核苷（酸）類似物治療慢性乙型肝炎患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異的研究

李健，曾文興，方穎慧，曾小平

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西宜春336000)

核苷（酸）類似物治療慢性乙型肝炎患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異的研究

李健1、2，曾文興2，方穎慧2，曾小平1

(1、南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江西南昌330006；2、宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西宜春336000)

目的分析核苷（酸）類似物治療的慢性乙型肝炎患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)、變異位點(diǎn)組合模式、HBV DNA水平和HBeAg等特征，為臨床應(yīng)用核苷（酸）類似物抗乙肝病毒治療提供參考。方法納入研究的141例慢性乙型肝炎患者，使用NAs治療的107例為治療組，未使用藥物抗病毒治療的34例為對(duì)照組。采用線性探針反向雜交法(PCRRLP)檢測(cè)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)乙肝免疫標(biāo)記物，并對(duì)耐藥相關(guān)變異的特點(diǎn)和研究病例的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果核苷（酸）類似物治療效果不佳組耐藥相關(guān)變異檢出率（82.5%）明顯高于未治療的對(duì)照組（5.9%）和抗病毒治療有效組（有效組10例未檢出耐藥相關(guān)變異）（P＜0.01）。97例核苷（酸）類似物抗病毒效果不佳的病例中80例檢出140個(gè)耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)，包括rtM204I 45個(gè)、rtM204V 32個(gè)、rtA181V 28個(gè)、rtL180M 25個(gè)、rtN236T 10個(gè)；變異位點(diǎn)組合模式主要有：rtL180M+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtM204V、rtA181V+rtM204V、rtM204I、rtA181V+rtN236T等；51個(gè)對(duì)NAs應(yīng)答不佳病例耐藥變異檢出率70.59%，46個(gè)病毒學(xué)突破病例耐藥變異檢出率95.65%，差異明顯（P＜0.01）。NAs單藥治療病例早于多藥治療病例檢出耐藥相關(guān)位點(diǎn)（P＜0.01）；NAs治療時(shí)間越長，耐藥變異檢出率越高（P＜0.01）；病例HBV-DNA水平等級(jí)越高，耐藥變異檢出率也越高（P＜0.01）。結(jié)論⑴NAs治療慢性乙型肝炎可導(dǎo)致HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異，NAs抗乙型肝炎病毒效果不佳與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異密切相關(guān)；⑵不同NAs藥物導(dǎo)致慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異位點(diǎn)、變異模式特點(diǎn)不同；⑶NAs治療慢性乙型肝炎的用藥種類與方式、治療時(shí)長，患者HBV-DNA水平等對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)發(fā)生耐藥變異均可能產(chǎn)生重要影響。提示在NAs治療前、治療過程合適時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)NAs耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)和HBV DNA水平，可為臨床慢性乙型肝炎的抗病毒治療提供重要參考。

核苷(酸)類似物；慢性乙型肝炎；耐藥；HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)；基因變異

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是引起慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）的病原體，在全球流行。世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者[1]；全球有30%的肝硬化、45%的肝癌由乙肝病毒感染而引起；HBV感染導(dǎo)致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌患者中每年有約65萬人死亡[2-4]。在我國60%肝硬化和80%HCC患者由HBV感染引起[4，5]。我國10年前乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國一般人群HBsAg攜帶率為7.18%[6-8]，推算我國現(xiàn)有約有9300萬慢性HBV感染者，約有2000萬例CHB患者[9，10]。乙型肝炎病毒感染和治療是我國也是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，長期危害人民健康、阻礙經(jīng)濟(jì)發(fā)展、影響社會(huì)和諧。因此，加強(qiáng)乙型病毒性肝炎檢測(cè)、預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后的相關(guān)研究，具有重要意義。

