運(yùn)動(dòng)對(duì)非酒精性脂肪肝形成中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a、IRE1/XBP1通路的影響

李軍漢 李恩 張仲陽(yáng) 蘇全生

摘 要：觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路在非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的變化，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）的預(yù)防作用及作用機(jī)理。方法：SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和運(yùn)動(dòng)組3 組，每組10只。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)組在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)予運(yùn)動(dòng)干預(yù)，連續(xù)8周，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。油紅O染色觀察肝臟病理形態(tài)變化，western blot檢測(cè)PERK、 eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達(dá)。結(jié)果：1）與對(duì)照組比較，模型組油紅O脂滴數(shù)量增加，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達(dá)增加；2）與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組油紅O脂滴數(shù)量減少，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達(dá)降低。結(jié)論：8周高脂飲食可成功復(fù)制NAFLD動(dòng)物模型，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路參與NAFLD的形成。運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD形成具有較好的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)可降低PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；非酒精性脂肪肝；運(yùn)動(dòng)

中圖分類號(hào)： G 804.2 文章編號(hào)：1009783X（2016）05045904 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)病理過(guò)程[1]。近年來(lái)，NAFLD 發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人民健康，但其發(fā)生機(jī)制仍不清楚[2]。研究[34]報(bào)道，ERS在心血管、神經(jīng)元變性和糖尿病等疾病中起著重要作用。有關(guān)ERS相關(guān)蛋白在NAFLD中的作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外僅有少量文獻(xiàn)[56]報(bào)道。迄今為止，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑在NAFLD中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠NAFLD動(dòng)物模型，并采用運(yùn)動(dòng)干預(yù)，探討NAFLD形成中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機(jī)制及運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD的干預(yù)作用和作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SD雄性大鼠30只，SPF/VAF 級(jí)，體重為（195.36±5.87）g，分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h光照和12 h熄燈模擬晝夜交替。

1.2 分組與喂養(yǎng)

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和運(yùn)動(dòng)組，每組10只。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予高脂飼料喂養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)組在高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)予運(yùn)動(dòng)干預(yù)，連續(xù)8周，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。高脂飼料配方[7]如下：基礎(chǔ)飼料71.8%，豬油18%，膽固醇2.0%，膽鹽0.2%，蛋黃粉8%。

1.3 運(yùn)動(dòng)方法

運(yùn)動(dòng)方式參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道，實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行3 d適應(yīng)性游泳練習(xí)，每天1次，每次15 min，每天遞增10～20 min，經(jīng)1周增加至60 min，以后各周都維持此運(yùn)動(dòng)量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。訓(xùn)練時(shí)驅(qū)趕不游泳大鼠，以防漂浮水面。正式運(yùn)動(dòng)期間每周運(yùn)動(dòng)6 d，每天1次，每次60 min。運(yùn)動(dòng)條件：長(zhǎng)150 cm×寬60 cm×高70 cm的游泳池，水溫（31±1）℃，水深60 cm，超過(guò)大鼠身長(zhǎng)的2倍。

1.4 樣本采集與處理

大鼠處死前先禁食12 h，稱重后以2%戊巴比妥鈉溶液4 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，新潔爾滅消毒皮膚，以腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟，置于4 ℃生理鹽水中反復(fù)漂洗，在肝左葉中部切取1 cm×1 cm×1 cm，放置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱儲(chǔ)存，用于Western bolt檢測(cè)。取肝右葉一部分固定包埋，用于冰凍切片和油紅O染色。

1.5 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.5.1 油紅O染色觀察肝臟病理形態(tài)

油紅O染色方法：肝臟冰凍切片（5 μm厚度）用于脂質(zhì)染色。脂滴為紅色，每張切片在200倍光鏡顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，采用ImagePro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算每個(gè)視野下紅色脂滴光密度，每張切片5個(gè)視野下紅色脂滴光密度相加后取平均值，用每組平均光密度表示紅色脂滴的多少，單位以AIOD.μm2表示。

1.5.2 western blot法測(cè)PERK/ eIF2a和IRE1/XBP1途徑蛋白表達(dá)

將50 mg的冰凍肝組織置于勻漿器中，用剪刀盡量將組織塊剪碎，加入500 mL組織裂解液，反復(fù)研磨使組織盡量碾碎，30 min的裂解后，以2 000 r/min，4 ℃離心組織勻漿10 min，取上清液，再以12 000 r/min，4 ℃ 離心30 min，回收上清液，取小部分上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白樣品（50 μg）經(jīng)12.5%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5 %脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔單抗PERK（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗eIF2a（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗IRE1（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗XBP1（1∶1 000，abcam公司）和兔單抗βactin（1∶1 000，abcam公司）室溫孵育1 h后，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入相應(yīng)的HRP結(jié)合的羊抗兔IgG（1∶2 000，abcam公司）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光液，1 min后于暗室內(nèi)進(jìn)行膠片曝光、顯影、定影、晾干。βactin作為內(nèi)參，并用Gelpro32圖像分析軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)量用光密度比值（OD ratio）表示，蛋白表達(dá)量用“目的蛋白/βactin”計(jì)算。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA）對(duì)多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較，M組、EM組、FM組和EFM組4組比較采用雙因素方差分析（Univariate），P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 各組肝組織病理形態(tài)變化

