青錢柳葉片解剖結構及黃酮、三萜和多糖的組織化學定位觀察

周明明， 錢晨云， 劉 洋， 方升佐，①， 楊萬霞， 尚旭嵐

(南京林業(yè)大學： a. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， b. 林學院， 江蘇 南京 210037)

青錢柳葉片解剖結構及黃酮、三萜和多糖的組織化學定位觀察

周明明a，b， 錢晨云a，b， 劉 洋a，b， 方升佐a，b，①， 楊萬霞a，b， 尚旭嵐a，b

(南京林業(yè)大學： a. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， b. 林學院， 江蘇 南京 210037)

青錢柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja〕隸屬于胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(CyclocaryaIljinskaja)，為中國特有的單種屬植物，具有較高的藥用、材用和觀賞等價值[1]；青錢柳葉片中含有多種次生代謝成分，具有多種藥理活性[2-4]。目前，對于青錢柳次生代謝成分的研究主要集中在提取、分離和純化及不同種源間次生代謝成分的變化規(guī)律等方面，其中，已有研究者就基因型和環(huán)境對青錢柳黃酮含量變化的影響以及青錢柳葉片中三萜成分的組織化學定位進行了研究[5-6]，但不同種源青錢柳葉片中黃酮、三萜和多糖類成分的分布是否存在差異尚不清楚。

鑒于此，本研究采用植物解剖學和組織化學方法，對來源于湖北五峰、湖南沅陵和四川沐川的青錢柳葉片的顯微結構及葉片中黃酮、三萜和多糖的組織化學定位進行了分析，以期為青錢柳葉片中黃酮、三萜及多糖的合成和分布研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗地位于江蘇鎮(zhèn)江(東經(jīng)119°32′52″、北緯32°16′40″)，屬亞熱帶季風氣候，年降水量1 000 mm，年均溫14.1 ℃，無霜期220 d，空氣相對濕度75%～85%；土壤多為砂壤土。

供試種子于2009年10月分別采自湖北五峰(東經(jīng)110°40′13″、北緯30°12′08″)、湖南沅陵(東經(jīng)110°22′48″、北緯28°28′12″)和四川沐川(東經(jīng)103°47′10″、北緯28°58′20″)的青錢柳天然林。2010年3月，將來源于上述產(chǎn)地的青錢柳種子經(jīng)過層積催芽后播種，參照Deng等[7]的方法進行容器育苗；當年6月初移栽至實驗地，株距40 cm、行距50 cm。8月20日，在3個種源中各選擇苗高和地徑接近平均值的樣株5株，每株隨機采集4枚新鮮成熟葉片，用于顯微結構觀察和組織化學定位分析。

1.2 方法

1.2.1 顯微結構觀察 選取葉片中部，切成邊長約5 mm的小塊，采用石蠟切片法[8]制片，切片厚度10 μm，切片方向為橫切；采用Leica-DMLB顯微鏡(德國Leica公司)觀察并拍照。

1.2.2 組織化學定位觀察 采用冰凍切片法[9]將葉片主脈橫切，切片厚度20 μm；參照徐國均等[10]的方法進行黃酮的組織化學定位，參照李雁群等[11]的方法進行三萜和多糖的組織化學定位，并制成臨時裝片，采用Leica-DMLB顯微鏡觀察并拍照。

2 結果和分析

2.1 青錢柳葉片的顯微結構

3個種源青錢柳葉片橫切面的解剖結構一致，其中，來源于湖北五峰的青錢柳葉片橫切面的解剖結構見圖1。

由圖1可以看出：從橫切面上看，青錢柳葉片為異面葉，由表皮、葉肉和葉脈組成。表皮細胞方形或長方形，上、下表皮均由1層致密的表皮細胞組成，下表皮散生有氣孔，表皮具腺毛。葉肉細胞分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織由1層柱狀細胞構成，排列緊密；海綿組織由形狀不規(guī)則的細胞構成，排列疏松。主脈發(fā)達，其上、下表皮內(nèi)有1或2層厚角組織，內(nèi)層排列有形狀不規(guī)則的薄壁組織細胞；包含半圓形的維管束1個，其中，木質(zhì)部位于近軸面，韌皮部位于遠軸面。

E： 表皮Epidermis； Vb： 維管束Vascular bundle； X： 木質(zhì)部Xylem； P： 韌皮部Phloem； Co： 厚角組織Collenchyma； St： 海綿組織Spongy tissue； Pt： 柵欄組織Palisade tissue； Gh： 腺毛Glandular hair.1： 主脈 Main vein； 2： 側脈 Lateral vein.圖1 來源于湖北五峰的青錢柳葉片橫切面的解剖結構Fig. 1 Anatomical structure of leaf transverse section of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja from Wufeng of Hubei

