5種石油醚前處理對(duì)不同植物樣品黃酮含量測(cè)定的影響

鄭定華++袁淑娜++陳俊明++黃堅(jiān)雄++潘劍++李娟++周立軍

摘 要 為了解不同石油醚前處理對(duì)植物黃酮含量測(cè)定的影響，用70 %乙醇提取、蘆丁硝酸鋁亞硝酸鈉比色法，對(duì)經(jīng)過5種石油醚前處理的不同植物樣品中黃酮含量進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明：經(jīng)石油醚索氏回流前處理的樣品提取液顏色較淺且沉淀較少；先提取再石油醚萃取處理的各樣品黃酮含量測(cè)定值均異常高于其他4種處理；經(jīng)CK、石油醚超聲30 min、石油醚浸泡15 h前處理的烏蕨、廣金錢草樣品黃酮得率均有所提高，但地膽頭和雞骨草則有升也有降；進(jìn)一步檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，若待測(cè)液有未除盡的石油醚，則會(huì)而造成測(cè)定值偏高。結(jié)論：石油醚前處理未必能提高植物樣品黃酮得率，也不會(huì)造成黃酮的顯著損失，在一般的植物黃酮含量測(cè)定中其并非必要程序，但若采用了該程序則應(yīng)在黃酮含量測(cè)定前除去待測(cè)液中余存的石油醚以排除干擾。

關(guān)鍵詞 石油醚 ；植物黃酮 ；提取 ；黃酮含量 ；干擾

中圖分類號(hào) TS224.4

Effects of Five Petroleum Ethers Pretreatment on

Different Plant Samples Flavonoid Content

ZHENG Dinghua YUAN Shuna CHEN Junming HUANG Jianxiong

PAN Jian LI Juan ZHOU Lijun

（Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Danzhou Station for Tropical Crops Investigation & Experiment， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract In order to find out the effects of different petroleum ether pretreatment on the content determination of plant total flavonoid，four plant samples pretreated by five different petroleum ether treatments were studied in this paper. Results showed that extracts （70 % ethanol extract， the same blow） from samples pretreated by heating reflux with Soxhlet extractor （CK） showed lighter color， deposit was easier found in extracts with no petroleum ether treatments. All of the petroleum ether pretreatment after extraction showed abnormally higher total flavonoid content than CK， no petroleum ether treatments， petroleum ether pretreated 30 min by ultrasonic， and petroleum ether pretreated 15 h by Cold-soak. Total flavonoid content of Stenoloma chusanum and Desmodium styracifolium that pretreated by CK， petroleum ether pretreated 30 min by ultrasonic， and petroleum ether pretreated 15 h all showed higher total flavonoid content than that of no petroleum ether treatments， but Elephantopus scaber and Aburs cantoniensis showed higher or lower. Further analysis found that residual petroleum ether in the extract may interfere the determination value of flavonoids. Conclusions： Petroleum ether pretreatment did not necessarily helpful or cause significant loss for plant flavonoid extraction， so it was not a necessary procedure in plant flavonoid determination， but if petroleum ether pretreatment were carried out， petroleum ether must be clean out before determination.

Key words petroleum ether ； plant flavonoid ； extract ； flavonoid content ； interfere

黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的一類重要的次生代謝產(chǎn)物，種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。植物黃酮類成分具有保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、保護(hù)心血管等多種藥理活性，是植物和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。黃酮提取是植物黃酮含量測(cè)定的基礎(chǔ)，提取前一般先對(duì)植物樣進(jìn)行除雜處理。石油醚可破壞植物蠟質(zhì)層和溶解油脂、葉綠素、胡蘿卜素等[2-6]，且一般黃酮類化合物不溶于石油醚中[7]，因此，植物黃酮的提取一般可用石油醚進(jìn)行脫脂。有研究指出石油醚前處理可提高植物黃酮得率[2，3，8]，但有部分研究略去該程序[9-12]。石油醚前處理究竟會(huì)不會(huì)對(duì)植物黃酮含量的測(cè)定產(chǎn)生影響？筆者鮮有發(fā)現(xiàn)針對(duì)性的比較研究?；诖耍狙芯坑?0 %乙醇提取、蘆丁硝酸鋁亞硝酸鈉比色法，對(duì)分別經(jīng)過5種不同石油醚前處理的4種植物樣品中黃酮含量進(jìn)行了比較研究，以期探討不同石油醚前處理對(duì)植物黃酮含量測(cè)定的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