油紅O染色結(jié)果（如圖1和表1）所示：對(duì)照組肝細(xì)胞未見明顯脂滴；模型組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)橘紅色脂滴數(shù)量增多，大小不一，以小泡性脂肪滴為主；運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見少量橘紅色脂滴，脂滴數(shù)量在對(duì)照組和模型組之間。

2.2 各組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a途徑蛋白表達(dá)變化

各組大鼠肝組織PERK、eIF2a蛋白表達(dá)（如圖2和表2）結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組和運(yùn)動(dòng)PERK、eIF2a蛋白表達(dá)升高，其中模型組具有非常顯著性差異（P<0.01），運(yùn)動(dòng)組PERK蛋白表達(dá)具有非常顯著性差異（P<0.01），eIF2a蛋白表達(dá)差異不具有顯著性；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組PERK、eIF2a蛋白表達(dá)降低，差異具有非常顯著性（P<0.01）。

2.3 各組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1/XBP1途徑蛋白表達(dá)變化

各組大鼠肝組織IRE1、XBP1蛋白表達(dá)（如圖2和表3）結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組和運(yùn)動(dòng)組IRE1、XBP1蛋白表達(dá)升高，差異具有非常顯著性（P<0.01）；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組IRE1、XBP1蛋白表達(dá)降低，差異具有非常顯著性（P<0.01）。

3 討論與分析

3.1 動(dòng)物模型的建立

為深入研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制，建立與人類病變相似的動(dòng)物模型極為重要。在現(xiàn)有的NAFLD動(dòng)物模型中，主要有先天性“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”“化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)”、病毒誘導(dǎo)及高脂飼料誘導(dǎo)等[9]。高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD動(dòng)物模型，其病變過(guò)程較慢，方法簡(jiǎn)單、病理特征與人類相似、成功率高而被廣泛應(yīng)用，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者最常采用的造模方法[10]。

診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)是病理組織學(xué)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)8周高脂飲食建立大鼠NAFLD模型，油紅O染色可見模型組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴數(shù)量增多，大小不一。與對(duì)照組比較，模型組油紅O脂滴光密度值顯著升高（P<0.05），提示本研究NAFLD動(dòng)物模型復(fù)制成功。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑在NAFLD形成中的變化

PERK是介導(dǎo)ERS反應(yīng)的重要分子，正常狀態(tài)下，PERK與GRP78結(jié)合成無(wú)活性的復(fù)合物；ERS時(shí)，PERK與GRP78解離，解離出的PERK寡聚化并激活，使eIF2a磷酸化，mRNA和蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯水平下調(diào)，ER蛋白負(fù)荷減輕[11]。林志楠等[12]報(bào)道，pPERK蛋白在胰島素抵抗大鼠肝組織中表達(dá)升高。本研究結(jié)果顯示，PERK和eIF2α在生理狀態(tài)下也少量表達(dá)，而在模型組大鼠肝組織中PERK和eIF2α表達(dá)明顯升高，提示ERS通過(guò)介導(dǎo)PERK/eIF2α通路參與高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的形成。

正常狀態(tài)下，IRE1與GRP78結(jié)合成無(wú)活性的復(fù)合物，ERS時(shí)，IRE1與GRP78解離，解離出的IRE1通過(guò)非常規(guī)剪接XBP1 mRNA激活XBP1。XBP1能促進(jìn)陪伴蛋白和自身基因的轉(zhuǎn)錄，也能促進(jìn)ERS相關(guān)其他靶基因的轉(zhuǎn)錄。它是CREB/ATF家族的一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子。XBP1表達(dá)水平的改變會(huì)直接影響ERS的反應(yīng)強(qiáng)度[13]。對(duì)于IRE1/XBP1信號(hào)通路，國(guó)內(nèi)外的研究大多局限于體外研究。Kirkpatrick等[14]報(bào)道，與接受相同處理的XBP1+/+細(xì)胞相比，XBP1-/-小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞在發(fā)生ERS后，后者IRS1的酪氨酸磷酸化水平顯著降低，IRS1絲氨酸磷酸化顯著增強(qiáng)，抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而IRE1/XBP1信號(hào)通路在大鼠體內(nèi)的作用未見研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝組織IRE1、XBP1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示ERS通過(guò)介導(dǎo)IRE1/XBP1通路參與高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的形成。