目前除干擾素外，應(yīng)用于乙型肝炎抗病毒治療的主要藥物是核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs）。我國批準(zhǔn)的核苷（酸）類似物包括拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，ADV）、恩替卡韋（Entecavir，ETV）、替比夫定（Telbivudine，LdT）等[11]。LAM和LdT為L-核苷類藥物；ETV為脫氧鳥苷類藥物；ADV為五環(huán)磷酸鹽類藥物。NAs進(jìn)入人體內(nèi)可形成磷酸鹽活性成分，作為HBV DNA聚合酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與人體內(nèi)天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到HBV DNA聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止，這是NAs抑制HBV復(fù)制的機(jī)制[12，13]。NAs口服給藥、價(jià)格較低、抗病毒效果較好因而目前廣泛應(yīng)用于抗乙肝病毒。用藥依從性好的HBeAg陽性CHB患者，LAM治療一年內(nèi)HBV DNA的轉(zhuǎn)陰率可達(dá)30%～40%[14，15]；ADV治療一年內(nèi)HBV DNA的轉(zhuǎn)陰率可達(dá)10%～25%[16]；ETV治療一年內(nèi)HBV DNA的轉(zhuǎn)陰率可達(dá)67%[14]；LdT治療一年內(nèi)HBV DNA的轉(zhuǎn)陰率可達(dá)60%[16]；對(duì)HBeAg陰性CHB患者，單用NAs治療一年內(nèi)HBV DNA的轉(zhuǎn)陰率更好，可達(dá)50%～90%[17-19]。

HBV是變異率較高的病毒之一，發(fā)生在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基因變異，如果與HBV聚合酶有關(guān)就可導(dǎo)致HBV聚合酶與NAs結(jié)合力降低，使得NAs對(duì)變異的HBV抑制能力下降，野生株病毒因?qū)λ幬锩舾卸灰种?，變異株?duì)核苷（酸）類似物不敏感繼續(xù)復(fù)制增殖甚至代替野生株從而導(dǎo)致NAs抗病毒效果不佳甚至導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[20]。

NAs不能完全清除體內(nèi)病毒，目前用藥患者數(shù)巨大且患者長期服用NAs，對(duì)NAs耐藥問題在臨床上越發(fā)嚴(yán)重，往往導(dǎo)致患者病情反復(fù)甚至加重[21]。本文中將病毒學(xué)突破和病毒學(xué)復(fù)發(fā)的病例統(tǒng)歸為病毒學(xué)突破組；應(yīng)答不佳和原發(fā)性無應(yīng)答病例統(tǒng)歸為應(yīng)答不佳組；病毒學(xué)突破、病毒學(xué)復(fù)發(fā)、應(yīng)答不佳和原發(fā)性無應(yīng)答的病例統(tǒng)歸為抗病毒效果不佳組；有病毒學(xué)應(yīng)答病例歸為抗病毒有效組；NA+NA為NAs聯(lián)合或序貫用藥[22]。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》，即患者血清HBsAg陽性，HBeAg陽性或陰性，HBV DNA陽性；ALT持續(xù)或反復(fù)升高，或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。未合并其它病毒性肝炎。使用核苷（酸）類似物治療的病例（NAs治療組）抗病毒治療時(shí)間大于6個(gè)月；對(duì)照組慢性乙型肝炎患者未使用任何抗病毒藥物進(jìn)行治療。

1.1.2 研究對(duì)象一般資料據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)共選取2014年至2016年宜春市人民醫(yī)院門診或住院CHB患者共141例，病例平均年齡39.43±12.66，最大76歲，最小14歲。

NAs治療CHB患者（以下稱治療組）107例，其中男87例、女20例，均使用一種或多種NAs進(jìn)行抗病毒治療，且未使用過其它抗病毒藥物。其中，NAs治療CHB患者效果不佳者97例（即出現(xiàn)病毒學(xué)無應(yīng)答、應(yīng)答不佳、病毒學(xué)反彈、病毒學(xué)突破的四種情況之一）：單NAs治療的共61例（單用過LAM治療的31例，單用過ADV治療的20例，單用過EDV治療的15例，單用過LdT治療的5例）；曾經(jīng)用過多種NAs治療的36例（用過LAM、ADV、ETV治療的11例；用過LAM、ADV治療的患者14例；用過LAM、ETV治療的10例；用過ADV、ETV治療的1例）。NAs治療慢性乙型肝炎患者有效者10例。

