘新新2’ ‘Xinxin2’； 3： ‘新豐’ ‘Xinfeng’； 4： ‘扎343’ ‘Za343’； 5： 野生種 Wild species.圖4 分組數(shù)為5(A)和3(B)時(shí)新疆核桃4個(gè)栽培品種和1個(gè)野生種的遺傳分組結(jié)果Fig. 4 Genetic cluster results of four cultivars and one wild species of Juglans regia Linn. in Xinjiang with cluster number of 5 (A) and 3 (B)

3 討論和結(jié)論

不同品種間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性差異是評(píng)估園藝植物種質(zhì)資源狀況的重要依據(jù)。本研究采用cpDNA的psbK-psbI區(qū)間、mtDNA的COX2 intron Ⅰ區(qū)間以及nrDNA的ITS和ETS區(qū)間4個(gè)DNA片段序列和SSR分子標(biāo)記對(duì)新疆核桃4個(gè)栽培品種(包括2個(gè)新栽培品種和2個(gè)老栽培品種)和1個(gè)野生種(生長(zhǎng)在新疆鞏留野核桃自然保護(hù)區(qū))間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性差異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：基于4個(gè)DNA片段序列構(gòu)建的MP、ML和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果完全一致，4個(gè)栽培品種直接聚為一組，說明他們具有相同的基因型，并且各栽培品種間的遺傳差異較小。

基于SSR分子標(biāo)記構(gòu)建的UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹和分組數(shù)(K)為3時(shí)的分組結(jié)果均顯示：新栽培品種‘新新2’與老栽培品種‘新豐’和‘扎343’為一組，而新栽培品種‘溫185’卻單獨(dú)為一組，說明品種‘新新2’繼承了2個(gè)老栽培品種的種質(zhì)資源，而‘溫185’與2個(gè)老栽培品種間的種質(zhì)資源卻存在明顯差異?！?43’和‘新豐’是20世紀(jì)70年代至80年代選育出的核桃優(yōu)良栽培品種，而‘溫185’和‘新新2’則是20世紀(jì)80年代末至90年代基于更高標(biāo)準(zhǔn)選育出的更加優(yōu)良的核桃新栽培品種[24-25]。這就導(dǎo)致有些新栽培品種可能繼承了老栽培品種的一些種質(zhì)資源，還有些新栽培品種與老栽培品種間的種質(zhì)資源可能存在一定的遺傳差異。

遺傳分組結(jié)果表明：K值為5時(shí)，老栽培品種‘扎343’表現(xiàn)出比較特殊的遺傳結(jié)構(gòu)，說明‘扎343’存在特殊的種質(zhì)資源，這些特殊的種質(zhì)資源應(yīng)該受到保護(hù)和保存，以便在日后的分子育種過程中得以利用。王國安等[12]曾利用老栽培品種‘扎343’二次果核桃的早實(shí)性從其實(shí)生群體中選育出優(yōu)良的矮化核桃單株，從而培育出核桃矮化新品種。實(shí)際上，核桃的野生種與栽培品種同屬于1個(gè)物種，因此，他們?cè)谀赶颠z傳的mtDNA的COX2 intron Ⅰ區(qū)間和cpDNA的psbK-psbI區(qū)間的片段序列間保留了遺傳同一性。而基于雙親遺傳的nrDNA的ITS和ETS區(qū)間的片段序列以及基于SSR分子標(biāo)記結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳分組結(jié)果卻顯示新疆核桃野生種與栽培品種間具有顯著的遺傳差異，說明新疆核桃野生種可為其分子育種提供天然的基因資源，這些基因資源對(duì)于核桃的品種改良和新品種培育具有重大作用。然而，本研究中，新疆核桃野生種的觀測(cè)雜合度(0.383)較低，固定指數(shù)卻較高(0.153)，說明該野生種群的遺傳多樣性較低，但種群內(nèi)的近交繁殖水平卻較高，表明新疆核桃野生種群已經(jīng)出現(xiàn)遺傳同一性現(xiàn)象，急需開展保育工作。

