還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的制備與表征研究

陳云輝馮珺蔡鑫君周中元

還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的制備與表征研究

陳云輝1馮珺2蔡鑫君2周中元2

還原型谷胱甘肽；脂質(zhì)體；制備；表征

還原型谷胱甘肽（GSH）是一種參與體內(nèi)多種重要的生化代謝反應(yīng)的化合物，是維持體內(nèi)正常的氧化還原環(huán)境的關(guān)鍵因素。臨床上常用于藥物中毒、肝功能異常等[1-3]。但GSH屬于多肽類藥物，存在透過細(xì)胞膜能力差、易氧化、穩(wěn)定性差等問題，給臨床應(yīng)用造成了一定的影響。脂質(zhì)體作為一種由脂質(zhì)雙分子層包裹形成的微型泡囊體，因其磷脂雙分子層與細(xì)胞膜的親和力高，更容易將藥物輸送到細(xì)胞內(nèi)，同時可以避免藥物被分解破壞，并能使藥物緩慢釋放，有利于減少給藥次數(shù)，提高生物利用度[4]。因此為了解決GSH存在的問題，更好地發(fā)揮GSH藥效，并使其具緩釋長效功能，本課題組制備GSH脂質(zhì)體，并對其進行表征研究，從而為研究穩(wěn)定長效的GSH制劑提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Nano-ZS型粒徑分析儀（英國馬爾文公司）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；R202旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海志威電器有限公司）；循環(huán)水真空泵（河南省予華儀器有限公司）；pH（酸度）計（上海天達儀器有限公司）；水浴恒溫震蕩器（常州溪華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑還原型谷胱甘肽對照品（中國藥檢所，批號130412）；還原型谷胱甘肽原料藥（上海寶曼生物科技有限公司，批號20150612）；庚烷磺酸鈉（山東禹王實業(yè)有限公司，批號2013110801）；大豆卵磷脂（德國Lipoid公司，批號X0515）；膽固醇（Sigma公司，批號）；甲醇、磷酸、氯仿、檸檬酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（以上皆為分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 還原型谷胱甘肽含量測定方法

2.1.1 色譜條件色譜柱為Hypersil BDS C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鈉6.80g，庚烷磺酸鈉2.20g，加水溶解使成1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）-甲醇（96:4）；流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為210nm；進樣量為20μL。在此色譜條件下，空白脂質(zhì)體和還原型谷胱甘肽對照品及含藥樣品色譜圖見圖1（封三）。

2.1.2 對照品的制備精密稱取還原型谷胱甘肽對照品7.5mg，置于25mL容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.3mg/mL還原型谷胱甘肽對照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立還原型谷胱甘肽對照品溶液配成系列濃度，按“2.1.1”項進樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)進樣濃度為橫坐標(biāo)做回歸方程，回歸方程為：Y=10770X+82.210（r=0.999），分析表明還原型谷胱甘肽在0.06～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗與重復(fù)性試驗精密吸取還原型谷胱甘肽對照品溶液20μL，按“2.1.1”項下方法重復(fù)進樣6次，發(fā)現(xiàn)其RSD=1.02%（n=6），表明本方法精密度良好。平行配制6份上述對照品溶液，按“2.1.1”項方法測定，結(jié)果為RSD=0.82%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗取同一還原型谷胱甘肽對照品溶液，在不避光條件下分別放置0、0.5、1、1.5、2、3、4h，按“2.1.1”項下方法進行測定，結(jié)果為RSD=0.19%（n=7），表明對照品溶液4h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2 還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的制備分別稱取膽固醇和卵磷脂置于燒杯中，加入氯仿溶解，磁力攪拌均勻后將類脂溶液置于圓底燒瓶中，在37℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，待類脂物在瓶壁上形成一層薄膜后，加入0.3mol/L檸檬酸10mL，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水合30min，得空白脂質(zhì)體。將還原型谷胱甘肽溶液加入空白脂質(zhì)體中，調(diào)節(jié)pH為到8.0，將還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體在冰水浴中短時超聲5min，即得。

2.3 還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的表征研究

2.3.1 包封率的測定采用超速離心法測定還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的包封率。取還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體溶液適量，15000r/min離心15min。HPLC測定上清液中的還原型谷胱甘肽含量，標(biāo)為W1；再取等量的還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體溶液，加入甲醇超聲破壞脂質(zhì)體，以HPLC測定還原型谷胱甘肽的總量，標(biāo)為W0；計算包封率為EE=（W0-W1）/W0×100%，其中，EE：包封率；W0：還原型谷胱甘肽投藥量；W1：未包裹進脂質(zhì)體中的藥物量。