對(duì)照組慢性乙型肝炎患者34例，其中男28例、女6例；均未使用任何抗病毒藥物進(jìn)行治療。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA定量檢測(cè)HBV-DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，用一對(duì)乙型肝炎病毒特異性引物和一條乙型肝炎病毒特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴(kuò)增法定量檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA。本試劑盒的檢出限度為1.0×102IU/ml，線性范圍為1.0×102～1.0×108IU/ml。

1.2.2 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)測(cè)定乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)試劑盒購自亞能基因股份有限公司，使用BIO-RAD基因擴(kuò)增儀對(duì)提取的HBV-DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在FYY3醫(yī)用核酸分子快速雜交儀上與設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行特異性雜交，雜交后洗膜、顯色，根據(jù)膜條特定位置顯色（藍(lán)色）與否來判斷HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)相關(guān)耐藥變異位點(diǎn)。

1.2.3 乙肝血清免疫標(biāo)記物購自中山生物工程有限公司乙肝五項(xiàng)ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)乙肝五項(xiàng)（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）是采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)；乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）是采用ELISA雙抗原夾心一步法檢測(cè)；乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）和乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）是采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法原理檢測(cè)。使用Anthos2010酶標(biāo)儀測(cè)定樣本和陰性、陽性和空白對(duì)照的吸光度值并判斷結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。兩樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，根據(jù)情況選擇Pearson卡方檢驗(yàn)、Yates卡方檢驗(yàn)；兩個(gè)樣本率的比較選擇四格表，兩個(gè)樣本構(gòu)成比的比較選擇2×C表。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 97例不同NAs治療CHB療效不佳患者的病毒學(xué)反應(yīng)

2 結(jié)果

2.1 資料情況對(duì)照組與NAs治療組在性別、年齡比較均無顯著性差異（P=0.877，P=0.093），具有可比性。

2.2 不同NAs治療CHB效果不佳患者的病毒學(xué)反應(yīng)分布情況NAs治療CHB效果不佳的97個(gè)病例，其中51例出現(xiàn)對(duì)NAs應(yīng)答不佳，46例出現(xiàn)病毒學(xué)突破，見表1。

2.3 不同NAs治療CHB效果不佳者病毒學(xué)突破的比較

2.3.1 單LAM與單ADV治療病例效果不佳者病毒學(xué)突破比較單LAM治療發(fā)生病毒學(xué)突破在療效不佳患者中占比46.67%，與單ADV治療發(fā)生病毒學(xué)突破（在療效不佳患者中占比29.41%）比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（χ2=1.34，P＞0.05），見表2。

2.3.2 單LAM與含LAM多藥治療病例效果不佳者病毒學(xué)突破比較單LAM治療發(fā)生病毒學(xué)突破占療效不佳患者46.67%，與LAM聯(lián)合或序貫應(yīng)用其它藥物治療組（占比68.57%）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.19，P＞0.05），見表2。

2.3.3 單LAM與單ETV治療病例應(yīng)答不佳者病毒學(xué)突破比較單LAM治療發(fā)生病毒學(xué)突破在療效不佳患者中占比46.67%，與單ETV治療發(fā)生病毒學(xué)突破（在療效不佳患者中占比27.27%）比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)無差別（χ2=1.28，P＞0.05），見表2。

2.3.4 單NAs與多NAs治療病例應(yīng)答不佳者病毒學(xué)突破比較單NAs治療發(fā)生病毒學(xué)突破在療效不佳患者中占比36.07%，與多NAs聯(lián)合或序貫應(yīng)用其它藥物治療發(fā)生病毒學(xué)突破（在療效不佳患者中占比66.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.41，P＜0.01），見表2。

2.4 HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 對(duì)照組與NA治療效果不佳組HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異檢出情況對(duì)照組（未治療組）34個(gè)病例中檢出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異2例，檢出率5.9%。NAs治療效果不佳組97例中檢出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異80例，檢出率82.5%。NAs治療效果不佳組HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異檢出率明顯高于未治療組（χ2=63.078，P＜0.01），即明顯高于自然變異，見表3。