地膽草根莖混合樣、廣金錢草葉片樣、雞骨草地上莖葉混合樣、烏蕨地上部綠葉。均2016年10月采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠林下間作試驗(yàn)基地。

儀器：日本島津AUW220D電子天平，南方力勁機(jī)械有限公司超聲波清洗機(jī)NK-C0112，索氏提取器，上海天美UV-1102分光光度計(jì)，磁力攪拌器，上海一恒HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海安亭科學(xué)儀器廠TDL-5-A離心機(jī)。

試劑：沸程60-90 ℃石油醚，乙醇，NaNO2，Al（NO3）3，NaOH；蘆丁標(biāo)樣購自中國(guó)食品藥品檢定研究院（純度92.6 %）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及黃酮提取

設(shè)5個(gè)處理，4次重復(fù)。精密稱取植物樣粉末，烏蕨樣約1 g，其他樣約2 g，5個(gè)處理為：（1）石油醚索氏回流處理（CK）：樣品濾紙袋包好，置索氏提取器中加70 mL石油醚，75 ℃回流2 h，棄石油醚，樣品濾紙袋熱揮干石油醚，再置索氏提取器中，加入80 mL 70 %乙醇，96 ℃回流提取6 h，轉(zhuǎn)出提取液，晾涼后用70%乙醇定容至150 mL，靜置；（2）無石油醚處理：樣品用濾紙袋包好，置索氏提取器中，后續(xù)70 %乙醇索氏提取步驟同處理（1）；（3）石油醚超聲30 min處理：樣品濾紙袋包好放試管中加50 mL石油醚，密塞，整批40 KH 600 W超聲處理30 min，棄石油醚，濾紙袋熱揮干石油醚，再置索氏提取器中，后續(xù)70 %乙醇索氏提取步驟同處理（1）。（4）石油醚浸泡處理：樣品用濾紙袋包好，放試管中加50 mL石油醚，密塞浸泡15 h，棄石油醚，濾紙袋熱揮干石油醚，后續(xù)70 %乙醇索氏提取步驟同處理（1）。（5）先提取再石油醚萃取處理：從處理（2）定容后的提取液中，精密量取10 mL提取液至試管中，加5 mL石油醚震蕩，靜置12 h后分層（經(jīng)過對(duì)比觀測(cè)萃取前后液面分層線均無變化），棄上層，得下層提取液。

分別量取各樣品提取液約8 mL，置離心管中，5 000 rpm離心10 min，得上清液，待測(cè)。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取蘆丁標(biāo)樣0.021 6 g，溶于70 %乙醇，定容至100 mL，得0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。按以下步驟標(biāo)定：（1）取10 mL容量瓶7個(gè)；（2）分別加入0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液；（3）加5 % NaNO2溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；（3）加10 % Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；（4）加4 % NaOH溶液4 mL；（5）70 %乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置10 min；（8）以508 nm測(cè)定吸光值（經(jīng)波長(zhǎng)掃描確定508 nm）。得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.062 8 x+0.000 4，R2=0.999 1。

1.2.3 提取液黃酮含量測(cè)定

精密吸取1 mL樣品提取液，置10 mL容量瓶中，按1.2.2中（3）-（8）程序測(cè)定，計(jì)算黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種石油醚前處理后樣品提取液顏色差異

由表1可知，經(jīng)石油醚索氏回流前處理的各樣品，黃酮提取時(shí)索氏提取管中的初始提取液顏色均比其它4種處理的顏色要淺，其中雞骨草樣品變化最明顯；未經(jīng)石油醚前處理的雞骨草、廣金錢草各樣品的黃酮初始提取液顏色均明顯深于其它4處理，其中雞骨草樣品變化最明顯；不同處理的植物樣提取液經(jīng)定容靜置后，最終提取液顏色由深至淺分別為雞骨草、烏蕨、廣金錢草、地膽頭，且提取液顏色越深越容易出現(xiàn)沉淀物，無石油醚處理的雞骨草最終提取液沉淀最明顯；除廣金錢草以外，同一植物樣經(jīng)石油醚索氏回流處理（CK）后其最終提取液顏色要比其他處理淺，其他4個(gè)處理的顏色差別不明顯。

