基于微流控芯片技術(shù)橙皮苷抗肺腫瘤作用機制研究

樊佳新，王 帥,2,3，孟憲生,2,3，包永睿,2,3，李天嬌,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

基于微流控芯片技術(shù)橙皮苷抗肺腫瘤作用機制研究

樊佳新1，王 帥1,2,3，孟憲生1,2,3，包永睿1,2,3，李天嬌1,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心 116600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

目的探究橙皮苷誘導人肺癌細胞A549凋亡的作用機制。方法基于微流控芯片技術(shù)采用Hoechst 33342/PI染色法檢測橙皮苷對肺癌細胞A549凋亡壞死的影響；流式細胞術(shù)檢測橙皮苷對肺癌細胞周期及凋亡的影響；實時熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)基因VEGF、PI3K及PTEN的表達；Western blot 技術(shù)檢測橙皮苷誘導肺癌細胞中PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、PTEN及凋亡蛋白Bcl-2、周期蛋白Cyclin B1的表達。結(jié)果橙皮苷作用于細胞G0/G1期及S期，阻滯細胞分裂，并呈現(xiàn)濃度依賴性誘導肺癌細胞凋亡，其細胞凋亡壞死率由正常對照組的(6.7±0.6)%增至(27.9±1.1)%；經(jīng)橙皮苷誘導后的肺癌細胞中VEGF和PI3K基因表達相對降低，抑癌基因PTEN表達相對增加。Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)橙皮苷誘導的肺癌細胞中凋亡蛋白Bcl-2及周期蛋白Cyclin B1相對表達降低，PI3K-Akt信號通路蛋白Akt表達量與對照組比較明顯減少，PI3K蛋白表達量相對增加，PTEN表達量無明顯變化。結(jié)論橙皮苷可能是通過干擾PI3K-Akt信號通路，阻礙腫瘤細胞的分裂并促進凋亡蛋白的產(chǎn)生，從而誘導肺癌細胞 A549 凋亡。

橙皮苷；肺癌細胞A549；微流控芯片；實時熒光定量PCR；PI3K-Akt信號通路；Cyclin B1；Bcl-2；細胞凋亡

癌癥一直是危害人類健康的歷史性難題，其中肺癌已逐漸成為三大癌癥之一。隨著分子檢測技術(shù)的飛速發(fā)展和不同驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn)，肺癌已成為一類由不同分子亞型構(gòu)成的異質(zhì)性疾病，標志著肺癌的治療已經(jīng)正式進入靶向時代[1]。橙皮苷是黃酮類化合物的一種，不僅作為中藥陳皮的主要活性成分之一，在中藥荊芥中也是主要抗肺癌的活性成分，具有抗炎、提高免疫力、抑菌、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學活性[2-4]。多數(shù)文獻報道顯示其研究均采用孔板技術(shù)，為了進一步使其研究貼近人體內(nèi)部微環(huán)境，本研究以橙皮苷為研究對象，采用先進的微流控芯片技術(shù)進行體外藥效學研究，充分利用其微尺度條件下高效、節(jié)能的優(yōu)勢。并結(jié)合基因及蛋白質(zhì)免疫印跡法對其作用機制進行補充，為基于微流控芯片技術(shù)的腫瘤藥理學研究提供新的研究平臺及研究思路。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人非小細胞肺癌細胞株A549(購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)；橙皮苷(購自四川省維克奇生物科技有限公司，批號：160509，HPLC檢測純度≥98%)；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒[Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C1056-3]；Cell Cycle Assay Kit、Annexin V-FITC/PI Apotosis Detection Kit(南京諾維贊生物科技有限公司)；順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；高效RIPA裂解液(上海索萊寶生物科技有限公司，批號：20160627)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)；Albumin Bovine V (上海索萊寶生物科技有限公司，批號：1030D057)； EasySee Western Blot Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：K20603)；抗體β-actin、Akt、PTEN、PI3K、Bcl-2和Cyclin B1(Cell-signaling Tech.)。

1.2儀器與材料G-2U型光刻機(北京中科同志科技有限公司)；HPDC-32G-2型等離子清洗機(美國Harrick Plasma公司)；SC-1B型勻膠機(北京創(chuàng)世威納科技有限公司)；XMTD-808P程序溫控儀(余姚市長江溫度儀表廠)；精密注射泵(LSP04-1A，保定蘭格公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國SIM公司)；ECLIPSE Ti研究級熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；C6流式細胞儀(美國BD公司)；通用電泳儀(美國BD公司)；拋光單晶硅片(浙江立晶光電科技有限公司)；Sylgard 184型聚二甲基硅氧烷PDMS和固化劑(美國Dow Corning公司)。