Gunn等[5]認(rèn)為，人類的居住環(huán)境和家族譜系關(guān)系等人類活動(dòng)對(duì)核桃在地理空間上的遺傳變異有較大影響。此外，為了獲取較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和遺傳穩(wěn)定性，人們不斷開展的定向選擇育種也會(huì)對(duì)核桃的種質(zhì)資源造成一定的影響。本研究中，2個(gè)核桃老栽培品種的遺傳多樣性水平高于2個(gè)核桃新栽培品種，說明在核桃育種過程中可能會(huì)逐漸降低其種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平。而且，供試的3個(gè)核桃栽培品種‘溫185’、‘新豐’和‘扎343’的固定指數(shù)均為正值，說明這3個(gè)核桃栽培品種內(nèi)部存在較高水平的近交繁殖現(xiàn)象，表明選擇性育種或者栽培過程中的無性繁殖可能會(huì)增加核桃種質(zhì)資源的純合度。

本研究中，K值為5時(shí)，老栽培品種‘扎343’的內(nèi)部衍生出2個(gè)遺傳類型，其中，一個(gè)類型與新栽培品種‘新新2’和老栽培品種‘新豐’近緣，另一個(gè)類型則自成一組。這可能是因?yàn)楣┰嚨亩鄶?shù)核桃栽培品種的觀測(cè)雜合度較高，在遺傳分組時(shí)若設(shè)置的K值較大，則會(huì)造成品種‘扎343’內(nèi)部的部分個(gè)體形成新的分組，因此，在對(duì)核桃栽培品種進(jìn)行遺傳分組時(shí)，應(yīng)設(shè)置合適的K值，否則不利于探查不同核桃栽培品種間的遺傳分組情況。

[1] 張 強(qiáng)， 虎海防， 李西萍. 七個(gè)新疆良種核桃品質(zhì)評(píng)價(jià)分析[J]. 北方園藝， 2010， 34(19)： 16-17.

[2] 趙廣泰， 劉賢德， 王志勇， 等. 大黃魚連續(xù)4代選育群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2010， 34(4)： 500-507.

[3] 陳雪峰， 楊國梁， 孔 杰， 等. 人工養(yǎng)殖與選育對(duì)羅氏沼蝦遺傳多樣性的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 2012， 36(5)： 866-873.

[4] LI Z X， LI J， WANG Q Y， et al. The effects of selective breeding on the genetic structure of shrimpFenneropenaeuschinensispopulations[J]. Aquaculture， 2006， 258： 278-282.

[5] GUNN B F， ARADHYA M， SALICK J M， et al. Genetic variation in walnuts (JuglansregiaandJ.sigillata； Juglandaceae)： species distinctions， human impacts， and the conservation of agrobiodiversity in Yunnan， China[J]. American Journal of Botany， 2010， 97： 660-671.

[6] WANG H， PAN G， MA Q G， et al. The genetic diversity and introgression ofJuglansregiaandJuglanssigillatain Tibet as revealed by SSR markers[J]. Tree Genetics and Genomes， 2014， 11： 1-11.

[7] 王東升， 辛 紅， 邢世巖， 等. 基于AFLP標(biāo)記的山東省5個(gè)野核桃群體的遺傳多樣性分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2013， 22(3)： 63-69.

[8] 張 捷， 李勤霞， 張 萍， 等. 基于SRAP分子標(biāo)記新疆野核桃的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2016： 17(2)： 239-245.

[9] CHEN L N， MA Q G， CHEN Y K， et al. Identification of major walnut cultivars grown in China based on nut phenotypes and SSR markers[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 168： 240-248.

[10] 李 超， 羅淑萍， 秦 偉， 等. 新疆核桃親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 47(9)： 1722-1727.

[11] 劉朝斌， 張文輝. 核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2012， 32(6)： 1118-1125.

[12] 王國安， 張 強(qiáng)， 阿卜杜許庫爾·牙合甫. 新溫609、新溫724等6個(gè)核桃矮化品種的選育[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 48(7)： 1183-1188.

[13] DOYLE J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.

[14] ZHANG H X， ZHANG M L， WANG L N. Genetic structure and historical demography ofMalussieversiiin the Yili Valley and the western mountains of the Junggar Basin， Xinjiang， China[J]. Journal of Arid Land， 2015， 7： 264-271.

[15] THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. The Clustal X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25： 4876-4882.

[16] DANGL G S， WOESTE K， ARADHYA M K， et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2005， 130： 348-354.

[17] WOESTE K， BURNS R， RHODES O， et al. Thirty polymorphic nuclear microsatellite loci from black walnut[J]. Journal of Heredity， 2002， 93： 58-60.

[18] TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30： 2725-2729.

[19] PEAKALL R， SMOUSE P E. GenAlEx 6.5： genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research—an update[J]. Bioinformatics， 2012， 28： 2537-2539.

