基于促甲狀腺功能的姜黃素延長(zhǎng)低溫冷凍小鼠生存時(shí)間的作用機(jī)制研究

李照雪，胡思遠(yuǎn)，王吉燁，陳澤慧，張閃閃，張 波

(1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，3.新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

基于促甲狀腺功能的姜黃素延長(zhǎng)低溫冷凍小鼠生存時(shí)間的作用機(jī)制研究

李照雪1,3，胡思遠(yuǎn)2，王吉燁1,3，陳澤慧1,3，張閃閃1,3，張 波1,3

(1. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，3.新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

目的低溫冷凍會(huì)對(duì)恒溫動(dòng)物生理系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，尋找凍害防護(hù)的藥物成為研究熱點(diǎn)。方法該文以姜黃素(curcumin，Cur)對(duì)小鼠冷凍損害保護(hù)作用與甲狀腺功能評(píng)價(jià)為研究?jī)?nèi)容。定量分析小鼠(-20±1)℃冷凍暴露生存時(shí)間、代謝指標(biāo)的變化；ELISA試劑盒檢測(cè)血清游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)含量；HE染色觀察甲狀腺組織形態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)甲狀腺功能相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果姜黃素(12.5～50 mg·kg-1)腹腔注射給藥能明顯延長(zhǎng)冷凍暴露小鼠的生存時(shí)間；甲狀腺HE形態(tài)學(xué)顯示姜黃素逆轉(zhuǎn)了冷凍導(dǎo)致的濾泡破損；姜黃素組代謝指標(biāo)改善明顯，血清FT3、FT4激素含量明顯增高，甲狀腺功能相關(guān)基因甲狀腺細(xì)胞鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium iodide symporter，Nis)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)、甲狀腺過(guò)氧化物酶(thyroid peroxidase，Tpo)mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，Tshr)mRNA的表達(dá)下調(diào)，這些促甲狀腺作用與左旋甲狀腺素鈉(sodium levothyroxine，L-T4)呈協(xié)同作用，且可被丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)所抑制。結(jié)論姜黃素延長(zhǎng)小鼠生存的低溫冷凍保護(hù)作用與其促進(jìn)甲狀腺功能密切相關(guān)。

姜黃素；冷凍損傷；甲狀腺；生存時(shí)間；昆明小鼠；丙硫氧嘧啶；左旋甲狀腺素鈉

寒冷是影響人體生理、行為功能的環(huán)境應(yīng)激因素。哺乳動(dòng)物有完善的體溫調(diào)節(jié)機(jī)制，低溫凍害會(huì)引起機(jī)體體溫調(diào)節(jié)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，最終導(dǎo)致死亡[1]。避免機(jī)體凍傷、提供低溫凍害防護(hù)在西北寒區(qū)具有積極意義。干姜在西域少數(shù)民族藥物與飲食中有悠久的使用歷史與文化傳統(tǒng)，國(guó)內(nèi)外鮮有干姜活性分子的冷凍損傷防護(hù)作用報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干姜提取物能提高冷凍暴露下小鼠的生存時(shí)間，近年來(lái)其活性分子姜黃素(curcumin，Cur)成為研究熱點(diǎn)(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)Fig 1)，其抗炎、改善微循環(huán)、降血糖以及抗腫瘤機(jī)制研究取得較大進(jìn)展[2-3]。但其對(duì)低溫冷凍是否存在保護(hù)作用及甲狀腺功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，姜黃素對(duì)冷凍小鼠的保護(hù)作用與甲狀腺激素代謝關(guān)系成為本文研究目標(biāo)。

Fig 1 Structure of curcumin

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂昆明小鼠18～22 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物研究中心，許可證編號(hào)：SCXK(新)2011-0001；批次：3批，2015年10月～2016年10月。

