茅山地區(qū)南蒼術(shù)的特異性分子標(biāo)記研究

王明強(qiáng)， 湯詩(shī)杰， 方 彥， 薛佳宇

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 植物多樣性及系統(tǒng)演化研究中心， 江蘇 南京 210014；2. 南京森林警察學(xué)院， 江蘇 南京 210023〕

茅山地區(qū)南蒼術(shù)的特異性分子標(biāo)記研究

王明強(qiáng)1，①， 湯詩(shī)杰1，①， 方 彥2， 薛佳宇1，②

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 植物多樣性及系統(tǒng)演化研究中心， 江蘇 南京 210014；2. 南京森林警察學(xué)院， 江蘇 南京 210023〕

以中國(guó)野生南蒼術(shù)〔Atractylodeslancea(Thunb.) DC.〕全部分布區(qū)9個(gè)居群(包括江蘇句容的茅山居群、射烏山居群和小九華山居群，安徽金寨的燕子河居群和天堂寨居群，河南嵩縣的五馬寺居群和紙坊居群，湖北的保康后坪居群和紅安七里坪居群)為研究對(duì)象，進(jìn)行rbcL、matK、psbA-trnH、ITS和nadF片段序列比對(duì)及SRAP指紋圖譜比較來(lái)篩選江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)的特異性分子標(biāo)記。結(jié)果表明：通過(guò)5個(gè)DNA片段的序列比對(duì)，江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)在nadF片段的第581位點(diǎn)處堿基為T，其余8個(gè)居群為A，可以將江蘇句容茅山居群與其余8個(gè)居群區(qū)分開(kāi)。利用SRAP隨機(jī)引物篩選出1條江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)特有的長(zhǎng)度為323 bp的條帶，根據(jù)該條帶序列設(shè)計(jì)1對(duì)SCAR引物，正向引物序列為5′-ATCTTTGCTATTAACTATTAAGCTATTCTTCGCTATTCA-3′，反向引物序列為5′-CGATGTTGAAATTGCTGTCTCTGCTTTCTATTC-3′，該引物可在江蘇句容茅山居群所有南蒼術(shù)單株中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為268 bp的特異性條帶，而在其他居群中均不能擴(kuò)增出該條帶。本研究篩選出的2種特異性標(biāo)記可以為鑒定南蒼術(shù)的道地性提供可靠的技術(shù)支持。

南蒼術(shù)； 道地性； 茅山地區(qū)；nadF片段； SRAP-SCAR

南蒼術(shù)〔Atractylodeslancea(Thunb.) DC.〕，又名茅蒼術(shù)，為菊科(Asteraceae)蒼術(shù)屬(AtractylodesDC.)植物，主要分布于江蘇、安徽、湖北和河南等狹小區(qū)域，生于野生山坡草地、林下、灌叢及巖石縫隙中[1]。蒼術(shù)是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材[2]，江蘇茅山地區(qū)的南蒼術(shù)質(zhì)量尤佳，美譽(yù)自古有之。《本草經(jīng)集注》[3]中記錄蒼術(shù)“今處處有之，以蔣山、白山、茅山者為勝”，即今江蘇的南京、句容等地，亦可知茅山南蒼術(shù)早已是道地藥材。

彭華勝等[4]觀察到，南蒼術(shù)葉及根狀莖的形態(tài)隨海拔升高呈現(xiàn)連續(xù)的變化，且在不同生長(zhǎng)期和不同生境，同一居群不同個(gè)體間也有較大差異，不同居群的個(gè)體從形態(tài)上很難區(qū)分。在揮發(fā)油總含量上，茅山地區(qū)南蒼術(shù)較其他地區(qū)的南蒼術(shù)低[5]，且揮發(fā)油中的蒼術(shù)素和蒼術(shù)酮含量高，不含或含較少的茅術(shù)醇和β-桉葉醇[6-7]，但揮發(fā)油含量的測(cè)定周期較長(zhǎng)、檢測(cè)成本較高，且個(gè)體間差異大[8]，因此，化學(xué)成分含量無(wú)法成為一種有效而穩(wěn)定的鑒別依據(jù)。

與形態(tài)和化學(xué)成分相比，植物的基因組DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，利用DNA分子標(biāo)記鑒別道地藥材更為快速、準(zhǔn)確。已有研究結(jié)果顯示，利用DNA序列差異可以鑒別道地藥材。余永邦等[9]對(duì)14個(gè)地區(qū)太子參〔Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax〕的ITS序列進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果表明ITS序列可以鑒別江蘇產(chǎn)區(qū)及其他非道地產(chǎn)區(qū)的太子參；張宏意等[10]也用ITS序列鑒別四川、廣東、湖北等地的何首烏〔Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.〕；孔德政等[11]用psbA-trnH序列分析牛膝(AchyranthesbidentataBlume)道地產(chǎn)區(qū)河南8個(gè)區(qū)域的野生居群，可以將新鄉(xiāng)九蓮山、南陽(yáng)老界嶺、信陽(yáng)靈山和南陽(yáng)淮源的牛膝鑒別開(kāi)。南蒼術(shù)也有類似的研究，如利用trnL-F和ITS[12-13]等序列可以將南蒼術(shù)與蒼術(shù)屬其他植物區(qū)分開(kāi)，但尚無(wú)利用DNA片段序列差異鑒別道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)南蒼術(shù)的相關(guān)研究報(bào)道。

