酪酸梭菌對(duì)RSV感染加重的哮喘小鼠氣道炎癥的影響

郭穎　張娟　曾明華

[摘要] 目的 酪酸梭菌對(duì)RSV感染的哮喘小鼠模型氣道的炎癥反應(yīng)的影響。 方法 6～8周齡雄性BALB/c小鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組（NC）、模型組（PC）、酪酸梭菌治療組（LS），每組12只。除對(duì)照組（NC）以外，其余各組均采用卵清蛋白腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)，建立小鼠哮喘模型，在哮喘模型建立后第二日用RSV隔日滴鼻，連續(xù)3次，復(fù)制急性病毒感染哮喘模型。對(duì)照組（NC）采用生理鹽水替代卵清蛋白和RSV。酪酸梭菌組（LS）于0～33天給予酪酸梭菌灌喂，每日1次，第34天計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的白細(xì)胞數(shù)目；制作肺組織的病理切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色，觀察肺組織病理變化；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)BALF與血清中細(xì)胞因子IFN-γ、BALF中IL-12、IL-5及血清中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。 結(jié)果 與模型組（PC）相比，酪酸梭菌組（LS）小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯降低（P<0.01），BALF及血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12的水平升高（P<0.01），嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-5水平降低（P<0.01）。 結(jié)論 酪酸梭菌可減輕RSV感染的哮喘小鼠氣道炎癥，酪酸梭菌對(duì)于RSV感染的哮喘小鼠具有一定的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 酪酸梭菌；支氣管哮喘；卵清蛋白；小鼠

[中圖分類號(hào)] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）15-31-06

[Abstract] Objective To explore the effect of Clostridium butyricum to aggravate airway inflammation in asthmatic mice infected with RSV. Methods 36 mice of 6-8 week old male BALB/c were randomly divided into control group（NC），model group（PC） and Clostridium butyricum treatment group（LS） with 12 mice in each.Except the control group（NC），all the other groups were treated with ovalbumin，intraperitoneal injection，sensitization and inhalation，the mouse asthma model was established.After the asthma model was established，second day RSV nasal drops were taken every other day for 3 times.The acute viral infection asthma model was copy.The control group（NC） was treated with normal saline instead of ovalbumin and RSV.Clostridium butyricum group（LS） in 0-33 days with Clostridium butyricum were fed 1 times a day，the number of leukocytes in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） was counted for thirty-fourth days.Pathological sections of lung tissue were made and HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes of lung tissue.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect BALF and serum levels of cytokines IFN-γ，IL-12，BALF，IL-5，and eosinophils in serum. Results Compared with the model group（PC），clostridium butyricum group（LS） the total number of white blood cells in BALF mice decreased significantly（P<0.01），the BALF and serum levels of cytokines IFN-，gamma，and IL-12 were elevated（P<0.01），and the levels of eosinophils，chemokines and IL-5 decreased（P<0.01）. Conclusion Clostridium butyricum can alleviate the airway inflammation of asthmatic mice infected with RSV.Clostridium butyricum has certain therapeutic effect for RSV infection in asthmatic mice.

[Key words] Clostridium butyricum；Bronchial asthma；Ovalbumin；Mice

支氣管哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，全球目前有3億多哮喘患者，并以每10年增加50%的速度遞增[1-2]。呼吸道合胞病毒（RSV）是引起哮喘急性發(fā)作與加重的主要原因，近80%的兒童

哮喘急性發(fā)作或加重與呼吸道病毒感染有關(guān)[3]。其機(jī)制可能與氣道高反應(yīng)性、T細(xì)胞活化、趨化因子分泌增加、全身免疫激活和氣道局部炎癥反應(yīng)等相關(guān)[4]。在哮喘的臨床治療上糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑等已被廣泛成熟的應(yīng)用，一些微生態(tài)制劑的應(yīng)用是兒童哮喘治療的新思路，實(shí)驗(yàn)證明取得了一定的療效，但是關(guān)于益生菌對(duì)于RSV加重的哮喘的作用少有研究。

酪酸梭菌（costridium butyricum）又稱酪酸梭狀芽胞桿菌，具有極強(qiáng)的整腸作用，它可抑制腸道中的致病菌，促進(jìn)腸道中有益菌如雙歧桿菌和乳桿菌的生長[5-6]。此前我們課題組研究證明，酪酸梭菌可以通過抑制過敏誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子和OVA特異性IgE及IgG1的產(chǎn)生、降低小鼠BALF中炎細(xì)胞總數(shù)、改善肺部病理變化減輕哮喘小鼠氣道炎癥[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谶M(jìn)一步研究酪酸梭菌對(duì)RSV感染加重的哮喘小鼠氣道炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

