杠板歸總黃酮抗大鼠肝纖維化作用的機(jī)制研究

曹后康，高 雅，黃思茂，張可鋒，2

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

杠板歸總黃酮抗大鼠肝纖維化作用的機(jī)制研究

曹后康1，高 雅1，黃思茂1，張可鋒1，2

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的在明確杠板歸總黃酮(TFP)抗二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化(HF)藥效基礎(chǔ)上，探索TFP抗HF的作用機(jī)制。方法將90只SD大鼠隨機(jī)均分為正常組、模型組、秋水仙堿(0.1 mg·kg-1)組和TFP(200、100、50 mg·kg-1)組。除正常組外，其余各組大鼠均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.5%的DMN溶液(2 mL·kg-1)，隔天1次，連續(xù)8周。從造模d 1起，各給藥組分別給予相應(yīng)劑量的藥物進(jìn)行干預(yù)，正常組和模型組給予等體積的溶媒，每天1次。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取血和肝組織。取相同位置的肝組織，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織病變程度；比色法檢測(cè)血清ALT、AST、SOD和MDA含量或活性；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量；ELISA法檢測(cè)肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的含量; 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)肝組織α-SMA、TGF-β1、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，TFP(200、100、50 mg·kg-1)能明顯改善肝組織病變，降低ALT、AST、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C表達(dá)，降低MDA水平，增加SOD活性，同時(shí)減少TNF-α、IL-1β和IL-6釋放，抑制α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)。結(jié)論TFP能夠抗DMN誘導(dǎo)的大鼠HF，其機(jī)制可能與抗氧化作用，抑制TGF-β1表達(dá)，調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路，并抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

杠板歸總黃酮；肝纖維化；二甲基亞硝胺；抗氧化；TGF-β1；JAK2/STAT3信號(hào)通路；炎癥反應(yīng)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)本是一種常見的肝臟自我修復(fù)過程，但在長(zhǎng)期炎癥或肝損傷等誘因下，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)被持續(xù)激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，同時(shí)活化的HSC大量增殖并分泌過量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，致使ECM合成與降解平衡失調(diào)，導(dǎo)致ECM大量沉積，最終導(dǎo)致肝組織正常結(jié)構(gòu)與功能被破壞，即形成HF[1]。研究表明[2]，HF的進(jìn)程始終都伴有炎癥反應(yīng)，各種炎癥因子與信號(hào)通路之間相互作用，形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，不斷加重肝損傷和HF。Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3, JAK2/STAT3)信號(hào)通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。在HF研究中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路激活后，可上調(diào)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎癥因子表達(dá)，并進(jìn)一步活化HSC，加速HF的發(fā)展進(jìn)程[3]。因此，JAK2/STAT3通路及相關(guān)炎癥因子是不斷加重HF的主要因素之一，通過抑制JAK2/STAT3通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可作為緩解HF的重要途徑。

HF是肝臟炎癥發(fā)展為肝硬化或肝癌的必經(jīng)之路，抑制HF進(jìn)展是防止慢性肝病發(fā)展為不可逆肝硬化或肝癌的有效手段，但HF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及眾多細(xì)胞因子或信號(hào)通路，且存在交互作用，目前臨床尚無公認(rèn)的有效抑制HF的藥物[4]。

本研究陽(yáng)性藥物秋水仙堿能夠通過抗炎等途徑抑制HF[5]，但存在腎毒、骨髓抑制等潛在的嚴(yán)重副作用[6]，限制了其臨床應(yīng)用。中藥治療具有多層次、多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn)，并且副作用小，對(duì)于防治慢性疾病有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7]，例如，中藥三七總皂苷可通過抑制JAK2/STAT3通路及其它多種途徑緩解HF[8]。杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸(Polygonum perfoliatum L.)的干燥地上部分，具有清熱解毒、利水消腫、止咳的功效，主治咽喉腫痛、肺熱咳嗽、濕熱瀉痢等[9]。本課題組前期研究表明，杠板歸總黃酮(total flavonoids extracted from Polygonum perfoliatum L，TFP)可通過抑制炎癥反應(yīng)緩解小鼠肝損傷，并且能夠緩解二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)誘導(dǎo)的HF，但具體機(jī)制未明確[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在明確TFP抗HF的藥效基礎(chǔ)上，通過觀察TFP對(duì)JAK2/STAT3通路及相關(guān)炎癥因子的影響，揭示TFP抗HF作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)8～10周齡♂SD 大鼠，體質(zhì)量200 g～300 g，購(gòu)于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2杠板歸總黃酮的制備[11]取2 kg杠板歸生藥粉碎，過80目篩，體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇回流提取2次，料液比1 ∶10(g ∶mL)，每次1.5 h，合并提取液，過濾，減壓蒸餾，濃縮得杠板歸總黃酮浸膏，加蒸餾水混勻后，鹽酸調(diào)pH值為5。D101 型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速為4 mL·min-1，然后靜置12 h，先后用3倍樹脂體積的體積分?jǐn)?shù)為0.3的乙醇和4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇洗脫，流速3 mL·min-1，將體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇洗脫液收集并濃縮至浸膏(純度83.52%)。