此外，利用隨機(jī)引物擴(kuò)增圖譜差異也可以鑒定道地藥材，如利用RAPD、SSR和ISSR圖譜等[14-17]可以區(qū)分不同來(lái)源的球花石斛(DendrobiumthyrsiflorumRchb. f.)、當(dāng)歸〔Angelicasinensis(Oliv.) Diels〕、鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)和貝母(Fritillariaspp.)等藥材，將隨機(jī)引物擴(kuò)增出的特有條帶測(cè)序后轉(zhuǎn)化成特異性SCAR標(biāo)記，能顯著提高隨機(jī)引物標(biāo)記的穩(wěn)定性及可重復(fù)性，在川牛膝(CyathulaofficinalisK. C. Kuan)和寧夏枸杞(LyciumbarbarumLinn.)等[18-19]藥材的鑒別研究中均有報(bào)道。在針對(duì)南蒼術(shù)的研究中，任冰如等[20]利用擴(kuò)增出的RAPD指紋圖譜差異，將南蒼術(shù)分為南蒼術(shù)類群和大別山類群；郭蘭萍等[21]利用RAPD探討不同產(chǎn)地南蒼術(shù)遺傳多樣性時(shí)，認(rèn)為茅山南蒼術(shù)單獨(dú)為一類。但目前尚無(wú)利用隨機(jī)引物的指紋圖譜來(lái)開(kāi)發(fā)用于南蒼術(shù)道地性鑒別的特異性SCAR分子標(biāo)記。

本文利用南蒼術(shù)不同居群基因組序列差異及特異性分子標(biāo)記，建立南蒼術(shù)道地性鑒別的分子鑒別體系，以期為道地藥材的種質(zhì)保護(hù)提供簡(jiǎn)便而穩(wěn)定的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料

在中國(guó)野生南蒼術(shù)分布區(qū)江蘇、安徽、河南及湖北采集9個(gè)居群100個(gè)單株(表1)，每株取2～3枚幼嫩且無(wú)病蟲(chóng)害葉片，清洗后保存于-80 ℃，用于總DNA的提取。

實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所杭悅宇研究員鑒定，憑證標(biāo)本存放于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館(NAS)。

1.2 方法

1.2.1 樣品總DNA提取 每個(gè)樣品取0.1 g葉片，用EasyPure Plant Genomic DNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取總DNA，溶于200 μL滅菌超純水中，-20 ℃保存、備用。

表1 南蒼術(shù)9個(gè)居群供試材料基本采集信息

Table 1 Basic collection information of materials tested from nine populations ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC.

編號(hào)No．采集地Locality株數(shù)Numberofindividuals采集號(hào)No．ofcollectionAL1江蘇句容茅山MaoshaninJurongofJiangsu20201510021-201510040AL2江蘇句容射烏山ShewushaninJurongofJiangsu10201510011-201510020AL3江蘇句容小九華山XiaojiuhuashaninJurongofJiangsu10200606001-200606010AL4安徽金寨燕子河YanziheinJinzhaiofAnhui10200606021-200606030AL5安徽金寨天堂寨TiantangzhaiinJinzhaiofAnhui10201508011-201508020AL6河南嵩縣五馬寺WumasiinSongxianofHe’nan10201509001-201509010AL7河南嵩縣紙坊ZhifanginSongxianofHe’nan10201509011-201509020AL8湖北保康后坪HoupinginBaokangofHubei10200311001-200311010AL9湖北紅安七里坪QilipinginHonganofHubei10201510001-201510010

1.2.2 5個(gè)DNA片段序列測(cè)定

1.2.2.1 引物信息 對(duì)rbcL、matK、psbA-trnH、ITS和nadF5個(gè)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。其中，前4個(gè)DNA片段為國(guó)際通用的條形碼片段，為區(qū)分物種或居群較常用的DNA片段；nadF片段為作者自行篩選的DNA片段，變異率較高，適合進(jìn)行種下水平的區(qū)分。rbcL、matK、psbA-trnH和ITS片段的擴(kuò)增引物選擇通用引物，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)布的菊科cpDNA序列，利用Oligo 6軟件自行設(shè)計(jì)nadF片段的引物，各引物信息見(jiàn)表2。

表2 南蒼術(shù)9個(gè)居群的PCR擴(kuò)增片段引物信息

Table 2 Primer information of PCR amplified fragment from nine populations ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC.