為了驗證上述制備處方工藝的穩(wěn)定性，根據(jù)確定工藝制備還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體，實驗重復(fù)3次，所得還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的平均包封率為82.31%，RSD為3.45%，表明該工藝穩(wěn)定可靠。見表1。

表1 還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的包封率檢測結(jié)果

2.3.2 平均粒徑的測定取適量脂質(zhì)體用激光粒度測定儀測定平均粒徑，顯示平均粒徑為109.8nm，見圖2（封三）。

2.3.3 外觀形態(tài)取少量脂質(zhì)體溶液滴于銅網(wǎng)上，靜置10min后用濾紙片吸干，再滴加2.0%磷鎢酸溶液對其進行染色，待自然揮干后，在透射電鏡鏡下觀察脂質(zhì)體外觀形態(tài)。結(jié)果見圖3（封三），脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)完整，外觀呈球形，分布均勻。

2.3.4 體外釋放測試采用透析袋法對還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體的體外釋藥特性進行研究。精密量取相同的還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體3份，置于經(jīng)蒸餾水浸泡處理過的透析袋內(nèi)，將袋口扎緊。將含藥透析袋置于（pH7.4）緩沖液，于37℃恒溫水浴振蕩（100r/min），分別于0.1、1、2、3、4、5、6、8、12、18、36h取樣，取樣后補加等量同溫釋放介質(zhì)，樣品用0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液測定還原型谷胱甘肽含量，計算累積釋放百分率（Qn）。見圖4（封三）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體溶液在18h時已基本釋放完全。

為探討釋放機理，將釋藥曲線分別用零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程、Weibull方程對釋藥數(shù)據(jù)進行擬合，見表2。結(jié)果表明，還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體溶液的體外釋放曲線符合Weibull方程模型，為lnln（1/1-Q）=0.3817lnt-0.3227，r=0.9922，其中Q為累積釋放百分率，t為取樣時間。

3 討論

目前，薄膜分散法、反相蒸發(fā)法、注入法和復(fù)乳法等是常用的脂質(zhì)體制備方法[5-6]，本文選擇的pH梯度法屬于“主動載藥”技術(shù)，與傳統(tǒng)的“被動載藥”技術(shù)相比，可以更顯著地提高脂質(zhì)

表2 還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體體外釋藥曲線擬合結(jié)果

體的包封率和穩(wěn)定性。通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)外的pH梯度，使得更多的脂質(zhì)體外水相中藥物進入脂質(zhì)體內(nèi)部，可以明顯提高藥物的包封率，特別適合水溶性藥物的包裹。

通過還原型谷胱甘肽對脂質(zhì)體的體外釋放度研究可以為體內(nèi)藥動學(xué)過程提供一定的參考，本研究制備的還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體體外釋放度實驗結(jié)果表明，還原型谷胱甘肽可以有效地緩釋18h，明顯優(yōu)于原藥，可以預(yù)測還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體可增加還原型谷胱甘肽在體內(nèi)循環(huán)時間，并能減少藥物降解，從而提高藥物療效。這一研究結(jié)果將為還原型谷胱甘肽脂質(zhì)體體內(nèi)藥動藥效提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［1］王祖君，李小丹.還原型谷胱甘肽聯(lián)合丹參注射液治療酒精性肝病臨床觀察［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（12）：1304-1306.

［2］雷澈.還原型谷胱甘肽注射液治療小兒肺炎合并肝功能損害的療效觀察［J］.臨床合理用藥，2016，9（6）：52-53.

［3］夏毅如，陳振華.聯(lián)合應(yīng)用還原型谷胱甘肽和促肝細(xì)胞生長素治療嬰兒肝炎綜合征療效研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2016，10（9）：175-176.

［4］楊文秀.脂質(zhì)體主動載藥的研究與應(yīng)用進展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（17）：2647-2648.

［5］沈丹，張蕊，薛婧等.柔性脂質(zhì)體研究進展［J］.中國醫(yī)師雜志，2014，16（3）：425-427.

［6］盛竹君，徐維平，徐婷娟，等.脂質(zhì)體藥物傳輸系統(tǒng)的研究新進展［J］.中國藥業(yè)，2015，24（23）：6-9.

（收稿：2016-12-29修回：2017-01-20）

book=716,ebook=84

浙江省藥學(xué)會醫(yī)院藥學(xué)專項百特醫(yī)院藥學(xué)專項科研（No. 2013ZYY38）

1杭州市江干區(qū)人民醫(yī)院藥劑科（杭州310021）；2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科（杭州310003）

馮珺，Tel：057156109723；E-mail：492933372@qq.com