N-鈣黏蛋白抗體對毛霉菌絲感染人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和血管性血友病因子表達(dá)水平的影響*

何 偉 徐升強(qiáng) 劉少平 王永濤 王月芹 蘇斌濤 胡志敏,#

N-鈣黏蛋白抗體對毛霉菌絲感染人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和血管性血友病因子表達(dá)水平的影響*

何 偉1徐升強(qiáng)2劉少平3王永濤2王月芹2蘇斌濤2胡志敏2,#

目的：觀察毛霉菌絲對人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVEC)分泌凝血因子的影響及N-鈣黏蛋白抗體的干預(yù)作用。方法：取增殖期HPMVEC，分為毛霉菌絲感染模型組(毛霉菌絲組，用1×104CFU毛霉菌絲與HPMVEC在37℃、5% CO2飽和濕度下共培養(yǎng)12h)、人N-鈣黏蛋白單克隆抗體干預(yù)組[N-鈣黏蛋白抗體組，在HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)前，先用該抗體(1mg/ml)與HPMVEC室溫作用1h，之后按毛霉菌絲組操作]和空白對照組(用無菌去離子水代替毛霉菌絲懸液，且不行N-鈣黏蛋白抗體作用，按毛霉菌絲組方法平行實驗)。分別于0h、1h、2h、6h、12h收集各組培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測其組織因子(TF)和血管性血友病因子(vWF)水平。結(jié)果：組內(nèi)比較，毛霉菌絲組TF和vWF水平隨培養(yǎng)時間增加而升高(均P<0.05或P<0.01)；組間比較，毛霉菌絲組各時相TF和vWF水平均較空白對照組升高(P<0.05或P<0.01)，而N-鈣黏蛋白抗體組各時相TF和vWF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：毛霉菌絲感染HPMVEC所致TF、vWF水平升高可被N-鈣黏蛋白單克隆抗體有效下調(diào)，或可用于防治由毛霉菌絲感染引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血栓形成。

N-鈣黏蛋白；不規(guī)則毛霉；人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；組織因子；血管性血友病因子

人體免疫功能損傷、介入性臨床診療、大劑量糖皮質(zhì)激素及廣譜抗生素的應(yīng)用等，使毛霉菌感染發(fā)病率呈上升趨勢[1-5]，也是造成較多疾病療效差、病死率高的原因之一[1,2]。毛霉菌絲黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷并促進(jìn)血栓形成，是毛霉菌絲血管侵襲性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]。N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)作為內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白，能介導(dǎo)白色念珠菌黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并被內(nèi)皮細(xì)胞吞噬[6,7]，引起一系列包括凝血功能紊亂等病理變化。下調(diào)或拮抗N-鈣黏蛋白的介導(dǎo)作用可以阻止或減少由真菌菌絲感染引起的凝血功能增強(qiáng)和血栓形成[6,8]。本文采用N-鈣黏蛋白單克隆抗體預(yù)處理人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell,HPMVEC)后，檢測毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)12h內(nèi)不同時相培養(yǎng)上清中組織因子(Tissue Factor,TF)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)水平變化，為N-鈣黏蛋白單克隆抗體干預(yù)治療毛霉菌感染提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

HPMVEC由武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心提供；不規(guī)則毛霉菌株由湖北省感染性皮膚病研究中心臨床分離[4]。N-鈣黏蛋白單克隆抗體(批號：ab76011)購自美國Abcam公司；沙堡弱培養(yǎng)基(批號：SAP-160120D)購自廣州迪景微生物科技有限公司；ELISA試劑盒(批號：HM11905、HM10062)和青霉素-鏈霉素雙抗(批號：J130071)購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(批號：13011-8611)購自杭州四季青公司；改良杜氏伊格爾高糖培養(yǎng)基(DMEM，批號：11816005)購自美國Gibco公司；AccumaxTM細(xì)胞解離液(批號：6V2916A)購自上海信裕生物公司；毛霉菌絲DNA提取試劑盒(批號：077K6133)購自美國Sigma公司。完全培養(yǎng)基(青霉素100U/ml、鏈霉素10μg/ml雙抗及滅活10%胎牛血清加至含L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基配制而成)。

1.2 HPMVEC擴(kuò)增培養(yǎng)

自液氮罐中取出HPMVEC置37℃水浴箱中復(fù)蘇后，接種于25ml完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，隔天傳代1次。取第3代HPMVEC，用3ml AccumaxTM細(xì)胞解離液處理5min，加入5ml完全培養(yǎng)基中和后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105CFV/ml作為實驗細(xì)胞懸液。取24孔培養(yǎng)板，每孔加入完全培養(yǎng)基800μl，再加入200μl HPMVEC懸液混勻，使成終濃度為1×104CFV/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長80%，呈多角形或長梭形時(圖1)棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次備用。

圖1 HPMVEC貼壁生長，呈多角形或長梭形(×400)