卵清蛋白OVA（美國Sigma公司），氫氧化鋁（天津市天力化學(xué)試劑公司） ，酪酸梭菌（山東科興生物制品有限公司），Hep-2細(xì)胞株（西京醫(yī)院兒科實(shí)驗(yàn)室），呼吸道合胞病毒A亞型（首都兒科研究所），空壓霧化器（歐姆龍大連有限公司）。

1.2 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)

在含10%胎牛血清的中培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，待細(xì)胞鋪滿單層約70%后，將RSV病毒原液接種于Hep-2細(xì)胞。維持在原條件下繼續(xù)培養(yǎng)，3～5d即可出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，待病變達(dá)80%以上收集病毒。采用TDID50測(cè)定病毒滴度。收集培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液，在-80℃冰箱和37℃水浴反復(fù)凍融3次，離心后收集上清懸液，保存于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆肹8]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

36只8周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，體重（20±2）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部動(dòng)物房，隨機(jī)分為三組，每組12只，分別為對(duì)照組（NC組）、模型組（PC組）、酪酸梭菌治療組（LS組），用不含OVA的顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。整個(gè)過程遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.4 模型的建立

實(shí)驗(yàn)第0天、第7天和第14天給予模型組（PC組）、酪酸梭菌治療組（LS組）小鼠腹腔注射致敏液0.2mL（含100μg OVA及1.5mg Al（OH）3）進(jìn)行致敏。對(duì)照組（NC組）小鼠采用生理鹽水溶液，注射部位及劑量與實(shí)驗(yàn)組相同。實(shí)驗(yàn)第21～28天給予PC組、LS組用含1%的OVA溶液作為霧化液激發(fā)。方法是將PC組、LS組兩組小鼠放在5L自制的密閉容器中，使小鼠暴露在1%OVA氣霧中，每日1次，每次30min。第29、31天每日給予上述1%OVA霧化；第28、30、32天給予體積100μL RSV上清液鼻腔滴入，共3次。待滴鼻第4天小鼠出現(xiàn)毛發(fā)豎立、無光澤，煩躁不安或精神萎靡，顫動(dòng)或點(diǎn)頭、咳嗽及呼吸加深、節(jié)律性收腹樣喘促等陽性反應(yīng)，表明RSV感染小鼠模型建立成功。對(duì)照組以生理鹽水代替OVA霧化激發(fā)和鼻腔滴入，頻次及時(shí)間同上。LS組于實(shí)驗(yàn)第0～33天采用酪酸梭菌溶液進(jìn)行灌胃（酪酸梭菌濃度5×108CFU/mL，即5g菌粉溶于10mL生理鹽水混勻后分裝，灌胃時(shí)每只小鼠0.2mL，-4℃保存。）其他兩組均采用等量生理鹽水代替酪酸梭菌溶液灌胃。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

在末次激發(fā)24h后處死小鼠，立即摘眼球取血，4℃、4000r/min，離心10min獲取血清。用自制穿刺針進(jìn)行氣管插管并固定，用0.8mL滅菌的冷 PBS 溶液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，10s后回抽，重復(fù)3次（回抽率>80%），將回抽的BALF于4℃，2500r/min，離心5min，收集上清液[9]。ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-5、IL-12及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。用1mL無菌PBS溶液重懸離心后的沉淀，取0.1mL重懸液進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 小鼠肺組織病理學(xué)變化的觀察

取各組小鼠的肺組織，按照H-E染色操作常規(guī)，經(jīng)福爾馬林固定、脫蠟回水、包埋、切片后，分別觀察氣道周圍嗜酸粒細(xì)胞、氣道黏液分泌物及氣道周圍膠原增生的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊者，多組間比較采用One-Way ANOVA法，組間兩兩比較采用LSD法；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布者，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用 Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV與Hep-2細(xì)胞孵育后的變化

未感染RSV的Hep-2細(xì)胞貼壁生長，形成單層鋪路石樣細(xì)胞，排列規(guī)則緊密，互相嵌合成多邊形；RSV感染細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞變圓、拉長及融合現(xiàn)象，鏡下可見細(xì)胞邊界不清，病變細(xì)胞相互融合呈“多核巨細(xì)胞”的合胞體，見圖1。