片段Fragment引物Primer引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)來(lái)源SourcerbcL1FATGTCACCACAAACAGAAACFa，etal．[22]724RTCGCATGTACCTGCAGTAGCmatKtrnK-3914FGCTCCAGAAGATGTTGATCGBayer，etal．[23]matK-1541RGGGGTTGCTAACTCAACGGpsbA-trnHpsbA-FGTTATGCATGAACGTAATGCTCSang，etal．[24]psbA-trnH-RCGCGCATGGTGGATTCACAATCCTate，etal．[25]ITSny47-FAACAAGGTTTCCGTAGGTGAMark，etal．[26]AST1TGAGGACGCTTCTCCAGACnadFrpl132-FCCGATTCACCAACTCTTATCTATTTCTArpl132-RCATTGGATGTGAAAGACATGTATTGTTC

1.2.2.2 序列擴(kuò)增、測(cè)序及數(shù)據(jù)處理 每個(gè)居群選取5個(gè)單株用于DNA片段擴(kuò)增和序列測(cè)定。擴(kuò)增反應(yīng)在PerkinElmer GeneAmp PCR System 9600(美國(guó)PerkinElmer公司)上進(jìn)行，試劑購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系總體積為50.0 μL，包含模板DNA 1.0 μL，2×Reaction Mix(含20 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、3 mmol·L-1MgCl2、400 μmol·L-1dNTPs和0.02 g·mL-1溴酚藍(lán))25.0 μL，10 μmol·L-1引物各2.0 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶1.0 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)至50.0 μL。matK、rbcL、psbA-trnH、ITS和nadF片段的擴(kuò)增程序均為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，70 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.8%～1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，溴化乙錠(EB)染色，用Gel Doc圖像分析儀(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)觀察。

上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用Sequencher 4.5軟件進(jìn)行拼接，去除低質(zhì)量的序列；通過(guò)MEGA 5.1對(duì)序列進(jìn)行分析，用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)評(píng)估南蒼術(shù)各居群間的親緣關(guān)系。

1.2.3 SRAP分析方法

表3 用于江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)特異性條帶篩選的SRAP引物

Table 3 SRAP primers used for screening specific bands ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC. from Maoshan population in Jurong of Jiangsu

引物Primer引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)引物Primer引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)SRAP-F1TGAGTCCAAACCGGATASRAP-R5GACTGCGTACGAATTAACSRAP-F2TGAGTCCAAACCGGAGCSRAP-R6GACTGCGTACGAATTGCASRAP-F3TGAGTCCAAACCGGAATSRAP-R7GACTGCGTACGAATTCCASRAP-F4TGAGTCCAAACCGGACCSRAP-R8GACTGCGTACCAATTCGAGSRAP-F5TGAGTCCAAACCGGAAGSRAP-R9GACTGCGTACCAATTCGCCSRAP-F6TGAGTCCAAACCGGACGSRAP-R10GACTGCGTACCAATTCTCCSRAP-F7TGAGTCCAAACCGGACTSRAP-R11GACTGCGTACGAATTTCGSRAP-F8TGAGTCCAAACCGGAGGSRAP-R12GACTGCGTACGAATTGGTSRAP-R1GACTGCGTACGAATTAATSRAP-R13GGCTTGAACGAGTGACTGASRAP-R2GACTGCGTACGAATTTGCSRAP-R14GACTGCGTACGAATTCAASRAP-R3GACTGCGTACGAATTGACSRAP-R15GACTGCGTACGAATTCTGSRAP-R4GACTGCGTACGAATTTGASRAP-R16GACTGCGTACGAATTGTC

1.2.3.1 SRAP引物篩選 參照文獻(xiàn)[27-28]，用于茅山地區(qū)南蒼術(shù)特異性條帶篩選的SRAP引物(表3)由上海華大基因科技有限公司合成，其中正向引物8條，反向引物16條，兩兩組合共有128種組合方式。分別取每居群所有單株的20.0 μL總DNA混勻，作為SRAP引物篩選的模板。在Biometra TAdvanced型PCR儀(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包含DNA模板1.0 μL，2×Reaction Mix(含20 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、3 mmol·L-1MgCl2、400 μmol·L-1dNTPs和0.02 g·mL-1溴酚藍(lán))10.0 μL，10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.7 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL，用雙蒸水補(bǔ)齊至20.0 μL。SRAP分子標(biāo)記的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，電壓60 V，電泳1.5 h后凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，用2 000 bp DNA Ladder作為分子質(zhì)量標(biāo)記。

1.2.3.2 SRAP-SCAR特異性條帶的克隆及測(cè)序選擇江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)擴(kuò)增出的特異性條帶，對(duì)特異性條帶進(jìn)行切膠回收。將回收的目的DNA片段連接到pMD19-T載體〔寶生物工程(大連)有限公司〕，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞〔寶生物工程(大連)有限公司〕。在含有氨芐的細(xì)菌培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，將含有目的條帶的克隆交由上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)DNA序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 SRAP-SCAR標(biāo)記的驗(yàn)證 用合成的SCAR引物對(duì)南蒼術(shù)的9個(gè)居群100個(gè)單株進(jìn)行驗(yàn)證。在Biometra TAdvanced型PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包含DNA模板1.0 μL，2×Reaction Mix(含20 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、3 mmol·L-1MgCl2、400 μmol·L-1dNTPs和0.02 g·mL-1溴酚藍(lán))10.0 μL，10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.7 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.4 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)齊至20.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，電壓100 V，電泳0.5 h后凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，采用2 000 bp DNA Ladder作為分子質(zhì)量標(biāo)記。

