優(yōu)化RT—PCR檢測試劑在流感病毒檢測中的應(yīng)用評價

高蕾　　燕勇　　吉季梅　　王恒輝　　葛志堅(jiān)

[摘要] 目的 探討優(yōu)化的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測試劑在流感病毒檢測中的應(yīng)用。 方法 選取乙型流感病毒Yamagata系細(xì)胞毒株1株對其倍比稀釋，取高、中、低三個稀釋濃度提取流感病毒核酸作為模板，采用具有高擴(kuò)增效率的SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，并用優(yōu)化試劑對三個濃度的流感病毒模板進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，與常規(guī)試劑TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反應(yīng)試劑盒進(jìn)行對比研究。 結(jié)果 優(yōu)化試劑的PCR反應(yīng)體系整個擴(kuò)增反應(yīng)時間從96 min縮短至55 min；通過Ct值比較，中、低濃度條件下的擴(kuò)增效率與常規(guī)TAKARA試劑比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；該試劑的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%，顯示其具有良好的可重復(fù)性。優(yōu)化試劑比TAKARA公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit成品試劑盒節(jié)約1/4的成本，有一定的經(jīng)濟(jì)效益。 結(jié)論 優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)試劑，縮短了PCR反應(yīng)時間，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，同時節(jié)約了試劑檢測成本，有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會推廣價值。

[關(guān)鍵詞] 乙型流感病毒；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；核酸；優(yōu)化

[中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）21-0099-04

Application evaluation on optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection

GAO Lei YAN Yong JI Jimei WANG Henghui GE Zhijian

Department of Clinical Laboratory， Jiaxing Center for Disease Control and Prevention in Zhejiang Province， Jiaxing 314050， China

[Abstract] Objective To discuss the application of optimized RT-PCR detection reagent in influenza virus detection. Methods One strain of influenza B virus Yamagata was selected and multiply diluted. Three concentrations （high， middle， and low） were selected and viral nucleic acid was extracted as templates. The PCR system was optimized by SpeedStar HS DNA polymeras and HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase with high amplification efficiency. Intra-batch and inter-batch repetitive tests were conducted on the three templates by optimized reagent. The results were compared with those of routine reagent TaKara One Step PrimeScript RT-PCR Kit. Results With optimized reagent， the reaction time of PCR was shortened from 96 min to 55 min. There were significant differences in Ct values between the amplification efficiency of middle and low concentration and that of routine TAKARA kit （P<0.05）. There were significant differences in Ct values among groups（P<0.05）. The variable coefficients were lower than 2% in both intra-batch and inter-batch tests， showing good repeatability. The cost of optimized reagent was about 1/4 lower than that of One Step PrimeScript RT-PCR Kit， showing a certain economic benefit. Conclusion Optimized RT-PCR detection reagent can shorten the response time of PCR， with good stability and repeatability， and can lower the cost， showing a certain economic benefit and promotional value.

[Key words] Influenza B virus； RT-PCR； Nucleic acid； Optimization

流行性感冒（Influenza）簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。經(jīng)空氣飛沫傳播、傳染性強(qiáng)、傳播迅速，因其病毒抗原易變異，且人類對變異毒株普遍易感，控制難度大，是我國重點(diǎn)監(jiān)測和防治的傳染病之一[1]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室確診方法是通過細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚培養(yǎng)分離定型流感病毒，不僅耗時長，而且技術(shù)要求高，無法及時對暴發(fā)疫情做出診斷[2]。如何在早期快速診斷分型、并對病毒變異進(jìn)行長期監(jiān)測，對流感的防控和臨床治療有重大意義[3-6]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，呼吸道疾病的診斷方法也不斷更新，如實(shí)時熒光定量PCR[7，8]、恒溫擴(kuò)增[9，10]以及基因芯片技術(shù)[11，12]等。本文應(yīng)用了具有超強(qiáng)耐熱性和延伸效率的新一代逆轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase和具有高擴(kuò)增效率的SpeedStar HS DNA聚合酶，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)體系，研究其反應(yīng)時間、敏感性及穩(wěn)定性，為流感的快速檢測提供穩(wěn)定高效的方法。