1.1.2試劑與儀器 姜黃素(純度≥98%)購(gòu)買(mǎi)于上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：R25M6S1)；丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)購(gòu)自上海朝暉藥業(yè)有限公司；左旋甲狀腺素鈉(sodium levothyroxine，L-T4)購(gòu)自默克雪蘭諾有限公司；血清FT3、FT4 ELISA試劑盒，購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程股份有限公司,批號(hào)13909KA1108；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，批號(hào)AK5401；實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)208054；引物由上海生工生物工程公司合成。多功能酶標(biāo)儀(Thermo VarioFlash 3001，Thermo，美國(guó))；低溫離心機(jī)(5424，Eppendorf，德國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q，QIAGEN，德國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及給藥 參考文獻(xiàn)[4]，取健康♂小鼠96只，隨機(jī)分成8組，每組12只。分別為對(duì)照組：上午10點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射生理鹽水，連續(xù)給藥8 d；姜黃素不同劑量組(12.5、25、50 mg·kg-1·d-1)治療組：上午10點(diǎn)分別對(duì)3組小鼠進(jìn)行腹腔注射姜黃素溶液，連續(xù)給藥8 d[5]；甲減模型組、甲減姜黃素治療組：甲減組小鼠按PTU 220 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)造模20 d[6]，再將小鼠隨機(jī)分為甲減模型組和甲減姜黃素治療組，兩組小鼠分別上午10點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射生理鹽水溶液和姜黃素溶液(50 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥8 d；甲亢模型組、甲亢姜黃素組：甲亢組小鼠按L-T4 350 μg·kg-1·d-1皮下注射，連續(xù)造模7 d[7]，再將小鼠隨機(jī)分為甲亢模型組和甲亢姜黃素組，兩組小鼠分別于上午10點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射生理鹽水溶液和姜黃素溶液(50 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)給藥8 d。

1.2.2小鼠寒冷暴露實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第1部分，實(shí)驗(yàn)d 8將實(shí)驗(yàn)各組小鼠放在預(yù)冷后的鼠籠內(nèi)，將其暴露在維持(-20±1)℃的冷應(yīng)激環(huán)境中，暴露2 h后摘眼球取血，分離血清，-80 ℃保存。第2部分，實(shí)驗(yàn)d 8將各組小鼠進(jìn)行(-20±1)℃的持續(xù)冷暴露，直至小鼠休克驚厥，觀察老鼠的行為、狀態(tài)和驚厥時(shí)間的變化[8]。1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本指標(biāo)觀察 冷凍處理前預(yù)先給藥階段觀察小鼠的神態(tài)、活動(dòng)情況、飲食飲水量、口唇耳色澤、皮毛情況。每天監(jiān)測(cè)各組小鼠的肛溫、飲水量及體重的變化，用電子天平測(cè)量體重及飲水量，小鼠肛溫電子溫度計(jì)(wi78653，北京東西儀科技有限公司)測(cè)量小鼠肛溫變化，并測(cè)量冷凍處理2 h后的小鼠肛溫，以上數(shù)據(jù)均分別測(cè)量2次，取均值進(jìn)行比較。

1.2.4甲狀腺分泌相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法(ELISA)檢測(cè)血清三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、甲狀腺素(FT4)水平的變化情況。

1.2.5小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察 眼眶采血處死小鼠，將附著甲狀腺的氣管截取，立即取出甲狀腺組織，用 4%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，采用蘇木精伊紅(HE)染色法，光學(xué)顯微鏡(200×)觀察甲狀腺細(xì)胞變性、膠原纖維增生程度等組織形態(tài)學(xué)變化[9]。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)甲狀腺組織中甲狀腺功能相關(guān)因子的表達(dá) 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)甲狀腺功能相關(guān)基因Tg、Tpo、Tshr、Nis的表達(dá)變化。使用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量檢測(cè)RNA水平及含量，并用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s。循環(huán)擴(kuò)增40次結(jié)束后，獲得Tg、Tpo、Tshr、Nis mRNA的循環(huán)域值(cycle threshold，Ct)，應(yīng)用ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)方法分析，計(jì)算出2-ΔΔCt目的基因的相對(duì)表達(dá)量后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。引物序列及退火溫度見(jiàn)Tab 1。