2 結(jié)果和分析

2.1 5個(gè)DNA片段的分析結(jié)果

2.1.1 5個(gè)DNA片段的特征分析 南蒼術(shù)9個(gè)居群rbcL、matK、psbA-trnH、ITS和nadF片段的變異位點(diǎn)見(jiàn)表4。

由表4可以看出：南蒼術(shù)9個(gè)居群rbcL片段的變異位點(diǎn)較少，安徽2個(gè)居群南蒼術(shù)具有獨(dú)特的序列變異位點(diǎn)，在第617位點(diǎn)處安徽2個(gè)居群為T，而其余7個(gè)居群均為G。psbA-trnH片段在南蒼術(shù)居群間及居群內(nèi)雖然有變異位點(diǎn)，但只是個(gè)別單株的變異，無(wú)法代表所在地區(qū)的南蒼術(shù)。ITS片段的變異位點(diǎn)最多，但具有區(qū)分度的位點(diǎn)僅有1個(gè)，在第66位點(diǎn)處河南2個(gè)居群為A，而其余7個(gè)居群均為G，能將河南2個(gè)居群南蒼術(shù)鑒別出來(lái)；江蘇3個(gè)居群、安徽2個(gè)居群及湖北紅安七里坪居群在第9、第42、第55、第87、第115、第160、第197、第217、第403、第510和第597位點(diǎn)處分別為G、C、G、C、A、A、G、T、A、A、G，河南2個(gè)居群為A、T、A、T、G、C、C、C、T、T、A，可以將上述居群區(qū)分開(kāi)。但是，matK、rbcL、psbA-trnH和ITS 4個(gè)片段均不能將江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)與其余居群南蒼術(shù)區(qū)分開(kāi)。

由表4還可以看出：江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)在nadF片段的第581位點(diǎn)處為T，其余8個(gè)居群為A，可以將江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)與其余8個(gè)居群的南蒼術(shù)區(qū)分開(kāi)。另外，在nadF片段的第76和第343位點(diǎn)處，江蘇3個(gè)居群為A，其余8個(gè)居群為T。在nadF片段的第161位點(diǎn)處，江蘇3個(gè)居群和安徽金寨天堂寨居群為C，安徽金寨燕子河居群、河南2個(gè)居群和湖北2個(gè)居群為T。

表4 南蒼術(shù)9個(gè)居群5個(gè)DNA片段變異位點(diǎn)的比較1)

Table 4 Comparison on variable sites in five DNA fragments from nine populations ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC.1)

編號(hào)2)No．2)rbcLmatKpsbA-trnH617783445416056466737168341052113383858688199257258259260261262284285286287288312313350371372AL1-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL1-2GGGCAAGGTAGAAAAT———————————AGT——AL1-3GGGCAAGGTAGAAAAT——————CAATTATGT—AL1-4GGGCAAGGTAGTTTTT———————————AGT——AL1-5GGGCAAGGTAGAAAAT———————————MTTT—AL2-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL2-2GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL2-3GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL2-4GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL2-5GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL3-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL3-2GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL3-3GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL3-4GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL3-5GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL4-1TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL4-2TGGCGACGTAAAAAAT———————————ATTT—AL4-3TGGCAAGATAAAAAAT———————————ATTT—AL4-4TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL4-5TGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL5-1TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL5-2TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL5-3TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL5-4TGGCAAGGTAAAAAAT———————————ATTT—AL5-5TGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL6-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL6-2GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL6-3GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL6-4GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL6-5GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL7-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL7-2GGGCAAGGTAGAAAATATATGA—————ATTTTAL7-3GGGCAAGGTAGAAAAC———————————ATTT—AL7-4GGGCAAGGTAGAAAATATATGA—————ATTTTAL7-5GGGCAAGGTAGAAAAC———————————ATTT—AL8-1GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL8-2GGGCAGGGTAGAAAAT———————————AATT—AL8-3GGGGAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL8-4GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATT——AL8-5GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL9-1GTACAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL9-2GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL9-3GGGCAAGGTGGAAAAT———————————ATTT—AL9-4GGGCAAGGTAGAAAAT———————————ATTT—AL9-5GGGCAAGGGAGAAAAT———————————ATTT—

續(xù)表4 Table 4 (Continued)