2.2 肺組織病理變化

肺組織HE染色顯示，NC組小鼠氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤較少，肺泡壁完整，PC組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤明顯增多，肺泡腔明顯狹窄，肺泡壁斷裂，LS組小鼠肺組織炎癥較模型組明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，偶見肺泡壁斷裂及管腔狹窄。見圖2。Masson染色結(jié)果顯示，NC組小鼠氣道周圍膠原纖維沉積較少；PC組小鼠氣道周圍膠原纖維明顯增多；LS組小鼠氣道周圍膠原纖維沉積減少。見圖3。

2.3 BALF的炎癥細(xì)胞變化

與NC組小鼠相比，PC組小鼠BALF中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中主要表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的升高；LS組小鼠 BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞明顯降低（P<0.01）。見圖4。

2.4 各組小鼠血清與BALF中IFN-γ、IL-12的檢測(cè)結(jié)果

與NC組相比，PC組小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-12水平明顯降低（P<0.01），LS組IFN-γ、IL-12可以明顯升高（P<0.01）。見圖5～6。

2.5 各組小鼠血清中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-5含量

與NC組相比，PC組小鼠血清和BALF中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子、IL-5水平明顯升高（P<0.01），酪酸梭菌可以降低哮喘小鼠嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子與IL-5水平（P<0.01），見圖7～8。

3 討論

支氣管哮喘（bronchial asthma）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。經(jīng)典免疫學(xué)說認(rèn)為，哮喘發(fā)病機(jī)制主要與Th1/Th2功能失衡相關(guān)，當(dāng)哮喘發(fā)作時(shí)，Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，可分泌大量細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Th1可引發(fā)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的宿主防御應(yīng)答，主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等，減少炎癥反應(yīng)[10-11]。因此許多學(xué)者認(rèn)為通過提高Th1細(xì)胞功能可達(dá)到抑制亢進(jìn)的Th2反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療哮喘的目的。IL-12是調(diào)節(jié)Th1分化的主要細(xì)胞因子：一方面，IL-12誘導(dǎo)Th1分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，加強(qiáng)了由它們介導(dǎo)的細(xì)胞免疫；另一方面，IL-12可抑制由Th2分泌IL-4、IL-5介導(dǎo)的體液免疫和IgE的升高，從而抑制哮喘的發(fā)生[12-13]。哮喘是一種以嗜酸粒細(xì)胞浸潤為特征的氣道炎癥性疾病[14]，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子是組織嗜酸性粒細(xì)胞增多的主要調(diào)解者，促炎細(xì)胞因子TNF-α和Th2型細(xì)胞因子IL-4各自誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子產(chǎn)生，并且它們的組合引起該產(chǎn)生顯著協(xié)同作用[15]。

呼吸道合胞病毒是嬰幼兒最為常見的呼吸道感染病原體[16-17]。由于RSV對(duì)氣道上皮細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致由氣道成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子增多引起炎性細(xì)胞啟動(dòng)聚集，并抑制其凋亡[18]，使氣道重構(gòu)加重，故加重哮喘發(fā)作。在我國各地，RSV每年都有流行，是導(dǎo)致急性下呼吸道感染的重要病原體[19]。

益生菌是一類在適當(dāng)?shù)臄z入數(shù)量時(shí)會(huì)對(duì)宿主機(jī)體帶來益處的活體微生物[20]。酪酸梭菌是人體內(nèi)有益菌之一[21-22]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，益生菌制劑不僅可以用于治療消化道疾病，而且有降低炎癥介質(zhì)、抗菌和提高機(jī)體免疫力的作用，在肺部感染和危重疾病等呼吸道疾病的治療方面的研究取得了較大的進(jìn)展，給呼吸系統(tǒng)疾病的治療研究指出了新的研究方向[23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服酪酸梭菌可降低RSV感染的哮喘小鼠血清和BALF中炎細(xì)胞總數(shù)、改善肺部病理變化，在一定程度上誘導(dǎo)RSV感染的哮喘小鼠分泌Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12上調(diào)，降低嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，減輕輕哮喘小鼠氣道炎癥，進(jìn)一步推測(cè)酪酸梭菌作為一種常見的益生菌，對(duì)RSV感染的哮喘疾病有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，能夠減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，達(dá)到輔助防治哮喘的作用，但其臨床應(yīng)用及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Masoli M，F(xiàn)abian D，Holt S，et al.The global burden of asthma：executive ummary of the GINA Dissemination Committee report[J].Allergy，2004，59（5）：469-478.