2 結(jié)果

2.1姜黃素延長(zhǎng)冷凍小鼠生存時(shí)間并改善神經(jīng)與代謝表觀指標(biāo)小鼠冷凍處理后，對(duì)照組小鼠于170 min左右出現(xiàn)驚厥或死亡，在220 min對(duì)照組小鼠全部驚厥或死亡，平均生存時(shí)間為194 min。高劑量姜黃素治療組的小鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)，在220 min開(kāi)始出現(xiàn)驚厥或死亡，到320 min全部驚厥或死亡，平均生存時(shí)間為262 min。中劑量組小鼠于200 min開(kāi)始出現(xiàn)驚厥或死亡，到270 min全部驚厥或死亡，平均生存時(shí)間為233 min。低劑量組小鼠于190 min開(kāi)始出現(xiàn)驚厥或死亡，到240 min全部驚厥或死亡，平均生存時(shí)間為212 min。由Fig 2可以看出，姜黃素給藥可以明顯提高冷凍處理小鼠的生存時(shí)間，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(P<0.05)。冷凍處理前，對(duì)照組小鼠口唇紅潤(rùn)，毛發(fā)有光澤，耳朵、尾巴呈淡粉色，食量正常，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏，飲水、飲食量、肛溫、便質(zhì)正常；腹腔注射姜黃素后，小鼠無(wú)刺激性反應(yīng)，體態(tài)無(wú)異常改變，正常進(jìn)食、飲水。與對(duì)照組相比，治療組小鼠行為無(wú)明顯改變，體重明顯降低，平均體重減少0.72 g(P<0.05)，飲水量明顯增加，每籠小鼠(5只)平均增加飲水5.37 mL(P<0.05)，肛溫明顯增加，平均增加0.52 ℃(P<0.05)，見(jiàn)Tab 2。各組小鼠在-20℃寒冷暴露后，均表現(xiàn)為聚堆，驚恐不安、緊張、眼球突出，目光銳利、心率加快、呼吸急迫、肛溫明顯降低，食欲減退或廢絕、肌肉震顫，尾根抖動(dòng)、少尿或無(wú)尿，有時(shí)頻頻排糞尿。而姜黃素治療組小鼠冷凍處理后生存狀態(tài)較好，出現(xiàn)該現(xiàn)象較對(duì)照組平均晚32.5 min。

Tab 1 Primer sequences

Tab 2 Effect of drugs on basic index of mice(±s,n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 The survive time of mice under(-20 ± 1)℃(n=12)

2.2姜黃素提高小鼠血清FT3、FT4的分泌水平與對(duì)照組相比，姜黃素治療組血清FT3(Fig 3A)、FT4(Fig 3B)分泌水平明顯升高(P<0.01)，呈濃度劑量依賴(lài)性升高，且高劑量姜黃素對(duì)血清FT3、FT4分泌水平的促進(jìn)作用最強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3姜黃素減輕小鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的損傷如Fig 4所示，正?？瞻捉M甲狀腺鏡下可見(jiàn)濾泡大小不等，為圓形、橢圓形或不規(guī)則形。濾泡上皮為單層立方上皮，細(xì)胞呈柱狀，核圓。濾泡內(nèi)充滿(mǎn)嗜酸性染色的膠質(zhì)，并有空泡現(xiàn)象。濾泡間分布有結(jié)締組織和毛細(xì)血管(Fig 4A)。冷凍處理對(duì)照組甲狀腺外觀明顯腫大，鏡下甲狀腺組織呈結(jié)節(jié)狀分布，結(jié)節(jié)大小不一，血管豐富。濾泡大小差異較大，可見(jiàn)濾泡腔擴(kuò)大，部分濾泡聚集消失形成較薄的結(jié)締組織分隔的結(jié)節(jié)，濾泡上皮細(xì)胞呈立方狀，腔內(nèi)膠質(zhì)減少(Fig 4B)。姜黃素治療組與對(duì)照組相比較，肉眼觀察甲狀腺腫大程度有所減輕，鏡下觀察甲狀腺組織分布較均一，組織內(nèi)血管增多現(xiàn)象不明顯。上皮細(xì)胞呈立方體，腺泡擴(kuò)大，見(jiàn)大量均一紅染膠質(zhì)(Fig 4C～4F)。且姜黃素對(duì)小鼠甲狀腺組織損傷的逆轉(zhuǎn)作用呈劑量依賴(lài)性，高劑量改善效果明顯。

Fig 3 Effects of curcumin on thyroid hormone FT3(A)and FT4(B) activity in mice after cold treatment(±s,n=12)

Tab 3 Effect of curcumin on basic index of hypothyroidism and hyperthyroidism in mice(±s,n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vscurcumin;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsPTU

Fig 4 Effects of different concentrations of curcumin onthyroid tissue structure after cold treatment in mice(n=12)

2.4姜黃素上調(diào)小鼠甲狀腺功能相關(guān)因子Tshr、Nis、Tg、Tpo mRNA的表達(dá)如Fig 5所示，姜黃素低、中、高劑量治療組Nis、Tg、Tpo mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，隨著姜黃素劑量的增加，Nis、Tg、Tpo mRNA的表達(dá)也逐漸增加；與對(duì)照組相比，姜黃素低、中、高劑量治療組促甲狀腺素受體(Tshr)的表達(dá)明顯減少，隨著姜黃素劑量增加，Tshr mRNA的表達(dá)也逐漸減少；其中Tg mRNA的變化最為明顯。