2.2 黃酮、三萜和多糖類成分的組織化學定位

不同種源青錢柳葉片中黃酮、三萜和多糖的組織化學定位觀察結果見圖2。

E： 表皮Epidermis； Gh： 腺毛Glandular hair； Vb： 維管束Vascular bundle； X： 木質(zhì)部Xylem； P： 韌皮部Phloem； Pt： 柵欄組織Palisade tissue； St： 海綿組織Spongy tissue.1-3： 黃酮的組織化學定位 Histochemical localization of flavonoids； 4-6： 三萜的組織化學定位 Histochemical localization of triterpenoids； 7-9： 多糖的組織化學定位 Histochemical localization of polysaccharides. 1，4，7： 湖北五峰種源 Provenance from Wufeng of Hubei； 2，5，8： 湖南沅陵種源 Provenance from Yuanling of Hu’nan； 3，6，9： 四川沐川種源Provenance from Muchuan of Sichuan.圖2 3個青錢柳種源葉片中黃酮、三萜和多糖的組織化學定位Fig. 2 Histochemical localization of flavonoids， triterpenoids and polysaccharides in leaf of Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja from three provenances

由圖2可以看出：來源于湖北五峰、湖南沅陵和四川沐川的青錢柳葉片中黃酮、三萜和多糖在葉片組織的組織化學定位特征基本一致。從黃酮的組織化學定位看(圖2-1～3)，腺毛和表皮顯黃綠色熒光，木質(zhì)部和韌皮部顯天藍色熒光。從三萜的組織化學定位看(圖2-4～6)，腺毛、表皮、韌皮部和柵欄組織均顯色，其中，柵欄組織顯色最明顯。從多糖的組織化學定位看(圖2-7～9)，葉片各組織均顯紫紅色，其中，柵欄組織顯色最明顯，韌皮部顯色次之。

3 討論和結論

葉片形態(tài)解剖結構是葉片生理功能的基礎，能夠反映植物對環(huán)境變化的響應與適應[12]。尚旭嵐等[13]認為，在不同光照和施肥條件下青錢柳葉片呈現(xiàn)旱生葉和陰生葉特征；孫同興等[14]和王玉等[15]的觀察結果顯示，在青錢柳葉片的主脈維管組織中，在正常維管束的側面或上方具有1個副維管束；而本研究在青錢柳葉片解剖結構中并沒有觀察到這一特征，其余結構則與他們的報道基本一致。造成這一差異的原因可能與青錢柳的株齡、基因型和生長條件以及顯微觀察的放大倍率有關，具體原因有待進一步研究。

組織化學定位觀察結果表明：在青錢柳葉片中，黃酮主要分布于腺毛和表皮等外部組織中，可能與其防止微生物入侵、抗紫外輻射傷害有關[16]，但在木質(zhì)部和韌皮部中大量積累，在柵欄組織和海綿組織中未有分布，其原因有待進一步研究。三萜主要位于青錢柳葉片的腺毛、表皮、韌皮部和柵欄組織中，而王玉[6]認為三萜化合物存在于青錢柳葉片的腺毛、表皮、皮層薄壁細胞、木質(zhì)部、韌皮部和柵欄組織中，這種差異可能與青錢柳的生長環(huán)境和株齡有關。多糖在青錢柳葉片各組織均有分布，并在柵欄組織中含量最高。在青錢柳葉片中，三萜和多糖均在柵欄組織中大量積累，表明柵欄組織可能是三萜和多糖的重要合成場所。

綜合分析結果表明：來源于湖北五峰、湖南沅陵和四川沐川的青錢柳葉片的解剖結構以及葉片中黃酮、三萜和多糖的組織化學定位特征基本一致。青錢柳葉片具有典型異面葉的特征，葉肉細胞分化為柵欄組織和海綿組織；青錢柳葉片中的黃酮在木質(zhì)部和韌皮部中大量積累，而三萜和多糖均在柵欄組織中大量積累。但青錢柳葉片中黃酮、三萜和多糖的分布機制及這些活性成分與青錢柳生長和抗性生理的相關性則有待進一步研究。

[1] 楊萬霞， 方升佐. 青錢柳種皮甲醇浸提液的生物測定[J]. 植物資源與環(huán)境學報， 2005， 14(4)： 11-14.

[2] 李 磊， 謝明勇， 易 醒， 等. 青錢柳多糖組分及其降血糖活性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報， 2001， 23(4)： 484-486.

[3] 黃明圈， 上官新晨， 徐明生， 等. 青錢柳多糖降血脂作用的研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報， 2011， 33(1)： 157-161.