2.4.2 NAs抗病毒治療有效組與效果不佳組HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異檢出率比較治療組中有10個(gè)病例使用NAs抗病毒治療有效，未檢出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異；97例使用NAs抗病毒治療效果不佳，80例檢出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異，檢出率82.5%。抗病毒效果不佳組變異檢出率明顯高于抗病毒有效組（χ2=32.68，P＜0.01），見表3。

2.4.3 NA治療效果不佳患者應(yīng)答不佳組與病毒學(xué)突破組病例HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異檢出情況治療組97個(gè)病例中檢出HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥相關(guān)變異80例，其中對(duì)NAs應(yīng)答不佳的51個(gè)病例中36例檢出耐藥變異，病毒學(xué)突破46個(gè)病例中44例檢出耐藥變異。兩組耐藥變異檢出率差異顯著（χ2=10.51，P＜0.01），見表3。

2.5 耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)與分布對(duì)照組兩病例檢出變異位點(diǎn)兩個(gè)：rtM204V和rtN236T。治療組80個(gè)病例檢出變異位點(diǎn)140個(gè)：rtL180M25個(gè)、rtM204V32個(gè)、rtM204I45個(gè)、rtA181V28個(gè)、rtN236T10個(gè)。變異位點(diǎn)詳細(xì)分布見圖1。

圖1 耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)在不同NAs治療下的分布

表2 不同NAs治療CHB效果不佳者病毒學(xué)突破的比較

表3 不同分組耐藥相關(guān)變異的比較

2.5.1 變異位點(diǎn)rtM204V rtM204V在單LAM治療組占總變異位點(diǎn)數(shù)的40.0%，與rtM204V在其它單NAs治療組占總變異位點(diǎn)數(shù)的11.1%比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.826，P=0.005）；與rtM204V在含LAM其聯(lián)合或序貫用藥組變異位點(diǎn)數(shù)的20.9%比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.213，P=0.04），見表4。

2.5.2 變異位點(diǎn)rtM204I rtM204I占單LAM治療組變異位點(diǎn)數(shù)的37.1%。與rtM204I在其它單NAs治療組占總變異位點(diǎn)數(shù)的19.4%比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.747，P=0.097；與rtM204I在含LAM聯(lián)合或序貫用藥組變異位點(diǎn)數(shù)的37.31%比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.0003，P=0.987），見表5。

2.5.3 變異位點(diǎn)rtA181V rtA181V占單ADV治療組變異位點(diǎn)數(shù)的57.9%。與rtA181V在其它單NAs治療組占總變異位點(diǎn)數(shù)的4.0%比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.68，P=0.000）；與rtA181在含ADV其聯(lián)合或序貫用藥組變異位點(diǎn)數(shù)的27.27%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.509，P=0.025），見表6。

2.5.4 變異位點(diǎn)rtN236T rtN236T占單ADV治療組變異位點(diǎn)數(shù)的31.58%，與rtA181V在其它單NAs治療組變異位點(diǎn)數(shù)為0比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.087，P=0.002）；與rtN236T在含ADV其聯(lián)合或序貫用藥組變異位點(diǎn)數(shù)的7.8%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.210，P=0.023），見表7。

2.5.5 NAs單藥與多藥治療CHB患者變異位點(diǎn)構(gòu)成比較單NAs治療組比較多NAs聯(lián)合或序貫治療組各變異位點(diǎn)構(gòu)成比比較（χ2=2.49，P=6.646），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單藥治療和多藥治療各變異位點(diǎn)構(gòu)成比總體沒有差別，見表8。

表4 不同NAs治療CHB療效不佳患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtM204V變異情況的比較

表5 不同NAs治療CHB療效不佳患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtM204I變異情況的比較

表6 不同NAs治療CHB療效不佳患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtA181V變異情況

表7 不同NAs治療CHB療效不佳患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)rtN236T變異情況

表8 單藥與多藥治療變異位點(diǎn)構(gòu)成比較

2.6 主要耐藥相關(guān)變異模式與分布檢出11種變異位點(diǎn)組合模式，按檢出頻次由多到少排列分別為：16例rtL180M+rtM204I、12例rtM204V、9例rtM204I+rtM204V、8例rtA181V+rtM204V、7例rtM204I、7例rtA181V+rtN236T、6例rtA181V+ rtM204I、5例rtL180M、4例rtL180M+rtM204I+ rtA181V。3例rtM204V+rtM204I+rtN236T、3例rtA181V。變異模式詳見圖2。