編號(hào)2)No．2)ITSnadF942556683871061151601941972174034644675105977576154161343395411468473581628704705AL1-1GCGGCCCAAGGTACTAGTACCATTACTTTTAL1-2GCGGCCCAAGGTACTAGTACCATTACTTTTAL1-3GCGGYCCAAGGTAYTAGTACCAAT—CTTT—AL1-4GCGGCCCAAGGTAYTAGTACCAAT—CTAT—AL1-5GCGGYCCAAGGTACTAGTACCAAT—CTAT—AL2-1GCGGCCCAAGGTACTAGTACCATT—CAAT—AL2-2GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAATACAATTAL2-3GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAATACAATTAL2-4GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAATACAATTAL2-5GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAAT—CAAT—AL3-1GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAAT—TAAT—AL3-2GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAATATAAT—AL3-3GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAATACATT—AL3-4GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAAT—CAATTAL3-5GCGGCCCAAGGTACTAGTACCAAT—CATTTAL4-1GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—AL4-2GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—AL4-3GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—AL4-4GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CAT——AL4-5GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—AL5-1GCGGCCCAAGGTACTAGTTCCTAT—CATT—AL5-2GCGGCCCAAGGTACTAGTTCCTAT—CAT——AL5-3GCGGCCCAAGGTACTAGTTCCTAT—CATT—AL5-4GCGGCCCAAGGTACTAGTTCCTAT—CATT—AL5-5GCGGCCCAAGGTACTAGTTCCTAT—CATT—AL6-1ATAACTCGCGCCTCCTATTGTTAT—CAT——AL6-2ATAACTCGCTCCTCTTATTCTTAT—CATTTAL6-3ATAACTCGCGCCTCCTATTCTTAT—CAT——AL6-4ATAACTCGCGCCTCCTAGTCTTAT—CATT—AL6-5ATAACTCGCGCCTCCTAGTCTTAT—CATT—AL7-1ATAACTCGCGCCTCCTAGTCTTAT—CAT——AL7-2ATAACTCGCGCCTCCTATTGTTAT—CATT—AL7-3ATAACTCGCGCCTCCTATTCTTAT—CATTTAL7-4ATAACTCGCGCCTCCTATTCTTAT—CAT——AL7-5ATAACTCGCGCCTCCTATTCTTAG—CAT——AL8-1GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—AL8-2RYRGCYCRMGSYWCYWRTTCTTAT—CATT—AL8-3RYRGCYCRMGSYWCYWRTTCTTAT—CAT——AL8-4RYRGCYCRMGSYWCYWRTTCTTAT—CAA——AL8-5ATAGCTCGCGCCTCCTATTCTTAT—CAA——AL9-1GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CAAT—AL9-2GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CAAT—AL9-3GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CAT——AL9-4GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CAT——AL9-5GCGGCCCAAGGTACTAGTTCTTAT—CATT—

1)rbcL：rbcL片段變異位點(diǎn)的堿基Bases at variable sites inrbcLfragment；matK：matK片段變異位點(diǎn)的堿基Bases at variable sites inmatKfragment；psbA-trnH：psbA-trnH片段變異位點(diǎn)的堿基Bases at variable sites inpsbA-trnHfragment； ITS： ITS片段變異位點(diǎn)的堿基Bases at variable sites in ITS fragment；nadF：nadF片段變異位點(diǎn)的堿基Bases at variable sites innadFfragment. —： 堿基缺失Base missing.

2)AL1-1，AL1-2，AL1-3，AL1-4，AL1-5： 江蘇句容茅山居群5個(gè)單株Five individuals from Maoshan population in Jurong of Jiangsu； AL2-1，AL2-2，AL2-3，AL2-4，AL2-5： 江蘇句容射烏山居群5個(gè)單株Five individuals from Shewushan population in Jurong of Jiangsu； AL3-1，AL3-2，AL3-3，AL3-4，AL3-5： 江蘇句容小九華山居群5個(gè)單株Five individuals from Xiaojiuhuashan population in Jurong of Jiangsu； AL4-1，AL4-2，AL4-3，AL4-4，AL4-5： 安徽金寨燕子河居群5個(gè)單株Five individuals from Yanzihe population in Jinzhai of Anhui； AL5-1，AL5-2，AL5-3，AL5-4，AL5-5： 安徽金寨天堂寨居群5個(gè)單株Five individuals from Tiantangzhai population in Jinzhai of Anhui； AL6-1，AL6-2，AL6-3，AL6-4，AL6-5： 河南嵩縣五馬寺居群5個(gè)單株Five individuals from Wumasi population in Songxian of He’nan； AL7-1，AL7-2，AL7-3，AL7-4，AL7-5： 河南嵩縣紙坊居群5個(gè)單株Five individuals from Zhifang population in Songxian of He’nan； AL8-1，AL8-2，AL8-3，AL8-4，AL8-5： 湖北?？岛笃壕尤?個(gè)單株Five individuals from Houping population in Baokang of Hubei； AL9-1，AL9-2，AL9-3，AL9-4，AL9-5： 湖北紅安七里坪居群5個(gè)單株Five individuals from Qiliping population in Hongan of Hubei.

南蒼術(shù)9個(gè)居群rbcL、matK、psbA-trnH、ITS和nadF5個(gè)DNA片段的分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出：這5個(gè)片段的可匹配序列長(zhǎng)度分別為643、1 312、455、686和1 169 bp。當(dāng)空缺(gap)始終作缺失(missing)處理時(shí)，rbcL片段有642個(gè)保守位點(diǎn)，保守性最高；psbA-trnH片段有434個(gè)保守位點(diǎn)，保守性最低；psbA-trnH片段的變異位點(diǎn)最多，有21個(gè)，變異性最大；ITS片段的信息位點(diǎn)最多，有13個(gè)。

表5 南蒼術(shù)9個(gè)居群5個(gè)DNA片段信息1)

Table 5 Information of five DNA fragments from nine populations ofAtractylodeslancea(Thunb.) DC.1)

片段FragmentASL/bpNCSNVSNPISrbcL64364211matK13121302101psbA-trnH455434210ITS6866691713nadF1169116094

1)ASL： 可匹配序列長(zhǎng)度Alignment sequence length； NCS： 保守位點(diǎn)數(shù)Number of conserved sites； NVS： 變異位點(diǎn)數(shù)Number of variable sites； NPIS： 信息位點(diǎn)數(shù)Number of parsim-informative sites.