2.5左旋甲狀腺素鈉及丙硫氧嘧啶對(duì)姜黃素藥效的影響如Tab 3所示，左旋甲狀腺素鈉(L-T4)較對(duì)照組能明顯提高小鼠肛溫及飲水量(P<0.01)，并伴隨著小鼠體重的明顯減少(P<0.01)，肛溫平均增加1.01℃，每5只小鼠飲水量平均增加9.83 mL，體重變化較對(duì)照組平均減少6.32 g；L-T4能明顯延長(zhǎng)冷凍小鼠的生存時(shí)間，生存時(shí)間平均增加40 min(Fig 6A)；通過(guò)小鼠基礎(chǔ)代謝表觀可以看出姜黃素與L-T4的藥效相同。與對(duì)照組相比，L-T4與姜黃素聯(lián)用后產(chǎn)生協(xié)同藥效，可明顯提高小鼠的基礎(chǔ)代謝指標(biāo)(P<0.01)(Tab 3)，肛溫平均增加1.12℃，每5只小鼠飲水量平均增加11.65 mL，體重平均減少6.52 g，延長(zhǎng)冷凍小鼠的生存時(shí)間20 min(Fig 6A)。

Fig 5 Effect of acute cold exposure under(-20±1) ℃on levels of Tshr, Nis, Tg, Tpo of thyroid tissue(±s，n=12)

與對(duì)照組相比，丙硫氧嘧啶(PTU)能明顯降低小鼠肛溫及飲水量(P<0.01)，伴隨著小鼠體重的增長(zhǎng)(P<0.01)(Tab 3)，肛溫平均減少0.58 ℃，每5只小鼠飲水量平均減少10.17 mL，體重平均增長(zhǎng)1.89 g；PTU能明顯減少冷凍處理小鼠的生存時(shí)間，生存時(shí)間平均減少63 min(Fig 6A)，明顯降低了血清中FT3、FT4的分泌水平(P<0.01，F(xiàn)ig 6B)，并伴隨著Nis、Tpo、Tg、Tshr mRNA表達(dá)的明顯減少(P<0.01)，其中對(duì)Tg mRNA的抑制最為明顯(Fig 6C)；如Fig 6D所示，PTU處理后，冷凍處理的小鼠甲狀腺結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，甲狀腺濾泡有明顯腫大，濾泡破壞嚴(yán)重或邊界基本消失，增生變化明顯，多數(shù)濾泡膠質(zhì)稀薄甚至缺失，濾泡壁上皮細(xì)胞明顯受壓，表明PTU對(duì)小鼠甲狀腺功能產(chǎn)生明顯的抑制作用。PTU與姜黃素聯(lián)合用藥組同姜黃素單獨(dú)給藥組相比，明顯降低了小鼠肛溫(P<0.01)、飲水量(P<0.01)，并伴隨著體重的增加(P<0.01)，肛溫平均降低0.67 ℃，每5只小鼠飲水量平均減少12.96 mL，體重平均增加約3.03 g；冷凍處理小鼠生存時(shí)間降低，平均減少56 min；血清中FT3、FT4的分泌水平明顯降低(P<0.01)，Nis、Tpo、Tg、Tshr mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig 6C)，肉眼觀察可見(jiàn)甲狀腺明顯腫大，鏡下觀察甲狀腺組織呈結(jié)節(jié)狀分布，組織內(nèi)血管增多，濾泡上皮細(xì)胞肥大，腔內(nèi)膠質(zhì)減少(Fig 6D)；聯(lián)合給藥后，PTU抑制了姜黃素產(chǎn)生的促甲狀腺功能作用。

Fig 6 Impact of L-T4 and PTU on curcumin effect(±s,n=12)A:The survival time of mice under(-20±1) ℃; B: The effects of PTU, curcumin and combination of both treatment on thyroid hormone FT3 and FT4 activity in mice after cold treatment; C: The effect of acute cold expose under(-20±1) ℃ on the levels of Tshr, Nis, Tg, Tpo of thyroid tissue; D: Effects of PTU, curcumin and combination of both treatment on thyroid tissue structure after cold treatment in mice.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs Cur;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01 vs PTU