2.7 NAs治療CHB患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥變異相關(guān)因素分析

2.7.1 耐藥變異與用藥時(shí)長的關(guān)聯(lián)性單NAs治療檢出耐藥相關(guān)變異病例（單藥治療耐藥變異＋組）的用藥時(shí)間長于未檢出NAs耐藥相關(guān)變異病例（單藥治療耐藥變異-組）（P＜0.01），提示，用藥時(shí)間越長，耐藥相關(guān)變異發(fā)生率越高；多藥治療檢出耐藥變異病例（多藥治療耐藥變異+組）的用藥時(shí)間長于單藥治療檢出耐藥變異病例（單藥治療耐藥變異+組）（P＜0.01），提示單藥治療比多藥聯(lián)合更易發(fā)生耐藥變異。見表9。

圖2 主要的主要耐藥相關(guān)變異模式的分布

2.7.2 耐藥變異與用藥方式的關(guān)聯(lián)性本研究NAs治療CHB療效不佳患者中，單藥治療的病例耐藥變異檢出率為59.15%，而多藥治療病例耐藥變異檢出率為97.2%，兩種用藥方式療效不佳的患者耐藥變異病例檢出率差異顯著（χ2=17.157，P＜0.01），見表10。

2.7.3 耐藥變異與患者攜帶HBeAg的關(guān)聯(lián)性HBeAg陰性組病例與HBeAg陽性組病例耐藥變異檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.233，P＞0.05），見表10。

2.7.4 耐藥變異與NAs治療后病毒學(xué)反應(yīng)NAs治療CHB療效不佳患者中，應(yīng)答不佳組耐藥變異檢出率（70.59%）明顯低于病毒學(xué)突破組（95.65%）（χ2=8.85，P＜0.01），見表10。

2.7.5 耐藥變異與HBV DNA水平的關(guān)聯(lián)性NAs治療組在檢測(cè)耐藥變異位點(diǎn)的同時(shí)，有81個(gè)病例檢測(cè)了HBV-DNA水平，將HBV DNA劃分為三個(gè)等級(jí)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)等級(jí)區(qū)間耐藥變異的檢出例數(shù)并進(jìn)行構(gòu)成比的比較（χ2=9.455，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即HBV DNA水平越高，耐藥變異檢出率越高，見表10。

表9 耐藥變異與用藥時(shí)長的關(guān)聯(lián)性

表10 各種因素下檢出耐藥變異的比較

3 討論

3.1 乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的自然變異與耐藥HBV是最容易變異性的病毒之一，基因變異如果發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)且影響編碼HBV DNA聚合酶就可以導(dǎo)致對(duì)核苷（酸）類似物的耐藥[23]。本研究對(duì)照組未使用NAs治療的34例中，有2例檢出了耐藥相關(guān)變異，檢出率5.9%，2個(gè)變異位點(diǎn)為rtM204V和rtN236T；rtM204V是LAM耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)，rtN236T是ADV耐藥相關(guān)位變異位點(diǎn)。這說明乙肝病毒自然變異可導(dǎo)致較高的NAs耐藥，在使用NAs藥物之前檢測(cè)NAs藥物相關(guān)變異位點(diǎn)可以指導(dǎo)臨床選擇NAs用藥[24]。有專家提出需要實(shí)現(xiàn)有效的耐藥管理，把耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)置于用藥之前也就是監(jiān)測(cè)自然耐藥變異。