AL1： 江蘇句容茅山居群Maoshan population in Jurong of Jiangsu； AL2： 江蘇句容射烏山居群Shewushan population in Jurong of Jiangsu； AL3： 江蘇句容小九華山居群Xiaojiuhuashan population in Jurong of Jiangsu； AL4： 安徽金寨燕子河居群Yanzihe population in Jinzhai of Anhui； AL5： 安徽金寨天堂寨居群Tiantangzhai population in Jinzhai of Anhui； AL6： 河南嵩縣五馬寺居群Wumasi population in Songxian of He’nan； AL7： 河南嵩縣紙坊居群Zhifang population in Songxian of He’nan； AL8： 湖北?？岛笃壕尤篐ouping population in Baokang of Hubei； AL9： 湖北紅安七里坪居群Qiliping population in Hongan of Hubei. 分支上數(shù)據(jù)為支持率Datums above the branches are support rate.圖1 基于5個(gè)DNA片段聯(lián)合構(gòu)建的南蒼術(shù)9個(gè)居群的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 NJ phylogenetic tree of nine populations of Atractylodes lancea (Thunb.) DC. based on combining five DNA fragments

2.1.2 基于5個(gè)DNA片段聯(lián)合的南蒼術(shù)居群間聚類分析 基于5個(gè)DNA片段聯(lián)合構(gòu)建的南蒼術(shù)9個(gè)居群間的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)顯示：與江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)親緣關(guān)系較近的是江蘇句容的小九華山居群和射烏山居群，其次分別是安徽2個(gè)居群、湖北2個(gè)居群、河南2個(gè)居群，推測(cè)江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)與其余居群的親緣關(guān)系與南蒼術(shù)分布的地理距離成正相關(guān)。

2.2 SRAP-SCAR分析結(jié)果

2.2.1 與茅山地區(qū)南蒼術(shù)特異性相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記篩選 應(yīng)用128對(duì)SRAP引物分別對(duì)供試南蒼術(shù)9個(gè)居群的總DNA混合樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)指紋圖譜進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示：在引物對(duì)SRAP-F8/R14的PCR擴(kuò)增圖譜中，江蘇句容茅山居群在約300 bp處有1條特有條帶，而其余8個(gè)居群均無(wú)此條帶(圖2)。

M： DNA marker； AL1： 江蘇句容茅山居群Maoshan population in Jurong of Jiangsu； AL2： 江蘇句容射烏山居群Shewushan population in Jurong of Jiangsu； AL3： 江蘇句容小九華山居群Xiaojiuhuashan population in Jurong of Jiangsu； AL4： 安徽金寨燕子河居群Yanzihe population in Jinzhai of Anhui； AL5： 安徽金寨天堂寨居群Tiantangzhai population in Jinzhai of Anhui； AL6： 河南嵩縣五馬寺居群Wumasi population in Songxian of He’nan； AL7： 河南嵩縣紙坊居群Zhifang population in Songxian of He’nan； AL8： 湖北保康后坪居群Houping population in Baokang of Hubei； AL9： 湖北紅安七里坪居群Qiliping population in Hongan of Hubei. 箭頭示江蘇句容茅山居群特有條帶The arrow indicates specific bands of population at Maoshan in Jurong of Jiangsu.圖2 引物對(duì)SRAP-F8R14的南蒼術(shù)9個(gè)居群總DNA的PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 2 PCR amplification pattern of total DNA from nine populations of Atractylodes lancea (Thunb.) DC. by primer pair SRAP-F8R14

2.2.2 茅山地區(qū)南蒼術(shù)特有條帶的序列測(cè)定及與茅山地區(qū)南蒼術(shù)相關(guān)的SCAR引物設(shè)計(jì) 江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)特有條帶所包含的序列是該居群的特有序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的引物僅在江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)單株中擴(kuò)增得到條帶，而在其余8個(gè)居群南蒼術(shù)單株中則無(wú)法得到。

對(duì)引物對(duì)SRAP-F8R14擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果顯示該片段長(zhǎng)度為323 bp，其核苷酸序列見(jiàn)圖3。

下劃線部分為設(shè)計(jì)的SCAR引物The underline parts are the designed SCAR primers.圖3 引物對(duì)SRAP-F8R14在江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)中擴(kuò)增出特有片段的DNA序列Fig. 3 DNA sequence of specific fragment amplified by primer pair SRAP-F8R14 from Atractylodes lancea (Thunb.) DC. from Maoshan population in Jurong of Jiangsu