1.3 毛霉菌絲的制備與鑒定

取毛霉菌株接種于沙堡弱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7天后用細(xì)胞刮匙輕輕刮取菌落表面，用滅菌PBS沖洗，5000rpm離心10min收集毛霉菌絲，按照毛霉菌絲DNA提取試劑盒說明書提取毛霉菌絲DNA，將擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)產(chǎn)物送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司純化及測序，經(jīng)NCBI核苷酸序列比對檢索，其與基因庫中不規(guī)則毛霉菌(CBS 103.93)株序列同源性為98%。遂用無血清DMEM將此毛霉菌絲稀釋至1×105CFU/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗分組及處理

毛霉菌絲組：取上述制備好的HPMVEC，加入1×105CFU/ml的毛霉菌絲懸液100μl，再加入100μl完全培養(yǎng)基于24孔板，混勻后菌絲終濃度為1×104CFU/孔，置37℃、5% CO2、飽和濕度共培養(yǎng)(平行設(shè)置3孔)，每隔1h觀察菌絲生長狀態(tài)及HPMVEC形態(tài)。N-鈣黏蛋白抗體組：HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)前，以1∶100的抗人N-鈣黏蛋白單克隆抗體(1mg/ml)與HPMVEC室溫作用1h，吸出抗體，PBS洗3次，之后操作同毛霉菌絲組。空白對照組：用無菌去離子水代替毛霉菌絲懸液且不使用N-鈣黏蛋白抗體孵育，余按毛霉菌絲組方法平行操作。

1.5 TF和vWF水平檢測方法

分別收集各組共培養(yǎng)0h、1h、2h、6h、12h上清液，-80℃存儲批檢。采用ELISA嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。測量所有樣本光密度(OD)值，并以完全培養(yǎng)液作為空白對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化

毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)1h后即可黏附于細(xì)胞表面，至第12h，可見HPMVEC腫脹變形，部分細(xì)胞壞死，見圖2。

圖2 毛霉菌絲與HPMVEC共培養(yǎng)對細(xì)胞形態(tài)的變化

2.2 各組TF水平比較

組內(nèi)比較：空白對照組各時相TF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，毛霉菌絲組和N-鈣黏蛋白抗體組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且均隨共培養(yǎng)時間增加而升高(P<0.01)。毛霉菌絲組TF水平從培養(yǎng)1h到12h漸次顯著升高(t=3.49、36.32、16.34、20.96，P均<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組1h與0h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，從2h到12h亦漸次升高(t=30.24、11.80、17.05， 均P<0.01))。組間比較：共培養(yǎng)0h的各組TF水平差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，1h-12h各組TF水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。毛霉菌絲組各時相TF水平明顯高于空白對照組(t=3.74、39.81、67.79、130.02，P均<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組各時相TF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(t=-3.02、-10.56、-15.93、-30.52，P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組不同時相TF水平比較均=3，ng/L)

注：組內(nèi)：與0h比較，1)P<0.01；與1h比較，2)P<0.01；與2h比較，3)P<0.01；與6h比較，4)P<0.01；組間：與空白對照組比較，5)P<0.05，6)P<0.01；與毛霉菌絲組比較，7)P<0.05，8)P<0.01。

2.3 各組vWF水平比較

組內(nèi)比較：空白對照組各時相vWF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，毛霉菌絲組和N-鈣黏蛋白抗體組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且均隨共培養(yǎng)時間增加而升高(P<0.01)。毛霉菌絲組vWF水平從培養(yǎng)1h到12h漸次顯著升高(t=3.04、8.85、22.32、17.47，P<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組1h與0h差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，從2h到12h亦漸次升高(t=3.24、17.80、17.25，P<0.05或P<0.01)。組間比較：共培養(yǎng)0h的各組vWF水平差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，1h-12h各組vWF水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。毛霉菌絲組各時相vWF水平明顯高于空白對照組(t= 3.06、10.55、47.52、43.35，P<0.05或P<0.01)。N-鈣黏蛋白抗體組各時相vWF水平均較毛霉菌絲組顯著降低(t=-3.16、-8.91、-15.25、-19.59，P均<0.05)。見表2。

表1 各組不同時相vWF水平比較均=3，ng/L)

注：組內(nèi)：與0h比較，1)P<0.01；與1h比較，2)P<0.01；與2h比較，3)P<0.01；與6h比較，4)P<0.01；組間：與空白對照組比較，5)P<0.05，6)P<0.01；與毛霉菌絲組比較，7)P<0.05，8)P<0.01。