[20] PRITCHARD J K， STEPHENS M， DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics， 2000， 155： 945-959.

[21] EVANNO G， REGNAUT S， GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE： a simulation study[J]. Molecular Ecology， 2005， 14： 2611-2620.

[22] JAKOBSSON M， ROSENBERG N A. CLUMPP： a cluster matching and permutation program for dealing with label switching and multimodality in analysis of population structure[J]. Bioinformatics， 2007， 23： 1801-1806.

[23] ROSENBERG N A. DISTRUCT： a program for the graphical display of population structure[J]. Molecular Ecology Resources， 2004， 4： 137-138.

[24] 張樹信. 核桃新品種新早豐、新萃豐及新巨豐的選育[J]. 中國果樹， 1990(3)： 76-78.

[25] 張樹信. 新疆核桃良種資源[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1989(3)： 30-31.

(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Analysis on genetic diversity of four cultivars and wild species ofJuglansregiain Xinjiang

ZHANG Hongxiang1， ZHANG Mingli1，2，①， GUI Dongwei3， JIANG Li1

(1. Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in Arid Land， Xinjiang Institute of Ecology and Geography， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China； 2. Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100093， China； 3. Cele National Station of Observation and Research for Desert-Grassland Ecosystem， Cele 848300， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(2)： 10-16

Taking four cultivars (including newly cultivar of ‘Wen185’ and ‘Xinxin2’ and old cultivar of ‘Xinfeng’ and ‘Za343’) ofJuglansregiaLinn. planted in Xinjiang region and wildJ.regiagrown in Gongliu Wild Walnut Nature Reserve as research objects， the DNA fragment sequences ofpsbK-psbIinterval of cpDNA andCOX2 intron Ⅰ interval of mtDNA， and ITS and ETS intervals of nrDNA were comparatively analyzed， and their MP， ML and UPGMA phylogenetic trees were analyzed. Otherwise， based on SSR molecular marker results， their genetic diversity indexes， UPGMA phylogenetic tree and genetic cluster were also analyzed. The results show that there is no base variation of fragment sequences of cpDNA and mtDNA among wild species and four cultivars， while there are three base variations of fragment sequences of their nrDNA， but there is no base variation among four cultivars. TakingJ.hopeiensisHu as an outer group， the cluster results of MP， ML and UPGMA phylogenetic trees constructed based on above four DNA fragment sequences are identical， all appear that four cultivars are clustered into one group， while wild species andJ.hopeiensisare clustered into independent group， respectively. The observed heterozygosity， expected heterozygosity and fixation index of wild species are 0.383， 0.448 and 0.153， respectively， and the above three genetic diversity indexes of four cultivars are 0.428-0.576， 0.423-0.619 and -0.043-0.234， respectively. The results of UPGMA phylogenetic tree based on SSR molecular marker results and genetic cluster with cluster number of 5 both show that wild species and cultivar ‘Wen185’ are independent group， respectively， and cultivar ‘Xinxin2’and ‘Xinfeng’ are one group， while cultivar ‘Za343’ is also an independent group， but it has a closer genetic relationship with cultivar ‘Xinxin2’and ‘Xinfeng’. The genetic cluster results also show that cluster number of 3 is more suitable for defining the cluster status of cultivar ‘Za343’， right now， it is one group with cultivar ‘Xinxin2’and ‘Xinfeng’. The result of comprehensive analysis indicates that the genetic difference among four cultivars ofJ.regiais small， and in general， the genetic diversity of old cultivars is higher than that of newly cultivars. In addition， there are obvious genetic differences between wild species and cultivars， meaning that genetic diversity of germplasm resource ofJ.regiamight decrease gradually during breeding or cultivation processes， and the wild species can provide natural gene pool resource for molecular breeding ofJ.regia.

JuglansregiaLinn.； wild species； cultivar； genetic diversity； DNA fragment sequence； SSR molecular marker

2016-08-30

中國科學(xué)院西部之光項(xiàng)目(XBBS-2014-18)； 中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃(STS)項(xiàng)目(KFJ-SW-STS-176)； 中國科學(xué)院西部之光項(xiàng)目(XBBS-2014-12)； 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31500271)

張宏祥(1986—)，男，湖南沅陵人，博士，助理研究員，主要從事干旱區(qū)植物資源保護(hù)與植物地理研究。

①通信作者E-mail： zhangml@ibcas.ac.cn

Q946-33； S664.1.024

A

1674-7895(2017)02-0010-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.02.02