2.2 5種石油醚前處理對(duì)樣品黃酮含量測(cè)定的影響

由表2可知，雞骨草、烏蕨的黃酮含量較高，廣金錢草、地膽頭的黃酮含量相對(duì)較低；處理（5）中地膽草、廣金錢草、烏蕨的黃酮相對(duì)得率分別為240.77 %、212.87 %、179.02 %，均極顯著高于其對(duì)應(yīng)的另外4處理，雞骨草的黃銅相對(duì)得率與其另外4處理間差異未達(dá)到顯著水平，但相對(duì)得率達(dá)到126.02 %；經(jīng)CK、無石油醚處理、石油醚超聲30 min、石油醚浸泡15 h處理的黃酮含量未達(dá)到顯著水平，其中經(jīng)CK、石油醚超聲30 min、石油醚浸泡15 h處理后，烏蕨、廣金錢草樣品的黃酮得率均比其未經(jīng)石油醚處理的得率有所提高，提高幅度分別為6.82 %-7.42 %、8.83 %-12.00 %，而地膽頭和雞骨草表現(xiàn)為有處理提高而有處理卻稍有下降。

2.3 石油醚干擾黃酮含量測(cè)定的進(jìn)一步檢驗(yàn)

針對(duì)處理（5）中各植物樣黃酮含量均異常高于其另外4種處理的情況，可能處理（5）所得提取液中余存的石油醚對(duì)黃酮含量測(cè)定造成了干擾，因此，以石油醚前處理相對(duì)較為充分的CK處理所得各樣品提取液及70 %乙醇和石油醚為測(cè)試材料，分別再經(jīng)石油醚萃?。╒石油醚：V提取液=1：2，下同）、石油醚萃取+水浴蒸干+70 %乙醇再定容至原體積等處理后，按1.2.3測(cè)定吸光值，結(jié)果見表3和表4。

由表3可知，石油醚在不添加任何試劑的情況下直接加注至比色皿，508 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光值為-0.006 8；把石油醚作為待測(cè)液按黃酮含量測(cè)定的步驟依次加入各試劑并定容靜置10 min后，開始分層，下層溶液雖未呈現(xiàn)任何紅色螯合物特征反應(yīng)，但有少量白色懸濁現(xiàn)象，其吸光值為0.494 2，均高于地膽頭、廣金錢草、烏蕨的黃酮含量測(cè)定的吸光值（表4）；石油醚與70 %乙醇溶液按1：2體積混合分層萃取后，下層乙醇溶液再按1.2.3測(cè)得的吸光值為0.014 1。

由表4可知，CK處理所得各樣品待測(cè)液經(jīng)石油醚再萃取后，4種植物樣提取液的吸光值均高于其CK處理的原吸光值，其相對(duì)值分別為167.44 %（地膽頭）、131.76 %（廣金錢草）、109.30 %（烏蕨）、101.58 %（雞骨草），其中，地膽頭、廣金錢草均極顯著高于其原吸光值；而經(jīng)石油醚萃取+熱蒸干+再定容后的處理，各樣品測(cè)得的吸光值均與其原測(cè)定吸光值較為接近，均未達(dá)到顯著水平。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，樣品先經(jīng)石油醚索氏回流前處理的，4種參試植物中有3種的提取液顏色比其未經(jīng)過石油醚處理的顏色淺，且未經(jīng)過石油醚處理的最終提取液較易出現(xiàn)沉淀物，說明石油醚索氏回流前處理有助于去除植物樣中呈色類雜質(zhì)及減少沉淀物出現(xiàn)。黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，除處理（5）中4種參試植物的黃酮含量測(cè)定結(jié)果均異常高以外，另外4種處理的組內(nèi)差異均不顯著，這說明在黃酮提取前是否采用石油醚前處理、或經(jīng)過不同石油醚前處理對(duì)黃酮含量測(cè)定結(jié)果的影響都比較小，因此，在一般的黃酮含量測(cè)定中略去樣品的石油醚前處理程序是可行的。經(jīng)CK、石油醚超聲30 min、石油醚浸泡15 h處理后，烏蕨、廣金錢草樣品的黃酮得率均比其未經(jīng)石油醚處理的得率有所提高但差異均不顯著，其相對(duì)提高率與香菜[2]、核桃葉[3]、銀杏葉[8]黃酮的研究結(jié)果相近，但地膽頭和雞骨草的則有升也有降，因此，植物樣品經(jīng)石油醚前處理可提高黃酮得率的觀點(diǎn)不具有普遍性，黃酮得率有可能因不同植物樣品及不同前處理方法而不同。