3 討 論

正常生理條件下，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血栓和促血栓形成雙重功能，以抗血栓形成為主。毛霉菌絲能黏附并損傷人血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[8]，如使凝血介質(zhì)釋放增加等。TF釋放增加能激活內(nèi)源性凝血因子X和Ⅻ，促進(jìn)凝血酶原復(fù)合物的形成，并通過一系列酶促反應(yīng)啟動外源性凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血液凝固或血栓形成[9]。vWF主要介導(dǎo)血小板與血管內(nèi)皮下膠原纖維黏附，亦可促進(jìn)血栓形成。本資料證實，HPMVEC與毛霉菌絲共培養(yǎng)1h，毛霉菌絲即黏附于HPMVEC，致細(xì)胞間隙增大及培養(yǎng)上清中TF、vWF水平顯著升高，繼續(xù)培養(yǎng)至12h，HPMVEC損傷加重，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹壞死；培養(yǎng)上清中TF、vWF水平也隨培養(yǎng)時間延長而明顯升高。表明毛霉菌感染可引起機(jī)體凝血功能異常增加，是血栓形成的危險因素。

毛霉菌絲侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致凝血功能增強(qiáng)及至血栓形成的機(jī)制目前尚不明確，有研究[10，11]認(rèn)為可能與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面蛋白受體對毛霉菌絲的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)；而N-鈣黏蛋白在此起到重要作用，因其表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，可調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附，參與細(xì)胞間的識別和信號傳導(dǎo)機(jī)制。因此，下調(diào)或拮抗N-鈣黏蛋白的介導(dǎo)作用既可驗證其病理機(jī)制，更能減少或阻止毛霉菌感染引起的凝血功能增強(qiáng)或血栓形成。故本研究采用人N-鈣黏蛋白單克隆抗體先行HPMVEC封閉處理后再與毛霉菌絲共培養(yǎng)，結(jié)果顯示培養(yǎng)上清TF、vWF水平比未先行處理的毛霉菌絲組顯著降低，進(jìn)一步說明N-鈣黏蛋白參與了毛霉菌絲的致病過程，采用N-鈣黏蛋白單克隆抗體可抑制毛霉菌絲的病理效應(yīng)。

綜上，毛霉菌絲感染HPMVEC可促進(jìn)其血栓介質(zhì)的分泌和釋放，是血栓形成的危險因素；N-鈣黏蛋白單克隆抗體通過拮抗N-鈣黏蛋白，可有效下調(diào)TF、vWF表達(dá)水平，從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、防治血栓形成的作用。

本文第一作者簡介：

何 偉(1977-)，男，漢族，碩士，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作

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Effect of N-cadherin Antibody on TF and vWF Expression by HPMVEC Infected with Mucor Irregularis

HE Wei1, XU Sheng-qiang2, LIU Shaoping3, WANG Yong-tao2, WANG Yue-qin2, SU Bin-tao2, HU Zhi-min2,#

1Department of Pharmacy;2Department of Laboratory Medicine,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China;3Center of Medicine Science Research, Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071, China；#

Objective: To investigate the effect of mucor hypha on human pulmonary microvascular endothelial cell (HPMVEC) and the intervention of N-cadherin antibody. Method: The proliferative phase of HPMVEC, divided into mucor infection model group (mucor hypha group, 1×104CFU mucor hypha and HPMVEC co-culture at 37℃,5% CO2and saturated humidity for 12h )，N-cadherin monoclonal antibody intervention group (N-cadherin antibody group, HPMVEC and 1mg/ml N-cadherin antibody co-culture at room temperature for 1h, before the infection of mucor hypha, then followed by mucor hypha group operation) and blank control group (sterile deionized water instead of mucor hypha,and the absence of the N-cadherin antibody, then followed the mucor hypha group method of parallel experiment. The supernatant of each group was collected at 0h, 1h, 2h, 6h and 12h, and the levels of TF and vWF were detected by ELISA. Results: Comparison with groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were significantly increased as time-dependent(P<0.05 orP<0.01). Comparison between groups, the levels of TF and vWF secreted in the supernatants of the mucor hypha group were sig-nificantly higher than the blank control group at each time point(P<0.05 orP<0.01), and after incubated with N-cadherin monoclonal antibody, the levels of TF and vWF released in the supernatants were significantly lower than the untreated mucor hypha group at each time point(P<0.05 orP<0.01).Conclusion: The increased level of TF and vWF induced by mucor hypha infected with HPMVEC, which can be effectively down-regulated by N- cadherin monoclonal antibody,it suggested the N-cadherin monoclonal antibody can be used to prevent the injury and thrombosis of vascular endothelial cells caused by infection of mucor hypha.

N-cadherin; Mucor Irregularis; HPMVEC; TF; vWF

湖北省衛(wèi)計委科研項目(WJ2015MB239)；武漢市衛(wèi)計委科研項目(WX14D02，WZ16D07)

湖北省武漢市第一醫(yī)院，武漢 430022；1藥學(xué)部；2檢驗科；3武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心；#

，E-mail:mycohu@163.com

本文2017-02-16收到，2017-05-30修回

R363.2

A

1005-1740(2017)03-0026-05