1 材料與方法

1.1樣本來源

MDCK細(xì)胞株B/浙江南湖/1310/2014（乙型Yamagata系）培養(yǎng)液，為本實(shí)驗(yàn)室留存，起血凝滴度為1∶128。毒株培養(yǎng)液經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）10倍倍比稀釋，獲得不同濃度的流感病毒培養(yǎng)液。選取其中10倍、104倍、107倍稀釋后的培養(yǎng)液分別作為高濃度、中濃度、低濃度樣本，分裝后于-80 ℃凍存。

1.2核酸提取

將上述高、中、低三個不同濃度的流感病毒上清液，按核酸提取試劑盒（ambion MagMAX-96 Viral RNA）說明書，在KingFisher Flex system核酸提取儀（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）上提取流感病毒RNA。提取的核酸經(jīng)檢測后-80℃保存。

1.3方法

1.3.1 熒光PCR擴(kuò)增 本次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增所需的引物、探針均由浙江省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。（1）常規(guī)RT-PCR反應(yīng)液配置和PCR擴(kuò)增條件參照TaKara 公司 One Step PrimeScript RT-PCR Kit 試劑盒，擴(kuò)增程序42℃ 30 min；95℃ 15 s；95℃ 10 s；55℃ 15 s，40個循環(huán)。（2）優(yōu)化試劑：采用SpeedStar HS DNA聚合酶和HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶優(yōu)化反應(yīng)體系配置，擴(kuò)增程序如下：50℃ 15 min、95℃ 10 s、95℃ 5 s、55℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.3.2擴(kuò)增效率 將上述的高、中、低濃度流感病毒毒株培養(yǎng)液提取的病毒核酸模板，采用優(yōu)化試劑和傳統(tǒng)TAKARA試劑分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較兩種試劑的擴(kuò)增效率。

1.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 將上述高、中、低濃度流感病毒毒株培養(yǎng)液提取的病毒核酸模板，按優(yōu)化試劑的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)，每個稀釋度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。依據(jù)其定量結(jié)果對數(shù)值，計(jì)算不同方法的變異系數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)時間比較

采用傳統(tǒng)TAKARA試劑的整個PCR擴(kuò)增反應(yīng)時間為96 min，采用優(yōu)化試劑整個PCR擴(kuò)增反應(yīng)時間是55 min，時間上縮短接近一半。

2.2 擴(kuò)增效率比較

高、中、低三種不同濃度，分別用兩種試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增的Ct值見表1。Ct值反映了模板初始濃度，是熒光信號到達(dá)要設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，同時也能反應(yīng)擴(kuò)增效率[13-15]。采用t檢驗(yàn)，在高濃度條件下，兩種試劑的檢測結(jié)果Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在中濃度和低濃度條件下，兩種試劑的檢測結(jié)果Ct值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即優(yōu)化試劑擴(kuò)增效率略優(yōu)于常規(guī)試劑。兩種試劑檢測結(jié)果Ct值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即采用優(yōu)化試劑檢測方法優(yōu)于常規(guī)試劑。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

高、中、低濃度流感病毒毒株培養(yǎng)液提取的病毒核酸模板，用優(yōu)化試劑進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)，每個稀釋度的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）以及變異系數(shù)（CV）見表3。3個稀釋濃度的Ct值變異系數(shù)均小于2%，表明所建立的流感優(yōu)化試劑的檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

2.4經(jīng)濟(jì)效益

傳統(tǒng)TAKARA 公司的“One Step PrimeScript RT-PCR Kit”成品試劑盒的市場價格為2420元/100個反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)配置的優(yōu)化試劑成本大約為1820元/100個反應(yīng)，節(jié)省約1/4實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，有一定經(jīng)濟(jì)效益。