3.2 乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)主要變異位點(diǎn)和變異模式的分布LAM治療病例主要的變異位點(diǎn)是rtM204I、rtM204V，也檢出了rtL180M和rtA181V；rtM204V占LAM治療病例的變異位點(diǎn)總數(shù)的40%，高于其他用藥方式病例的檢出率；rtM204I占LAM治療病變異位點(diǎn)總數(shù)的37.1%，但與其他用藥方式的檢出率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，這兩個(gè)位點(diǎn)都是最重要的LAM耐藥相關(guān)的變異位點(diǎn)[25，26]，本研究分析單LAM治療組與其它單NAs治療組、LAM+其它單NAs治療組比較rtM204I的檢出率沒有差別，說明rtM204I可能是出現(xiàn)頻率較高的交叉耐藥位點(diǎn)；而單LAM治療組rtM204V的檢出率高于其它單NAs治療組和LAM+其它單NAs治療組下，說明rtM204V主要是LAM的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)[27]。

ADV治療病例主要的變異位點(diǎn)是rtA181V、rtN236T，兩位點(diǎn)分別占單ADV治療組變異位點(diǎn)數(shù)的57.9%、31.58%，本研究分析單ADV治療組rtA181V、rtN236T的檢出率顯著高于其它單NAs治療組和ADV+其它單NAs治療組，說明rtA181V、rtN236T是ADV主要耐藥相關(guān)位點(diǎn)[25，27]，檢出ADV耐藥變異模式主要為rtA181V+rtN236T[26]。ETV治療病例檢出rtM204I、rtL180M，有報(bào)道表明要對(duì)ETV耐藥，需要rtM204I+rtL180M位點(diǎn)變異，還需要合并rtT184G/S/A等位點(diǎn)同時(shí)變異[25]，本研究中未檢測(cè)rtT184G/S/A變異的位點(diǎn)，推測(cè)rtM204I、rtL180M應(yīng)該是LAM與ETV耐藥相關(guān)變異的交叉位點(diǎn)[28，29]。針對(duì)多NAs耐藥變異的組合模式更為復(fù)雜，本研究中簡單總結(jié)了耐藥模式，多藥治療效果不佳組的主要變異模式rtL180M+ rtM204I、rtA181V+rtM204V、rtA181V+rtM204I，這與相關(guān)報(bào)道對(duì)LAM和ADV耐藥檢出rtL180M+ rtA181V+rtM204V變異模式有一致性[30]。

本研究中單藥治療病例與多藥治療病例在耐藥變異位點(diǎn)的構(gòu)成上沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，可能與多藥治療組所用藥物一般包含單藥組用藥有關(guān)；多藥治療如果是序貫治療那么可能導(dǎo)致的耐藥變異將包含所有用過藥物的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)[31]，聯(lián)合用藥可以提高基因屏障[28]，減少耐藥變異的產(chǎn)生。另外本研究的樣本量不夠大、檢測(cè)的變異位點(diǎn)有限，對(duì)單藥治療和多藥治療患者耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)的構(gòu)成比也有一定的影響。

3.3 耐藥變異的相關(guān)因素應(yīng)用NAs藥治療慢性乙型肝炎時(shí)，藥物的選擇（如選用單藥的種類、幾種NAs藥物聯(lián)合或序貫用藥的選擇），用藥劑量與方法，治療時(shí)間長短，患者本身的HBV DNA水平和攜帶乙肝標(biāo)記物情況等對(duì)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)發(fā)生耐藥變異均可能產(chǎn)生重要影響。

本研究觀察單NAs治療檢出變異組用藥時(shí)間明顯長于未檢出變異組，說明運(yùn)用NAs藥物治療CHB會(huì)對(duì)病毒產(chǎn)生選擇性壓力，治療時(shí)間越長出現(xiàn)耐藥變異的變異株被篩選出來的幾率就越大[32，33]；而單藥治療病例早于多藥治療病例檢出耐藥相關(guān)位點(diǎn)可推測(cè)單藥治療可能比多藥治療更容易導(dǎo)致耐藥變異的產(chǎn)生，而多藥聯(lián)合可以提高基因屏障[28]。但本研究中多藥物治療耐藥變異的檢出率卻明顯高于單藥治療，看起來與基因屏障理論相矛盾，可能是因本研究中多藥治療中采用聯(lián)合用藥的病例少而采用序貫用藥的病例多，序貫用藥是在對(duì)前者藥物產(chǎn)生耐藥變異而失去抗病毒藥效再改變藥物種類，后種藥物又可引起新的變異，前后變異疊加因而使得變異檢出率反而更高。比較HBeAg陰性和陽性組耐藥變異檢出情況，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在HBV-DNA水平分等級(jí)比較耐藥變異檢出情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，研究病例HBV-DNA水平等級(jí)越高，耐藥變異檢出率也越高。這與國內(nèi)多位學(xué)者的研究結(jié)果一致[34，35]，說明在使用NAs治療CHB時(shí)，如果不能有效抑制病毒復(fù)制，病毒復(fù)制仍然處于較高的水平，NAs治療反而有利于耐藥變異的產(chǎn)生。