根據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般原則，設(shè)計(jì)1對(duì)SCAR引物，正向引物序列為5′-ATCTTTGCTATTAACTATTAAGCTATTCTTCGCTATTCA-3′，反向引物序列為5′-CGATGTTGAAATTGCTGTCTCTGCTTTCTATTC-3′，此對(duì)引物擴(kuò)增出的序列長(zhǎng)度為268 bp。

2.2.3 SRAP-SCAR標(biāo)記在南蒼術(shù)各居群?jiǎn)沃曛械尿?yàn)證 用設(shè)計(jì)的SCAR引物對(duì)南蒼術(shù)9個(gè)居群100個(gè)單株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。除江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)的20個(gè)單株在268 bp處擴(kuò)增出條帶外，其余8個(gè)居群的所有單株均未在該處擴(kuò)增出條帶。

AL1： 江蘇句容茅山居群Maoshan population in Jurong of Jiangsu； AL2： 江蘇句容射烏山居群Shewushan population in Jurong of Jiangsu； AL3： 江蘇句容小九華山居群Xiaojiuhuashan population in Jurong of Jiangsu； AL4： 安徽金寨燕子河居群Yanzihe population in Jinzhai of Anhui； AL5： 安徽金寨天堂寨居群Tiantangzhai population in Jinzhai of Anhui； AL6： 河南嵩縣五馬寺居群Wumasi population in Songxian of He’nan； AL7： 河南嵩縣紙坊居群Zhifang population in Songxian of He’nan； AL8： 湖北保康后坪居群Houping population in Baokang of Hubei； AL9： 湖北紅安七里坪居群Qiliping population in Hongan of Hubei.圖4 SRAP-SCAR標(biāo)記在南蒼術(shù)9個(gè)居群?jiǎn)沃曛械尿?yàn)證Fig. 4 Identification of individuals from nine populations of Atractylodes lancea (Thunb.) DC. by SRAP-SCAR marker

3 討 論

3.1 DNA片段鑒別道地產(chǎn)區(qū)藥材的可行性及片段篩選

藥材道地性形成的根本原因是長(zhǎng)期地理隔離導(dǎo)致的與其他區(qū)域居群產(chǎn)生的遺傳差異，實(shí)質(zhì)上是藥材基因組DNA序列出現(xiàn)了變異，因此，不同區(qū)域同一植物反映在DNA片段上的穩(wěn)定差異實(shí)際上是各區(qū)域該植物的特質(zhì)，就此產(chǎn)生了鑒別的依據(jù)。但是，不同DNA片段演化速率的快慢存在差異，作為種下水平的鑒別，必須篩選到演化速率快的片段。盡管不同片段在不同類群植物中演化速率也有差異，但總體上看，rbcL和matK片段的演化速率較慢，往往適用于種或者種以上水平的鑒別，適用于種下水平的往往序列較小，鑒定效果不佳；相對(duì)而言，ITS和psbA-trnH等片段更適合遺傳差異小的種下水平的鑒定，但是也并非一定有效[29-31]。

鄭麗[32]利用rbcL、matK、psbA-trnH和ITS共4個(gè)DNA片段作為標(biāo)記，對(duì)蒼術(shù)屬5種植物進(jìn)行了分子鑒別，認(rèn)為僅ITS片段能將該屬供試的5個(gè)種區(qū)分開(kāi)，而其他3個(gè)片段則不行，說(shuō)明該屬遺傳差異較小、序列較保守，常規(guī)片段很有可能無(wú)法進(jìn)行種下水平的區(qū)分，還需要尋找更具鑒別度的快速演化片段。本研究選用的5個(gè)片段中，matK和rbcL片段的變異位點(diǎn)較少，rbcL片段僅第617位點(diǎn)能鑒別安徽2個(gè)居群南蒼術(shù)，但安徽2個(gè)居群間則無(wú)法區(qū)分。雖然psbA-trnH片段的變異位點(diǎn)較多，如河南嵩縣五馬寺居群和江蘇句容茅山居群均有少數(shù)單株存在小片段插入，但只是居群內(nèi)個(gè)別單株間的變異，無(wú)法代表所在地區(qū)的南蒼術(shù)。ITS片段的變異位點(diǎn)最多，但具有區(qū)分度的僅有1個(gè)，能將河南2個(gè)居群南蒼術(shù)鑒別出來(lái)，但河南2個(gè)居群間也無(wú)法區(qū)分。nadF片段的變異位點(diǎn)較多，鑒別效果最佳，不僅能將道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容茅山居群的南蒼術(shù)區(qū)分開(kāi)，而且還可以將江蘇句容的射烏山居群和小九華山居群與其他居群分開(kāi)，但不能區(qū)分射烏山居群和小九華山居群。nadF片段由本研究自行篩選得到，位于葉綠體基因組的基因間區(qū)，變異率較高，適合進(jìn)行種下水平的區(qū)分。此前的分子鑒別、遺傳演化等研究中極少使用nadF片段，該片段為單拷貝片段，長(zhǎng)度穩(wěn)定(1 000 bp左右)，兩端序列保守(分別為蛋白編碼基因nadF和rpl32)[33]，引物設(shè)計(jì)容易，有望被開(kāi)發(fā)為進(jìn)行種下研究的熱點(diǎn)片段。nadF片段在江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)的鑒定效率達(dá)到100%。