Fig 1 The schematic diagram of chip

1.3方法

1.3.1芯片的設(shè)計與制作 通過軟光刻技術(shù)、模注法及等離子鍵合三大主要技術(shù)進行芯片制作，其中PDMS-玻璃復合芯片微流控芯片包括液閥操控層、流體通道層和玻璃基片層[5]。藍色區(qū)域為液閥及氣閥通道，紅色通道為流體通道，橢圓形紅色區(qū)域為4×4列細胞培養(yǎng)腔，4列細胞培養(yǎng)腔共用1個廢液口，如Fig 1所示。

1.3.2細胞培養(yǎng)及藥物配制 人肺癌細胞A549，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細胞接種于芯片中，待細胞貼壁后，以0.2 μL·min-1的流速經(jīng)蠕動泵灌注空白培養(yǎng)液進行動態(tài)細胞培養(yǎng)。

橙皮苷(20 mg)溶于200 μL DMSO配制成濃度為100 g·L-1儲存液， -20℃保存。實驗時用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(DMSO終體積分數(shù)不超過0.5%)。

1.3.3熒光染色法檢測肺癌細胞A549的凋亡壞死率 肺癌細胞常規(guī)培養(yǎng)于芯片中，待細胞密度占總面積的0.7左右時，給予不同濃度(0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 g·L-1)的橙皮苷分別刺激36 h，采用Hoechst 33342/PI染液對細胞進行雙染，使用倒置熒光顯微鏡對芯片進行拍照檢測。

1.3.4細胞周期檢測 同肺癌細胞培養(yǎng)的步驟一致，取單細胞懸液接種于6孔板中，加入濃度為0.533 g·L-1的含藥培養(yǎng)液以及濃度為6 mg·L-1的陽性對照藥(順鉑)刺激36 h后，分別收集細胞，參照周期檢測試劑盒的操作說明，避光反應(yīng)30 min，流式細胞儀檢測。

1.3.5細胞凋亡壞死檢測 同肺癌細胞培養(yǎng)的步驟一致，取單細胞懸液接種于6孔板中，分別加入濃度為0.533 g·L-1的含藥培養(yǎng)液以及濃度為6 mg·L-1的陽性對照藥刺激36 h后，分別收集細胞。參照細胞凋亡試劑盒的詳細說明書進行操作，流式細胞儀檢測。

Fig 2 Effect of hesperidin on A549 lung cancer cells

1.3.6實時熒光定量PCR檢測 肺癌細胞A549常規(guī)培養(yǎng)于6孔板中，待細胞密度占總面積的70%左右時，濃度為0.533 g·L-1的藥物干預(yù)36 h實驗。PBS清洗后收集細胞，所有的細胞懸液合并離心，棄上清，PBS清洗細胞沉淀1次，在細胞沉淀中依次加入1 mL TRIzol、200 μL氯仿、異丙醇、DEPC水配制的冰乙醇(體積分數(shù)為0.75的乙醇)，洗滌RNA，4℃離心5 min，室溫干燥至RNA沉淀由乳白色變成透明狀，加入一定體積的 RNA溶解液溶解。采用Qubit? 2.0 Fluorometer 測定RNA濃度和純度。應(yīng)用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)樣本濃度大小進行cDNA第一鏈合成，Tab 1為目的基因序列表。TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒進行擴增，反應(yīng)體系均為20 μL。采用三步法94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min的PCR擴增條件進行反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物分裝于200 μL EP管中，-20 ℃保存待用。