多數(shù)植物材料提取之前經(jīng)石油醚處理通常用量過大且耗時(shí)較長(zhǎng)，而對(duì)初提物進(jìn)行石油醚除脂處理則操作簡(jiǎn)單、用量少且耗時(shí)短[2]。純的石油醚與乙醇可以任意比例互溶，但石油醚與70 %乙醇水溶液經(jīng)混合靜置后卻可明確分層，且分層前后分層液面線并無明顯變化，因此，可用70 %乙醇提取植物黃酮后再用石油醚萃取脫脂，如陳易彬等[13]采用了類似的處理方法。處理（5）的測(cè)定結(jié)果表明，未經(jīng)過石油醚前處理的植物黃酮提取液，用石油醚對(duì)其進(jìn)行萃取后，其黃酮含量測(cè)定值就遠(yuǎn)高于其原測(cè)定值；進(jìn)一步的檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，以石油醚作為待測(cè)液按黃酮含量測(cè)定時(shí)，在未呈現(xiàn)任何紅色特征反應(yīng)的情況下其吸光值均高于地膽頭、廣金錢草、烏蕨樣品黃酮測(cè)定的吸光值，這嚴(yán)重影響黃酮含量測(cè)定，70 %乙醇溶液用石油醚萃取后得到的下層乙醇溶液再按黃酮含量程序測(cè)得的吸光值也影響黃酮含量測(cè)定。由此說明，只要測(cè)定溶液中有石油醚，就算未呈現(xiàn)任何黃酮測(cè)定紅色特征反應(yīng)，都有可能測(cè)得干擾黃酮含量測(cè)定結(jié)果的假性吸光值。因此，石油醚對(duì)黃酮含量測(cè)定的影響不容忽視，分析其原因應(yīng)該是經(jīng)過萃取后下層提取液中尚有少量互溶或未完全分層離出的石油醚；進(jìn)一步對(duì)前期脫脂相對(duì)較充分且含植物黃酮的CK處理提取液的分析結(jié)果表明，經(jīng)石油醚萃取后，得到的各樣品提取液的吸光值均高于其原吸光值，其中，地膽頭、廣金錢草均極顯著高于其原吸光值，這表明經(jīng)過石油醚萃取后黃酮含量的測(cè)定結(jié)果受到了顯著影響；而經(jīng)石油醚再萃取+熱蒸干+再定容再處理后，各樣品測(cè)得的吸光值均與其原吸光值較為接近，差異均未達(dá)到顯著水平，這說明萃取后增加了“熱蒸干+再定容”程序揮干余存的石油醚后其黃酮含量并未發(fā)生明顯變化，該結(jié)果支持“石油醚除脂處理不會(huì)導(dǎo)致提取純化過程中黃酮類物質(zhì)的大量損失[2]”的觀點(diǎn)。由此說明，石油醚前處理本身并不會(huì)造成黃酮得率的顯著變化，只是經(jīng)石油醚處理后待測(cè)液中余存的石油醚會(huì)干擾黃酮，含量測(cè)定造成結(jié)果偏高，但可采用熱蒸干的方法除去其干擾，且該方法不會(huì)造成黃酮的顯著損失。

綜上，初步認(rèn)為，石油醚前處理未必能提高植物樣品黃酮得率，也不會(huì)造成黃酮的顯著損失，在一般的植物黃酮含量測(cè)定中其并非必要程序，但若采用了該程序則應(yīng)在黃酮含量測(cè)定前除去其中余存的石油醚以排除干擾。

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