3討論

流感具有暴發(fā)突然、擴(kuò)散迅速的特點(diǎn)，由于短期內(nèi)無法獲得毒株抗體，因而不能實(shí)現(xiàn)血清學(xué)檢測。熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，在流感病毒的檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，雙重、三重乃至多重PCR技術(shù)的應(yīng)用與開發(fā)，無論是準(zhǔn)確度還是檢測效率，均得到了很大程度的提高[16-18]。

傳統(tǒng)的檢出限定量檢測的方法是運(yùn)用目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建，即目標(biāo)病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，目標(biāo)基因片段純化回收，連接于質(zhì)粒載體，經(jīng)過純化、增菌后提取重組質(zhì)粒，再經(jīng)過PCR和測序，鑒定重組質(zhì)粒中的目標(biāo)片段正確，如此測得的檢出限，按照公式拷貝數(shù)=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023，直接定量到拷貝數(shù)[19-21]，該方法優(yōu)點(diǎn)是比較檢出限定量的拷貝數(shù)值，比較準(zhǔn)確，由質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性和重復(fù)性更好。缺點(diǎn)是整個過程操作比較繁瑣，耗費(fèi)時間長。

本文以實(shí)驗(yàn)室的B型流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)物直接PBS10倍稀釋后的選取代表性的高、中、低濃度，用t檢驗(yàn)比較兩種方法檢測高、中、低三個濃度下的Ct值有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明在高濃度下，兩個試劑擴(kuò)增效率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而中、低濃度條件下，優(yōu)化試劑擴(kuò)增效率略優(yōu)于常規(guī)TAKARA試劑。兩種試劑檢測結(jié)果Ct值組間比較也說明優(yōu)化試劑優(yōu)于常規(guī)試劑。優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡便，取材也方便，也具有一定代表性。不足是Ct值是個相對數(shù)值，不如直接的拷貝數(shù)精確。

本實(shí)驗(yàn)主要針對PCR反應(yīng)體系試劑的優(yōu)化，采用了高效逆轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase，該酶可在55℃長時間反應(yīng)并保持良好的穩(wěn)定性，高溫下保持高活性的逆轉(zhuǎn)錄酶使整個逆轉(zhuǎn)錄時間僅需15 min。同時搭配了用于快速PCR擴(kuò)增的Hot Star型DNA聚合酶，普通PCR酶的延伸為1 min/kb，而使用SpeedSTAR HS DNA Polymerase延伸可設(shè)定為10 sec/kb，實(shí)現(xiàn)短時間內(nèi)的快速PCR擴(kuò)增。因而整個擴(kuò)增過程比傳統(tǒng)TAKARA的OneStep RT-PCR擴(kuò)增程序節(jié)省了近一半的時間，大大提高了檢測的工作效率和縮短了臨床報告時間。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化試劑高、中、低3個稀釋濃度的批內(nèi)試驗(yàn)和批間試驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)CV均小于2%，表明優(yōu)化試劑具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，這對臨床診療和流感疫情爆發(fā)的處理尤其重要。同時，優(yōu)化試劑比TaKara公司One Step PrimeScript RT-PCR Kit成品商品試劑盒節(jié)約1/4的成本實(shí)驗(yàn)檢測費(fèi)。對于加入國家流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，需要進(jìn)行長期哨點(diǎn)醫(yī)院每周20份流感咽拭子疫情監(jiān)測的實(shí)驗(yàn)室，也有一定經(jīng)濟(jì)效益，故有一定的社會推廣價值。

本實(shí)驗(yàn)的初衷是想建立快速檢測病原微生物的反應(yīng)模型，提高日常工作效率，縮短反應(yīng)時間，尤其是在傳染病爆發(fā)的應(yīng)急檢測時。對于建立的體系，是否適應(yīng)于其他傳染病病原體，如手足口、諾如、麻疹、風(fēng)疹病毒核酸的檢測，還需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)室更多的樣本進(jìn)行研究和驗(yàn)證。

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（收稿日期：2017-04-19）