3.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD形成的預(yù)防作用

現(xiàn)有研究[15]證實(shí)，耐力運(yùn)動(dòng)可較好地預(yù)防脂肪肝。吳明方等[16]報(bào)道16周有氧運(yùn)動(dòng)可改善NAFLD患者脂質(zhì)代謝紊亂，降低患者血漿SREBP1 c、TNFa水平。晉娜[17]報(bào)道運(yùn)動(dòng)可減輕肥胖程度，有效預(yù)防脂肪肝。分子水平研究報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD有預(yù)防作用可能與其抑制ChREBP基因表達(dá)[18]、降低肝臟TNFa mRNA的表達(dá)和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)有關(guān)[19]。有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴數(shù)量減少，油紅O脂滴光密度值顯著降低（P<0.05），PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達(dá)降低，提示運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD具有較好的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與其減低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

4 結(jié)論

8周高脂飲食可成功復(fù)制NAFLD動(dòng)物模型，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑參與NAFLD形成，運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD形成具有較好的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與其降低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]ALKHATER S A.Paediatric nonalcoholic fatty liver disease：an overview[J].Obes Rev，2015，16（5）：393.

[2]宋光耀，任路平.非酒精性脂肪肝疾病發(fā)生機(jī)制研究新進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（3）：664.

[3]OAKES S A，PAPA F R.The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology[J].Annu Rev Pathol，2015（10）：173.

[4]BYRNE C D，TARGHER G.Ectopic fat，insulin resistance，and nonalcoholic fatty liver disease：implications for cardiovascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（6）：1155.

[5]PAGLIASSOTTI M J.Endoplasmic reticulum stress in nonalcoholic fatty liver disease[J].Annu Rev Nutr，2012（32）：17.

[6]陳瀟迪，陳東風(fēng)，王軍，等.非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)機(jī)制[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013（6）：1172.

[7]常薪霞.鹽酸小檗堿對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠非酒精性脂肪肝的療效及機(jī)制研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2010.

[8]唐智明，鄧玉強(qiáng)，吳健，等.長(zhǎng)期游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠Musclin分泌和脂質(zhì)代謝的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)， 2011，30（12）：1078.

[9]OTGONSUREN M，ESTEP M J，HOSSAIN N，et al.A single noninvasive model to diagnose nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） and nonalcoholic steatohepatitis （NASH）[J].J Gastroenterol Hepatol，2014，29（12）：2006.

[10]FRAULOB J C，OGGDIAMANTINO R，F(xiàn)ERNANDESSANTOS C，et al.A Mouse Model of Metabolic Syndrome：Insulin Resistance，F(xiàn)atty Liver and NonAlcoholic Fatty Pancreas Disease （NAFPD） in C57BL/6 Mice Fed a High Fat Diet[J].J Clin Biochem Nutr，2010，46（3）：212.

[11]HAN X H，WANG J Y，WANG L，et al.[Role of PERK/eIF2a signaling pathway in hepatocyte apoptosis of alcoholic liver injury rats[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（10）：768.

[12]林志楠，羅紅飛，都健，等.胰島素抵抗大鼠肝臟組織PERK和pPERK的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（7）：529.

[13]LEE A H，SCAPA E F，COHEN D E，et al.Regulation of hepatic lipogenesis by the transcription factor XBP1[J].Science，2008，320（5882）：1492.

[14]KIRKPATRICK C L，WIEDERKEHR A，BAQUIE M，et al.Hepatic nuclear factor 1alpha （HNF1alpha） dysfunction downregulates Xboxbinding protein 1 （XBP1） and sensitizes betacells to endoplasmic reticulum stress[J].J Biol Chem，2011，286（37）：32300.

[15]ASCENSAO A，MARTINS M J，SANTOSALVES E，et al.Modulation of hepatic redox status and mitochondrial metabolism by exercise：therapeutic strategy for liver diseases[J].Mitochondrion，2013，13（6）：862.

[16]吳明方，陸阿明.有氧運(yùn)動(dòng)及其聯(lián)合飲食干預(yù)影響非酒精性脂肪肝患者血漿SREBP1c、RBP4水平的研究[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)，2015，30（2）：132.

[17]晉娜，陳文鶴.中小強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖癥患者脂肪肝的影響[J].上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，36（6）：58.

[18]李沙，吳皓，劉暢，等.肝臟ChREBP在有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)防C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝形成中的作用[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)，2014，32（4）：446.

[19]計(jì)慧.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂聯(lián)素及肝臟TNFα mRNA的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)，2014，29（10）：975.