3.4 NAs治療CHB效果NAs抗乙肝病毒治療口服給藥方法簡單且價(jià)格經(jīng)濟(jì)，目前在臨床廣泛應(yīng)用[36]，但隨之而來的就是對(duì)NAs耐藥率的提高[37，38]。NAs抗病毒用藥時(shí)間的延長，使得耐藥變異增加最終導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[39，40]。用藥方法是影響NAs治療效果重要因素，單用LAM治療后，往往有著很高的耐藥突變率[41]，且常出現(xiàn)與LAM耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)rtM204I、rtM204V，rtL180M和rtA181V，如出rtL180M+rtM204I、rtA181V也可導(dǎo)致對(duì)ADV耐藥[42]，rtL180M也是LAM和ETV的交叉耐藥位點(diǎn)。所以開始抗病毒治療時(shí)就要選擇合適的藥物，新版防治指南建議初次使用ETV或者替諾福韋酯[22]，另一方面聯(lián)合用藥可以提高基因屏障從而降低耐藥變異的產(chǎn)生。再者在使用NAs抗乙肝病毒治療時(shí)，迅速有效降低HBV-DNA水平很重要，如果短時(shí)間內(nèi)藥物能有效抑制病毒復(fù)制，那么依賴較高基因復(fù)制水平的變異就難以產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答不佳和病毒學(xué)突破病例耐藥變異檢出率非常高，說明在治療過程中，必須監(jiān)測(cè)重要的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)和HBV DNA水平等相關(guān)指標(biāo)，一旦患者檢出耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)且病毒學(xué)應(yīng)答不佳或病毒學(xué)突破，則需要更換NAs進(jìn)行挽救性治療，如不及時(shí)進(jìn)行挽救性治療，可產(chǎn)生嚴(yán)重的后果包括肝功能失代償、急性肝功能衰竭甚至死亡[43]。

4 結(jié)論

4.1 NAs治療慢性乙型肝炎可導(dǎo)致HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異，NAs抗乙型肝炎病毒效果不佳與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異密切相關(guān)，即HBV耐藥變異是NAs抗病毒治療效果不佳甚至失敗的主要原因。

4.2 不同NAs藥物導(dǎo)致慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)變異位點(diǎn)、變異模式特點(diǎn)不同：⑴LAM常見耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)為rtM204I、rtM204V、rtL180M，變異模式多為rtM204V、rtM204I+rtM204V、rtM204I+rtL180M。⑵ADV常見耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)為rtA181V、rtN236T，變異模式多為rtA181V+ rtN236T。

4.3 NAs治療CHB用藥種類與方式，治療時(shí)長，患者HBV-DNA水平等對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)發(fā)生耐藥變異均可能產(chǎn)生重要影響。一般單藥治療出現(xiàn)耐藥變異早于多藥治療；治療時(shí)間越長出現(xiàn)耐藥變異的變異株被篩選出來的幾率越大；患者HBVDNA水平等級(jí)越高，耐藥變異檢出率越高。