1.3.7Western blot檢測 取對數(shù)生長期的肺癌細胞A549，調(diào)整細胞密度接種于6孔板中。分別設(shè)置空白對照組、陽性對照組和橙皮苷給藥組，藥物誘導干預(yù)36 h后，用細胞裂解液裂解細胞，提取各組總蛋白，并使用Lowry法測定蛋白含量，使各組蛋白終濃度相同。采用10%分離膠和4%濃縮膠的SDS-PAGE，100 V電壓下電泳30 min，調(diào)節(jié)電壓120 V繼續(xù)電泳至指示劑至分離膠底部時結(jié)束電泳，隨即進行轉(zhuǎn)膜及封閉實驗。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，剝離 PVDF 膜進行抗原抗體特異性結(jié)合(一抗按照1 ∶500稀釋，二抗按照1 ∶5 000稀釋)，TBST漂洗，ECL法進行顯色，采用IPP軟件檢測分析條帶灰度值，用各組目的條帶的灰度值和內(nèi)參的灰度值比值表示蛋白質(zhì)相對表達水平。

Tab 1 Primer sequences of target genes

Fig 3 Influence of hesperidin on cell cycle

Fig 4 Influence of hesperidin on the cell apoptosis

Tab 2 Effect of hesperidin on apoptosisrates of A549 cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol

2 結(jié)果

2.1橙皮苷能有效抑制肺癌細胞A549的增殖與空白對照組相比，橙皮苷0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 g·L-1作用于A549細胞36 h后，凋亡壞死現(xiàn)象明顯(P<0.05)，見Fig 2A。橙皮苷作用于A549細胞36 h的半數(shù)致死濃度(IC50)為0.533 g·L-1。由Fig 2B可見，橙皮苷對肺癌細胞A549的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

2.2橙皮苷能抑制A549細胞周期分裂腫瘤細胞的分裂過程分為幾個時相，包括G0/G1期、S期、G2/M期，不同周期具有不同的功能[6]。與空白組比較，肺癌細胞A549經(jīng)橙皮苷干預(yù)后，G0/G1期所占比例由(62.0±1.1)%下降至(55.4±0.3)%，S期所占比例由(12.0±1.3)%明顯上升至(25.5±1.1)%，G2/M期無明顯變化，見Fig 3。提示橙皮苷可通過阻斷細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，增加S期細胞比例，從而達到抑制肺癌A549細胞增殖及分裂。

2.3橙皮苷能抑制A549細胞凋亡流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，給藥刺激36 h后，空白對照組與給藥組差異具有顯著性。隨著給藥濃度的增大，細胞的凋亡壞死率由(5.7±0.6)%增加至(27.9±1.1)%。見Tab 2、Fig 4。提示橙皮苷對肺癌細胞A549具有一定誘導凋亡的作用。

2.4橙皮苷調(diào)控癌癥相關(guān)基因表達PI3K和PTEN均為PI3K-Akt信號通路中的相關(guān)基因，VEGF為血管內(nèi)皮細胞生長因子，與PI3K-Akt信號通路具有一定的內(nèi)在聯(lián)系，均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系。橙皮苷對人肺癌A549細胞干預(yù)36 h后，對這3種基因產(chǎn)生了一定影響。其中PI3K和VEGF的表達相對降低，PTEN的表達相對增加。見Fig 5。

2.5橙皮苷對信號通路中相關(guān)蛋白的調(diào)控作用肺癌A549細胞經(jīng)橙皮苷誘導36 h后，收集細胞提取總蛋白，Western blot對PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達量進行分析。Fig 6結(jié)果顯示,與空白對照組相比較，給藥組中凋亡蛋白Bcl-2、周期蛋白Cyclin B1及Akt的表達相對降低，PI3K表達相對升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但PTEN上調(diào)效果不明顯，差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，橙皮苷通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路、凋亡蛋白和周期蛋白的表達，導致肺癌細胞凋亡。

Fig 5 Effect of hesperidin on relative gene expression in A549 cells

3 討論

肺癌已經(jīng)成為呼吸系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤類疾病之一，其中80%～85%為非小細胞肺癌。并且，肺癌的發(fā)病率以及死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[7-8]。橙皮苷為傳統(tǒng)中藥陳皮以及荊芥等藥材中的主要成分之一，大量研究表明，其對正常的細胞、組織及器官無明顯毒性，對腫瘤的治療以及心血管、神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的藥理活性[9-11]。