1.3試劑D101型大孔吸附樹脂(河北翔泰藍(lán)星精細(xì)化工有限公司)；二甲基亞硝胺(DMN，天津市化學(xué)試劑研究所，純度99%)；秋水仙堿粉劑(美國(guó) Sigma公司)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollage type Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collage type Ⅳ，Ⅳ-C)、TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3抗體(美國(guó) CST公司)；PVDF膜(美國(guó) Bio-Rad公司)；抗β-actin單抗(天錫傲銳東源生物科技有限公司)；辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.4動(dòng)物分組與處理90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、秋水仙堿(0.1 mg·kg-1)組和TFP(200、100、50 mg·kg-1)組，每組15只。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由飲食，溫度18～22℃，自然光照。除正常組外，其余各組大鼠均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.5%的DMN生理鹽水溶液(2 mL·kg-1)，隔天注射1次，連續(xù)8周。從造模d 1起，灌胃體積按照體質(zhì)量計(jì)算(10 mL·kg-1)，藥物配制成相應(yīng)濃度，各給藥組分別給予相應(yīng)劑量的藥物進(jìn)行干預(yù)，正常組和模型組給予等體積的溶媒，每天1次。8周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹腔注射質(zhì)量濃度為3 g·L-1戊巴比妥鈉生理鹽水溶液(10 mL·kg-1)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 500 r·min-1離心15 min后，取上層血清，-20 ℃保存；固定位置取肝組織，于-80 ℃保存。

1.5病理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)固定位置取肝組織，經(jīng)中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片(厚4 μm)、脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色等常規(guī)制作HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.6血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)按照試劑盒說明，測(cè)定血清中ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量。

1.7炎癥因子檢測(cè)取相同位置肝組織，制備10%肝組織勻漿，ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.8檢測(cè)肝組織中HF相關(guān)蛋白表達(dá)情況每組隨機(jī)選取5只大鼠肝組織，固定位置取肝組織60 mg，放入玻璃勻漿器中，加入含1% PMSF的RIPA組織裂解液1 mL，于冰上充分勻漿，然后4℃，15 000 r·min-1離心15 min，取上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。加入蛋白上樣緩沖液，95℃水浴變性5 min。配制10%分離膠，5% 濃縮膠，樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離蛋白(5%濃縮膠電壓80 V，10%分離膠電壓110 V)；恒流150 mA條件下轉(zhuǎn)膜3 h，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入一抗， 4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min，然后放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，再用TBST 洗滌3次，每次10 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片曝光，顯影，定影，膠片掃描后使用Quantity One 4.6軟件分析蛋白灰度，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1TFP對(duì)DMN誘導(dǎo)的HF大鼠肝組織病理學(xué)影響正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見纖維結(jié)締組織等病理變化。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，假小葉形成，大量肝細(xì)胞壞死，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生。與模型組比較，秋水仙堿組和TFP組大鼠肝細(xì)胞壞死得到顯著緩解，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，炎性浸潤(rùn)較輕，假小葉和纖維結(jié)締組織增生明顯減少(Fig 1)。

2.2TFP對(duì)DMN誘導(dǎo)的HF大鼠血清中ALT、AST、SOD和MDA的影響與正常組比較，模型組血清中ALT、AST和MDA含量或活性明顯升高(P<0.01)，SOD活性明顯降低(P<0.01)；經(jīng)TFP干預(yù)后，與模型組比較， ALT、AST和MDA含量或活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，SOD活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見Tab 1。

2.3TFP對(duì)DMN誘導(dǎo)的HF大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量的影響與正常組相比，模型組血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，TFP能降低HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量(P<0.05或P<0.01)，見Tab 2。

Fig 1 Effect of TFP on hepatichistopathology in HF rats(HE,×200)

Tab 1 Effect of TFP on serum ALT, AST, SOD and MDA in HF rats(±s,n=15)

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 2 Effect of TFP on serum HA, LN, PCⅢ and Ⅳ-C in HF rats(±s,n=15)

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 3 Effect of TFP on hepatic TNF-α, IL-1β and IL-6 in HF rats(±s,n=15)

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of TFP on relative protein expression in liver tissues of HF rats(±s,n=5)

2.4TFP對(duì)DMN誘導(dǎo)的HF大鼠肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響與正常組相比，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，TFP可明顯降低TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，見Tab 3。

2.5TFP對(duì)肝組織α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)的影響Fig 2結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，TFP可明顯抑制α-SMA、TGF-β1、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠腹腔注射DMN誘導(dǎo)HF模型，具有成模時(shí)間短、重復(fù)性好和持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此成為研究抗肝纖維化藥物的首選模型[12]。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)的ALT和AST溢出進(jìn)入血液，因此血清中ALT和AST的活性與肝損傷程度呈一致性[13]。研究表明[14]，當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化病變時(shí)，HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量與HF程度同步提高，可作為評(píng)價(jià)HF病變程度的指標(biāo)。在本研究中，模型組大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量明顯升高，且肝組織病理檢查也顯示出現(xiàn)大量纖維結(jié)締組織增生，表明DMN誘導(dǎo)大鼠HF模型建立成功。TFP可明顯降低大鼠ALT、AST、HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平，并改善肝組織病變。以上研究表明，TFP能夠抗DMN誘導(dǎo)的大鼠HF，具有明顯的保肝作用。