4.4 本研究的臨床建議在使用NAs抗乙肝病毒治療前，應(yīng)檢測(cè)常見的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn)，從而選擇正確的藥物，盡量減少耐藥變異的產(chǎn)生，保護(hù)敏感的變異位點(diǎn)。在治療中，選擇合適的時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)重要的變異位點(diǎn)和HBV-DNA水平，特別是開始治療后的早期評(píng)價(jià)病毒學(xué)反應(yīng)，看藥物的治療效果，如果出現(xiàn)耐藥變異或者早期治療病毒學(xué)應(yīng)答不佳應(yīng)及時(shí)調(diào)整挽救性用藥方案，避免病情的反復(fù)和惡化。長期使用NAs應(yīng)該堅(jiān)持監(jiān)測(cè)變異位點(diǎn)和HBV-DNA水平[33]?？傊退幾儺愇稽c(diǎn)的檢測(cè)和用藥期間的監(jiān)測(cè)，可以指導(dǎo)臨床選擇和調(diào)整NAs藥物[34，35]，具有非常重要的臨床價(jià)值。

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Study on the Variation of HBV Reverse Transcriptase Gene Region in Patients with Chronic Hepatitis B Treated with Nucleoside Analogues

LI Jian1，2，ZENG Wenxing2，F(xiàn)ANG Yinghui2，ZENG Xiaoping1.1.Department of Immunology，Basic Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2.Clinical laboratory，The People's Hospital of Yichun City，Yichun Jiangxi 336000，China.

Objective To analyze the drug-resistant related mutation loci in HBV reverse transcriptase region，the combination mode of the mutation loci，the levels of HBV DNA and hepatitis Be antigen(HBeAg)in chronic HBV infected patients treated with NAs provides references for the anti-HBV therapy of NAs.Methods One hundred and forty-one patients with chronic HBV infection were selected in the study，of which the 107 cases with NAs treatment were set as the treatment group，and the rest 34 patients receiving no antiviral treatment were set as the control group.Drug-resistant related mutation loci in HBV reverse transcriptase region was determined by the reverse linear probe hybridization PCR(PCR-RLP).The level of HBV DNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.And immune markers of HBV were examined by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Finally，the characteristics of drug resistance-related mutations and the clinical data of the study cases were analyzed statistically.Results The detection rate of drug-resistant related mutation loci in the poor effective treatment group(82.5%)was significantly higher than that in the untreated control group(5.9%)and the effective group(0%)(P＜0.01).There were 97 cases

NAs showing the poor antiviral effect in the treatment group，of which 80 ones possessed 140 drug-resistant mutation loci. The major mutation sites included 45 rtM204I，32 rtM204V，10 rtN236T，25 rtL180M and 28 rtA181V.Main combination modes of the mutation loci were rtL180M+rtM204I，rtM204V，rtM204I+rtM204V，rtA181V+rtM204V，rtM204I and rtA181V+rtN236T，etc. Mutation detection rate in the 51 cases with poor NAs response was 70.59%，with 95.65%in the 46 virological breakthrough cases (P＜0.01).Mutation in those who received monotherapy was usually detected much earlier than that in multi-drug treated ones(P＜0. 01).The longer treatment time of NAs，the higher rate of drug-resistance mutation sites were detected(P＜0.01).The higher level ofHBV-DNA，the higher the detection rate of drug-resistance was detected(P＜0.01).Conclusions 1.NAs treatment of chronic hepatitis B can lead to mutations in HBV reverse transcriptase region，and NAs anti-hepatitis B virus ineffective is closely related to mutations in HBV reverse transcriptase region.2.Different NAs drugs result in different characteristics of mutation loci and combination modes of the mutation loci in HBV reverse transcriptase region of chronic hepatitis B patients.3.Selection of NAs，treatment time，the level of HBV-DNA in patients may all have an important impact to drug-resistance related mutations in HBV reverse transcriptase region.It is suggested that NAs drug resistance-related mutations and level of HBV-DNA in patients should be detected before treatment or be monitored during treatment，which can provide important references for clinical antiviral therapy of chronic hepatitis B.

∶Nucleoside analogues；Chronic hepatitis B；Drug resistance；Gene mutation in HBV reverse transcriptase region；Gene mutation

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)04-0466-09

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.005

2017-03-16；

2017-05-30)

李健，1983年生，學(xué)士學(xué)位，主管檢驗(yàn)師；南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室同等學(xué)歷申請(qǐng)碩士學(xué)位研究生；研究方向：乙肝病毒基因耐藥變異。

曾小平，1973年生，南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室副教授、碩士生導(dǎo)師。