3 討論

恒溫動(dòng)物機(jī)體對(duì)寒冷存在著適應(yīng)和調(diào)節(jié)的內(nèi)在機(jī)制，超出機(jī)體調(diào)節(jié)范圍會(huì)引起機(jī)體損傷，低溫冷凍損害了心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、能量代謝等多個(gè)器官與系統(tǒng)，威脅生命安全。冷凍會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)持續(xù)興奮，內(nèi)分泌代謝調(diào)控從代償階段進(jìn)入到失代償階段，引起機(jī)體免疫力的下降、神經(jīng)損傷等神經(jīng)內(nèi)分泌多種病理學(xué)變化[1]。甲狀腺既是機(jī)體對(duì)抗低溫的重要內(nèi)分泌器官，也是冷凍損傷的重要靶器官[15]。因此，研究低溫冷凍條件下甲狀腺的保護(hù)與維持內(nèi)分泌功能是溫?zé)崴幬镅芯康囊粋€(gè)重要目標(biāo)。如何發(fā)掘中藥溫里藥以及寒冷地區(qū)民俗中合理的抗寒涼飲食成份成為研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

甲狀腺保護(hù)藥物的研究對(duì)預(yù)防及治療甲狀腺相關(guān)疾病尤為重要。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[12]，維生素C對(duì)由低體溫引起的神經(jīng)傳導(dǎo)速率損傷與神經(jīng)軸索病變可能具有保護(hù)作用。近年來(lái)，臨床上最常用的保護(hù)機(jī)體能量代謝與消耗的藥物，如優(yōu)甲樂(lè)、甲狀腺片、生長(zhǎng)激素、丙硫氧嘧啶、β受體阻斷劑等。當(dāng)機(jī)體甲狀腺功能不正常時(shí)，這些甲狀腺保護(hù)藥物通過(guò)對(duì)甲狀腺功能的調(diào)節(jié)來(lái)維持機(jī)體的能量代謝，但這類(lèi)藥物副作用大、不良反應(yīng)多、治療手段繁瑣、復(fù)發(fā)率高，且可能因劑量、作用方式、用藥時(shí)間的不同加速了甲狀腺的損傷。近年來(lái)，天然產(chǎn)物多靶點(diǎn)藥理學(xué)研究、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究為小分子天然產(chǎn)物的復(fù)雜藥理學(xué)作用提供了可借鑒的研究方法與數(shù)據(jù)[11]。由于低溫冷凍牽涉到包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、傳出神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜作用，姜黃素這種小分子、多靶點(diǎn)的多重藥理學(xué)研究進(jìn)展提示其可能存在著對(duì)甲狀腺功能的影響[2]。

甲狀腺激素的調(diào)控及甲狀腺功能相關(guān)基因與機(jī)體能量代謝關(guān)系密切。本文研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能明顯延長(zhǎng)冷凍處理后小鼠的生存時(shí)間，并且發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)冷凍處理時(shí)小鼠甲狀腺的活動(dòng)有著特殊的敏感性。研究結(jié)果表明，姜黃素對(duì)冷凍暴露誘導(dǎo)的機(jī)體損傷的保護(hù)原理是逆轉(zhuǎn)了甲狀腺組織的損傷，促使甲狀腺組織中甲狀腺功能相關(guān)基因Tg、Tpo、Nis基因上調(diào)，Tshr基因下調(diào)，進(jìn)而增加血清中FT3、FT4的分泌，隨即帶來(lái)了血液中總甲狀腺激素水平的增加。Ishido等[13]研究報(bào)道，Tg基因的表達(dá)對(duì)增強(qiáng)甲狀腺激素的分泌是必要的，我們研究中也發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)Tg mRNA的上調(diào)作用最為明顯。甲狀腺激素分泌的增加可導(dǎo)致體重減輕、體溫增加、飲水量增加。姜黃素則通過(guò)提高甲狀腺激素水平來(lái)增加產(chǎn)熱與代謝，這即是這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠肛溫、體重與飲水量之間存在差異的原因，這種差異與Mustafa等[14]的研究一致，最終對(duì)寒冷暴露后的機(jī)體產(chǎn)生了一定的保護(hù)價(jià)值。