氧自由基和過氧化物作為危害機(jī)體健康的物質(zhì)，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成組織損傷，MDA是體內(nèi)主要脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物，與氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)；SOD是重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生防御作用[15]。TFP能夠提高SOD活性，降低MDA含量，表明TFP可能通過增強(qiáng)肝臟抗氧化能力，從而發(fā)揮保肝作用。

TGF-β1貫穿HF過程的始終，能夠持續(xù)激活HSC，不斷刺激HSC分泌ECM，加重HF病情，是目前所知最強(qiáng)的致HF細(xì)胞因子[16]。α-SMA作為HSC的活化標(biāo)志物，能夠反映HSC活化水平。研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子與JAK2/STAT3信號(hào)通路有著密切的關(guān)系[17]，磷酸化的JAK2和STAT3介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在誘導(dǎo)多種炎癥因子大量表達(dá)的同時(shí)，炎癥因子可通過正反饋激活JAK2/STAT3通路，從而不斷產(chǎn)生大量炎癥因子，持續(xù)活化HSC，導(dǎo)致肝組織不斷損傷，加重HF病情[18]。因此，抑制JAK2/STAT3通路激活可作為緩解HF的有效途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織α-SMA水平明顯升高，TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯上升，JAK2/STAT3通路被激活。TFP干預(yù)可明顯下調(diào)α-SMA、TGF-β1、TGF-β1、TNF-α和IL-1β表達(dá)，并抑制JAK2/STAT3通路激活，改善肝組織病變。

在HF中，氧化應(yīng)激、TGF-β1和JAK2/STAT3通路異常表達(dá)呈現(xiàn)一致性[19-20]，但三者之間是否存在直接調(diào)控關(guān)系，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杠板歸總黃酮可有效改善DMN誘導(dǎo)的大鼠HF，其機(jī)制可能與抗氧化、抑制TGF-β1表達(dá)和JAK2/STAT3通路及相關(guān)炎癥因子有關(guān)，其之間的相互作用關(guān)系，可作為本研究下一步深入探索的方向。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所完成，感謝王剛、陳雪梅、葸博婷等同學(xué)提供的幫助！)

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ResearchonmechanismofeffectoftotalflavonoidsextractedfromPolygonumperfoliatumL.onanti-hepaticfibrosisinrats

CAO Hou-kang1, GAO Ya1, HUANG Si-mao1, ZHANG Ke-feng1,2
(1.CollegeofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,GuilinGuangxi541004,China；2.CollegeofPharmacy,GansuUniversityofChineseMedicine,LanzhouGansu730000)

AimBased on the effect of total flavonoids extracted fromPolygonumperfoliatumL.(TFP) against dimethylnitrosamine(DMN)-induced hepatic fibrosis(HF), to investigate the anti-fibrotic mechanism of TFP.MethodsNinety SD rats were divided into normal group, model group, colchicines(0.1 mg·kg-1) group, and TFP(200, 100, 50 mg·kg-1) group. Except the rats of normal group, other rats were injected intraperitoneally with volume fraction 0.5% DMN solution(2 mL·kg-1) for eight weeks, once every two days. From the first day of modeling, each administration group was given the corresponding dose of drugs to intervene, and the normal group and model group were given an equal volume of solvent, once a day. At the end of the eighth week, the blood and liver tissues were collected. Liver tissue was taken at a fixed position, and the degree of liver tissue was observed by HE staining. The contents of serum ALT, AST, SOD and MDA were measured using colorimetric method; the levels of serum HA, LN, PCⅢand Ⅳ-C were detected using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in liver tissues were detected by ELISA; the expression of α-SMA, TGF-β1, p-JAK2 and p-STAT3 were detected by Western blot.ResultsCompared with the model group, TFP(200, 100, 50 mg·kg-1) could improve the liver tissue lesions, reduce the expression of ALT, AST, HA, LN, PCⅢ, IV-C and MDA, increase SOD activity, reduce the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6, and inhibit the expression of α-SMA, TGF-β1, JAK2, STAT3, p-JAK2 and p-STAT3.ConclusionTFP could inhibit DMN-induced HF of rats, which may be involved with antioxidant and inhibiting expression of TGF-β1, JAK2/STAT3 signaling pathway and inflammatory response.

total flavonoids extracted fromPolygonumperfoliatumL.(TFP); hepatic fibrosis; dimethylnitrosamine; antioxidant; transforming growth factor-β1; JAK2/STAT3 signaling pathway; inflammatory response

時(shí)間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.044.html

2017-05-20,

2017-07-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81460602)

曹后康(1993-)，男，碩士生，研究方向：肝病藥理學(xué)，E-mail： 1298420377@qq.com； 張可鋒(1982-)，男，碩士，副教授，研究方向：生藥質(zhì)量及活性成分藥效學(xué)，通訊作者，E-mail：xueshengcailiao@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.022

A

：1001-1978(2017)09-1303-06