[2] Machura E，Mazur B，Rusek-Zychma M，et al.Cytokine production by peripheral blood CD4+and CD8+T cells in atopic childhood asthma[J].Clin Dev Immunol，2010， 2010：606139.

[3] Kumar A，Grayson M H.The role of viruses in the development and exacerbation of atopic disease[J].Ann Allergy ASthma Immunol，2009，103：181-186.

[4] 李昌崇，蘇苗賞.呼吸道合胞病毒致毛細(xì)支氣管炎與支氣管哮喘的關(guān)系及診斷治療策略[J].實(shí)用兒科血雜志，2006，21（16）：1045-1047.

[5] Skermanvbd，Mcgowanv，Sneathpha.Appmved fistsof bacterial names[J].Int J Syst Ihcteriol，1980，30：225420.

[6] Przamowski A.Untersuchung fiber die Entwickelungsgeschichte und Fermentwirking einiger Bacterien-Arten[M].Leipzig：Inaugural Dissertat Hugo Voigt，1880：158.

[7] 張娟，魏春，孫新，等.口服酪酸梭菌減輕哮喘小鼠氣道炎癥的研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（11）：1083-1087.

[8] 劉瑞清，張國成，黃可飛，等.重組人干擾素α1b對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠外周T淋巴細(xì)胞亞群及肺組織病理學(xué)的影響[J].2013，13（9）：1639-1644.

[9] 張娟.酪酸梭菌對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑防治作用的研究[J].陜西：第四軍醫(yī)大學(xué)，2016.

[10] 胡亞美，諸福棠實(shí)用兒科學(xué)[M].北京市朝陽區(qū)潘家園南里19號(hào)，人民衛(wèi)生出版社，2016，706-722.

[11] 鄒毅，終南山.呼吸道合胞病毒與支氣管哮喘[J].國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2002，22（1）：42-44.

[12] leonard P，Sur S.Interleukin-12：potential role in asthma therapy[J].BioDrugs，2003，17（1）：1-7.

[13] Shida K，Kiyoshima Shibata J，Nagaoka M，et al.Nanno M（2006）Induction of interleukin-12 by Lactobacillus strains having a rigid cell wall resistant to intracellular digestion[J].Dairy Sci 89：3306-3317.

[14] Aeffner F，Davis IC.Respiratory syncytial virus reverses airway hyperresponsiveness tomethacholine inovalbumin-sensitized mice[J].Plos One，2012，7：e46660.

[15] Zhu W，Bi M，Liu Y，et al.Thrombin promotes airway remodeling via protease-activated recepror-1 and transforming growth factor-β1 in ovalbumin-allergic rats[J].Inhal toxicol，2013，25（10）：577-586.

[16] 朱汝南.2000年秋冬至2002年夏北京地區(qū)急性呼吸道感染病毒病原學(xué)研究[J].臨床兒科雜志，2002，45：18-24.

[17] Lee GG，Yoon HJ，Zhu Z，et al.Respiratory Syncytial virus stimulation of vascular end othelial cell growth Factor/Vascular permeability factor.Am[J].Respir cell Mol Biol，2000，23：662-669.

[18] Zhang Q Mohammed. A cell-cultures from bronchial subepithelial myofibrob lasts enhance eosinophil survival in vitro[J].Eur Respir J 1996，9（9）：1839-1846.

[19] 張曉波，陸愛珍，王立波，等.兒童變態(tài)反應(yīng)性疾病相關(guān)因素研究[J].臨床兒科雜志，2007，25（9）：755-758.

[20] 吳江，吳正鈞，郭本恒.益生菌輔助防治過敏性疾病的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2013（2）：279-286.

[21] 張灼陽，劉暢，郭曉奎.益生菌的安全性[J].微生物學(xué)報(bào)，2008（2）：257-261.

[22] 王文建，鄭躍杰，國內(nèi)益生菌制劑臨床應(yīng)用狀況分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2009（1）：70-72.

[23] 李健，劉大鷹.微生態(tài)制劑在呼吸和危重癥疾病中的應(yīng)用進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014（6）：740-742.

（收稿日期：2017-05-09）