左旋甲狀腺素鈉(L-T4)作為臨床上治療甲狀腺功能減退的代表西藥，對(duì)甲狀腺功能的促進(jìn)作用已被證明。姜黃素與L-T4的應(yīng)用都可促進(jìn)甲狀腺的功能，但外源性的激素稍稍使用不當(dāng)，便會(huì)興奮機(jī)體各系統(tǒng)，出現(xiàn)物質(zhì)、能量代謝亢進(jìn)[7]。本文研究數(shù)據(jù)證明優(yōu)甲樂(lè)與姜黃素聯(lián)合用藥時(shí)，兩者促甲狀腺功能的作用產(chǎn)生協(xié)同效果，但聯(lián)合用藥組較姜黃素或L-T4單獨(dú)給藥組延長(zhǎng)冷凍處理小鼠生存時(shí)間明顯縮短，聯(lián)合用藥后可能刺激下丘腦-垂體-甲狀腺軸的過(guò)度興奮，引起甲狀腺激素的分泌失衡，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱失調(diào)，散熱加快，加快了死亡，不利于抗寒。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，姜黃素單獨(dú)給藥組小鼠并未有上述現(xiàn)象出現(xiàn)，其副作用小、效果最佳。PTU同樣作為臨床上治療甲狀腺功能亢進(jìn)的代表西藥，能明顯抑制甲狀腺功能。當(dāng)PTU與姜黃素聯(lián)時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)PTU抑制了姜黃素的促甲狀腺功能作用，通過(guò)加劇甲狀腺組織的損傷，降低Tg、Tpo、Nis、Tshr基因的表達(dá)，減少血清中FT3、FT4的分泌，使得總甲狀腺激素水平減少，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱減少不能抵御寒冷，因此，甲狀腺功能減退的動(dòng)物不能適應(yīng)冷環(huán)境，這與計(jì)紅等[15]報(bào)道一致。提示PTU通過(guò)抑制姜黃素對(duì)甲狀腺功能的促進(jìn)作用，阻斷甲狀腺激素的合成，進(jìn)而縮短冷凍小鼠存活時(shí)間。

綜上所述，姜黃素通過(guò)促進(jìn)甲狀腺激素的生成，延長(zhǎng)了冷凍處理小鼠的生存時(shí)間。本研究首次指出了姜黃素通過(guò)提高甲狀腺激素水平來(lái)增加產(chǎn)熱與代謝，并且姜黃素同L-T4的正協(xié)同與PTU的負(fù)協(xié)同作用，說(shuō)明了姜黃素基于促甲狀腺功能對(duì)低溫冷凍小鼠生存時(shí)間的保護(hù)機(jī)制。本研究觀察的姜黃素冷凍保護(hù)現(xiàn)象是否存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的促進(jìn)作用還需進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(致謝：本研究在石河子大學(xué)藥學(xué)院新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)各位老師和實(shí)驗(yàn)室全體同學(xué)致以衷心的感謝！)

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Effectofcurcumininprolongingsurvivaltimeofcryopreservedmiceviapromotingthyroidfunction

LI Zhao-xue1,3, HU Si-yuan2, WANG Ji-ye1,3, CHEN Ze-hui1,3, ZHANG Shan-shan1,3, ZHANG Bo1,3
(1.SchoolofPharmaceutics;2.DeptofCardiothoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity;3.KeyLabofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

AimTo look for cold-protective drugs treating cryogenic freezing that may bring great damage to animal physiological system.MethodsThe protective effect of curcumin on frozen damage and the changes of thyroid function in mice were studied in this study. Quantitative analysis of the changes in survival time and metabolic indexes in mice disposed at(-20±1)℃ was conducted. Mouse serum free triiodothyronine(FT3) and free thyroxine(FT4) contents were detected by ELISA kit. HE staining was used to observe thyroid tissue morphological items. The expression of genes related to thyroid function was assessed via real-time quantitative PCR.ResultsThe intraperitoneal injection of curcumin(12.5～50 mg·kg-1) could remarkably prolong the survival time of mice when exposed to cryogenic freezing. HE staining results displayed a recovered thyroid injury in morphology in the curcumin group, further with a notably improved metabolic indexes and evidently increase in serum FT3 and FT4 levels. The real-time quantitative PCR results indicated that the expressions of sodium iodide symporter(Nis), thyroglobulin(Tg) and thyroid peroxidase(Tpo) were up-regulated, and the expression of thyroid-stimulating hormone receptor(Tshr) was down-regulated. Sodium levothyroxine collabrated with the promoting thyroid effects of curcumin, while propylthiouracil inhibited the effects.ConclusionCurcumin can prolong the survival time of the cryogenic freezing mice, which is closely related to its ability to promote thyroid function.

curcumin; cold injury; thyroid; survival time; Kunming mice; propylthiouracil; sodium levothyroxine

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.040.html

2017-04-26,

2017-05-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460566，U1603122)

李照雪(1992-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)，E-mail：605576076@qq.com； 張 波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系統(tǒng)藥理學(xué)與中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：bozhang_lzu@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.020

A

：1001-1978(2017)09-1291-07

R-332；R282.71；R322.51；R347.2；R645；R977.14