[4] XIE J H， SHEN M Y， XIE M Y， et al. Ultrasonic-assisted extraction， antimicrobial and antioxidant activities ofCyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 89： 177-184.

[5] DENG B， CAO Y N， FANG S Z， et al. Variation and stability of growth and leaf flavonoid content inCyclocaryapaliurusacross environments[J]. Industrial Crops and Products， 2015， 76： 386-393.

[6] 王 玉. 青錢柳三萜皂苷的組織化學和細胞化學定位[D]. 南京： 南京林業(yè)大學林學院， 2011： 22-27.

[7] DENG B， SHANG X L， FANG S Z， et al. Integrated effects of light intensity and fertilization on growth and flavonoid accumulation inCyclocaryapaliurus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60： 6286-6292.

[8] 沈梅芬， 劉慧芳， 黃美俐. 生物微觀標本制作[M]. 上海： 上海教育出版社， 1982： 11-23.

[9] 謝佩松， 徐中根， 韋存虛. 冰凍切片技術在植物顯微結構和組織化學中的應用[J]. 生物學雜志， 2009， 26(3)： 72-74.

[10] 徐國均， 何宏賢， 徐珞珊， 等. 中國藥材學： 上冊[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 1996： 30-32.

[11] 李雁群， 杜金子， 尹小紅， 等. 石韋孢子葉片組織化學定位[J]. 基因組學與應用生物學， 2009， 28(2)： 345-348.

[12] 李芳蘭， 包維楷. 植物葉片形態(tài)解剖結構對環(huán)境變化的響應與適應[J]. 植物學通報， 2005， 22(增刊)： 118-127.

[13] 尚旭嵐， 李瓊瓊， 鄧 波， 等. 光照和施肥對青錢柳幼苗葉片性狀與解剖結構的影響[J]. 西南林業(yè)大學學報， 2014， 34(6)： 9-15.

[14] 孫同興， 徐麗麗. 青錢柳葉的結構鑒定[J]. 中草藥， 2006， 37(2)： 271-273.

[15] 王 玉， 趙 虎， 洑香香. 青錢柳營養(yǎng)器官的解剖結構及其生態(tài)適應性[J]. 東北林業(yè)大學學報， 2011， 39(10)： 40-44.

[16] SCHMITZ-HOERNER R， WEISSENB?CK G. Contribution of phenolic compounds to the UV-B screening capacity of developing barley primary leaves in relation to DNA damage and repair under elevated UV-B levels[J]. Phytochemistry， 2003， 64： 243-255.

(責任編輯： 郭嚴冬)

Observation on leaf anatomical structure and histochemical localization of flavonoids， triterpenoids and polysaccharides in leaf ofCyclocaryapaliurus

ZHOU Mingminga，b， QIAN Chenyuna，b， LIU Yanga，b， FANG Shengzuoa，b，①， YANG Wanxiaa，b， SHANG Xulana，b

(Nanjing Forestry University： a. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， b. College of Forestry， Nanjing 210037， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(2)： 107-109

Taking one-year-old seedlings ofCyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja from three provenances (Wufeng of Hubei， Yuanling of Hu’nan and Muchuan of Sichuan) as experimental materials， the structure of leaf transverse section and histochemical localization of flavonoids， triterpenoids and polysaccharides were observed. The results show that the anatomical structure of leaf transverse section and the distribution pattern of flavonoids， triterpenoids and polysaccharides in leaf ofC.paliurusfrom three provenances are generally consistent. Leaf belongs to bifacial leaf， and stomas locate on lower epidermis. The primary vein is well developed， and there is an obvious differentiation in palisade tissue and spongy tissue. Flavonoids are mainly distributed in glandular hair， epidermis， phloem and xylem， and their contents are relatively higher in phloem and xylem. Triterpenoids are mainly distributed in glandular hair， epidermis， phloem and palisade tissue. Polysaccharides are distributed in each tissue of leaf. In which， contents of triterpenoids and polysaccharides in palisade tissue are relatively higher.

青錢柳； 葉片解剖結構； 黃酮； 三萜； 多糖； 組織化學定位

Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja； leaf anatomical structure； flavonoids； triterpenoids； polysaccharides； histochemical localization

2016-06-24

國家自然科學基金資助項目(31270673)； 江蘇省第四期“333工程”培養(yǎng)資金資助項目

周明明(1992—)，女，湖北鄂州人，碩士研究生，主要從事人工林定向培育研究。

①通信作者E-mail： fangsz@njfu.edu.cn

Q949.735； Q944.5； Q946

A

1674-7895(2017)02-0107-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.02.14