Fig 6 Effect of hesperidin on protein expression of A549 cells

本實驗充分利用微流控芯片技術(shù)高通量、高靈敏、低消耗等優(yōu)勢開展橙皮苷體外藥效學研究。細胞在微流體狀態(tài)下進行動態(tài)培養(yǎng)，其研究結(jié)果更加貼近人體內(nèi)部微環(huán)境，數(shù)據(jù)更真實可靠[12,14]。其次，給藥作用48 h的試劑消耗量不足0.6 mL，其消耗量是傳統(tǒng)孔板技術(shù)的百分之一，大大節(jié)約了研究成本，并簡化了傳統(tǒng)的復雜操作，為目前抗肺腫瘤類疾病藥物的高通量篩選奠定了實驗基礎(chǔ)。流式細胞儀的檢測進一步驗證其藥效結(jié)果，橙皮苷具有明顯的誘導腫瘤細胞凋亡的作用，同時對腫瘤細胞的G0/G1期和S期有所干擾，簡而言之，橙皮苷通過抑制細胞分裂進而延緩腫瘤細胞的增殖。應(yīng)用實時熒光定量PCR以及Western blot技術(shù)，對其細胞凋亡及細胞周期的結(jié)果從分子水平上進行了進一步驗證，明確橙皮苷對凋亡蛋白以及周期蛋白具有一定的調(diào)控作用。

PI3K-Akt信號通路是機體內(nèi)重要信號通路，通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡，參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。Cyclin B1 與Bcl-2與細胞的生長密切相關(guān)[15]，通過干擾PI3K-Akt信號通路、周期蛋白與凋亡蛋白的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖。綜上所述，橙皮苷對于肺癌細胞具有明顯的抗腫瘤活性，其通過干擾PI3K-Akt信號通路，從而影響周期蛋白以及凋亡蛋白的合成，誘導腫瘤細胞死亡。

(致謝：感謝遼寧中醫(yī)藥大學分析測試中心的全體老師在實驗期間給予的幫助，感謝索軼平、鄭義博、王焱同學給予本研究的大力支持。)

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Studyofmechanismsofhesperidinonanti-lungcancereffectbasedonmicrofluidicchiptechnology

FAN Jia-xin1，WANG Shuai1,2,3，MENG Xian-sheng1,2,3，BAO Yong-rui1,2,3，LI Tian-jiao1,2,3
(1.CollegeofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, 2.LiaoningProvinceComponentofTraditionalChineseMedicineandEngineeringResearchCenter, 3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchandEngineeringLaboratory,DalianLiaoning116600,China)

AimTo investigate the effect of hesperidin on human lung cancer cell A549 and the possible mechanism.MethodsThe cell apoptosis and necrosis of A549 treated with hesperidin were measured by the Hoechst 33342/PI fluorescent dye based on microfluidic chip technology. Cell cycle and apoptosis rate were evaluated by flow cytometry(FCM). The expressions of the related genes were detected through the real-time fluorescent quantitative PCR technology(RT-PCR) including VEGF, PI3K and PTEN. The protein expressions of Bcl-2, Cyclin B1, PI3K, Akt and PTEN were detected by Western blot after hesperidin intervention.ResultsThe proliferation of A549 cells was significantly inhibited by hesperidin in a dose-dependent manner. FCM results showed that hesperidin could not only influence the G0/G1phase and S phase, but also promote the apoptosis of lung cancer cells. Meanwhile, the apoptosis and necrosis rate was increased from(6.7±0.6)% to(27.9±1.1)% compared with that of control group(P<0.05). From the level of molecular, the gene expressions of VEGF and PI3K were decreased, while the PTEN was increased after hesperidin stimulation. Western blot results showed that the expression of protein Bcl-2, Cyclin B1 and Akt were decreased, which all showed close relationship with cell apoptosis, cell cycle and PI3K-Akt signaling pathway. The expression of PI3K was increased, but the change of PTEN was not statistically significant compared with that of control group.ConclusionHesperidin induces lung cancer cell apoptosis through PI3K-Akt signaling pathway, which blocks cancer cell division and destroys the balance of related protein expression.

hesperidin; lung cancer cell A549; microfluidic chip technology; real-time PCR; PI3K-Akt signal pathway; Cyclin B1; Bcl-2; cell apoptosis

時間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.030.html

2017-04-20，

2017-05-16

國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No 2013ZX09507005)；遼寧省教育廳一般項目(No L201605)

樊佳新(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物分析，E-mail：fjx4834@163.com； 孟憲生(1964-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學及藥品質(zhì)量分析，通訊作者，E-mail：mxsvvv@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.015

A

：1001-1978(2017)09-1260-06

R284.1；R329.25；R34-33；R734.202.2