3.2 茅山地區(qū)南蒼術(shù)鑒別的SCAR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)意義

利用隨機(jī)引物的指紋圖譜進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的特異性分子標(biāo)記是專一性、特異性的分子標(biāo)記，不僅穩(wěn)定，而且操作十分簡(jiǎn)單，已經(jīng)成為檢驗(yàn)藥材道地性的重要手段。與DNA序列的差異相比，由隨機(jī)引物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的SCAR分子標(biāo)記更適用于遺傳背景相近的對(duì)象的鑒定。由于隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)生的多態(tài)性條帶能給予更大的篩選范圍，更容易發(fā)現(xiàn)基因組的差異，因此，種下水平的分子標(biāo)記篩選常用隨機(jī)引物的多態(tài)性條帶來(lái)開(kāi)發(fā)，甚至在同一居群不同個(gè)體間也能用隨機(jī)引物來(lái)發(fā)現(xiàn)差異，進(jìn)而開(kāi)發(fā)成SCAR分子標(biāo)記。如韋陽(yáng)連等[34]采用RAPD引物找到了茅山南蒼術(shù)不同個(gè)體間與蒼術(shù)素含量相關(guān)的分子標(biāo)記。

本研究開(kāi)發(fā)的江蘇句容茅山居群南蒼術(shù)SRAP-SCAR標(biāo)記源自不同居群南蒼術(shù)通過(guò)SRAP隨機(jī)引物擴(kuò)增后的指紋圖譜的比較篩選，但這種標(biāo)記不用進(jìn)行序列比對(duì)分析，僅用PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)便可以達(dá)到鑒別的目的，操作更加簡(jiǎn)便，判斷也更加直觀，對(duì)操作者的專業(yè)知識(shí)要求更低，因此，在應(yīng)用推廣上更具優(yōu)勢(shì)。

總體而言，本研究基于nadF片段的序列差異和SRAP的指紋圖譜開(kāi)發(fā)的茅山地區(qū)南蒼術(shù)特有的分子標(biāo)記均可以有效地將茅山地區(qū)南蒼術(shù)與其余居群南蒼術(shù)區(qū)分開(kāi)。茅山地區(qū)南蒼術(shù)作為南蒼術(shù)的道地藥材，其專一性、特異性鑒別的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)其他道地藥材的保護(hù)性鑒別也提供了理論和科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

Study on specific molecular marker ofAtractylodeslanceain Maoshan area

WANG Mingqiang1，①， TANG Shijie1，①， FANG Yan2， XUE Jiayu1，②

(1. Center for Plant Diversity and System Evolution， Institute of Botany， Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences， Nanjing 210014， China； 2. Nanjing Forest Police College， Nanjing 210023， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(2)： 17-26

The study focuses on nine populations from all distribution areas of wildAtractylodeslancea(Thunb.) DC. in China， including Maoshan population， Shewushan population and Xiaojiuhuashan population in Jurong of Jiangsu， Yanzihe population and Tiantangzhai population in Jinzhai of Anhui， Wumasi population and Zhifang population in Songxian of He’nan， and Houping population in Baokang and Qiliping population in Hongan of Hubei. Taking these nine populations as objects， specific molecular marker ofA.lanceafrom Maoshan population in Jurong of Jiangsu is screened by using sequence alignment of fragments ofrbcL，matK，psbA-trnH， ITS andnadFand comparison on SRAP fingerprints. The results show that through sequence alignment of five DNA fragments， the base at the 581th locus innadFfragment ofA.lanceafrom Maoshan population in Jurong of Jiangsu is A， and that from other eight populations is T， which can distinguish Maoshan population in Jurong of Jiangsu from other eight populations. A specific band with length of 323 bp inA.lanceafrom Maoshan population in Jurong of Jiangsu is screened by SRAP random primers， and a pair of SCAR primers is designed according to the sequence of this band.The forward primer sequence is 5′-ATCTTTGCTATTAACTATTAAGCTATTCTTCGCTATTCA-3′，and the reverse primer sequence is 5′-CGATGTTGAAATTGCTGTCTCTGCTTTCTATTC-3′， which can amplify specific band with length of 268 bp from all individuals ofA.lanceafrom Maoshan population in Jurong of Jiangsu， and cannot amplify any band from other populations. The two specific markers screened in this study can provide reliable technical support for identifying the genuineness ofA.lancea.

Atractylodeslancea(Thunb.) DC.； genuineness； Maoshan area；nadFfragment； SRAP-SCAR

2016-12-08

江蘇省林業(yè)三新工程項(xiàng)目(LYSX[2015]22)

王明強(qiáng)(1992—)，男，安徽阜陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事植物系統(tǒng)與演化方面的研究。 湯詩(shī)杰(1969—)，男，安徽東至人，博士，副研究員，主要從事園林植物與植物多樣性保護(hù)方面的研究。

Q946-33； S567.21+1

A

1674-7895(2017)02-0017-10

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.02.03

①共同第一作者

②通信作者E-mail： xuejy@cnbg.net