脂氧素A4、腫瘤壞死因子及其比值與子癇前期發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

王 莉，丁依玲

(1.海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，海南 海口 570000；2.中南大學(xué)湘雅二院產(chǎn)科，湖南 長沙 410000)

脂氧素A4、腫瘤壞死因子及其比值與子癇前期發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

王 莉1，丁依玲2

(1.海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?570000；2.中南大學(xué)湘雅二院產(chǎn)科，湖南 長沙 410000)

目的 探討脂氧素A4(LXA4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)在子癇前期(PE)中的表達(dá)及意義。方法 選取2016年2月至2017年2月在海南省人民醫(yī)院分娩的PE產(chǎn)婦78例，其中輕度PE產(chǎn)婦45例，重度PE產(chǎn)婦33例，同時選取正常產(chǎn)婦50例作為對照組，采用ELISA法檢測產(chǎn)婦血清LXA4、TNF-α表達(dá)，采用免疫組化法檢測胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)。結(jié)果 輕度PE組和重度PE組胎盤組織中LXA4受體蛋白陽性表達(dá)率為55.55%、60.61%，明顯低于對照組(χ2值分別為19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-α蛋白陽性表達(dá)率為80.00%和81.82%，明顯高于對照組(χ2值分別為25.688、23.035，均P<0.05)。輕度PE組血清LXA4為(176.55±43.21)ng/L，明顯高于對照組和重度PE組(t值分別為12.163、10.476，均P<0.05)；輕度PE組和重度PE組TNF-α分別為(18.03±1.43)ng/mL和(18.22±2.03)ng/mL，明顯高于對照組(t值分別為48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE組LXA4/TNF-α為(5.02±1.10)，明顯低于對照組和輕度PE組(t值分別為25.271、16.106，均P<0.05)；輕度PE組LXA4/TNF-α為(9.80±1.42)，明顯低于對照組(t=16.970，P<0.05)。輕度PE組和重度PE組血清LXA4與TNF-α呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.522、-0.413，均P<0.05)；對照組和重度PE組胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs值分別為-0.344、-0.321，均P<0.05)；LXA4/TNF-α與PE患者病情呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.412，P<0.05)。結(jié)論 PE患者血清LXA4、TNF-α及胎盤組織LXA4受體、TNF-α表達(dá)異常，可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中LXA4/TNF-α比值可一定程度反映患者病情程度。

脂氧素A4；腫瘤壞死因子；子癇前期；相關(guān)性

子癇前期(preeclampsia，PE)的發(fā)生發(fā)展，特別是子癇的發(fā)生可以導(dǎo)致孕產(chǎn)婦病死率的上升，并促進(jìn)最終不良臨床結(jié)局的發(fā)生。有流行病學(xué)研究顯示PE的發(fā)病率可達(dá)0.6%～1.8%，在部分地區(qū)的人群中該病發(fā)病率更高[1]。在探討PE發(fā)病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞炎癥因子等生物學(xué)因子激活導(dǎo)致的氧化應(yīng)激障礙或者代謝性損傷等，均可以促進(jìn)PE患者的病情進(jìn)展。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor ，TNF-α)等，可以通過激活下游炎癥因子IL-6等的上調(diào)，促進(jìn)胎盤血管內(nèi)皮的損傷，加劇胎盤血管的螺旋化等重塑性障礙，導(dǎo)致血流動力學(xué)紊亂[2-4]。為了進(jìn)一步揭示LXA4、TNF-α在PE發(fā)病機(jī)制過程中的作用，本研究選取2016年2月至2017年2月在海南省人民醫(yī)院分娩的PE產(chǎn)婦78例，探討相關(guān)指標(biāo)在胎盤及血清中的異常表達(dá)，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年2月至2017年2月在海南省人民醫(yī)院分娩的PE產(chǎn)婦78例，其中輕度PE產(chǎn)婦45例(輕度PE組)，重度PE產(chǎn)婦33例(重度PE組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合謝幸等主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版)標(biāo)準(zhǔn)；②自愿提供胎盤組織；③單胎妊娠初產(chǎn)婦；④產(chǎn)婦及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并胎膜早破、前置胎盤等產(chǎn)科其他合并癥；②有糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、血液系統(tǒng)疾病等；③近1個月內(nèi)服用過抗炎藥物或免疫抑制類藥物。同時選取正常產(chǎn)婦50例作為對照組。對照組、輕度PE組和重度PE組產(chǎn)婦年齡、孕周、孕次等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

組別例數(shù)(n)年齡(歲)孕周(周)孕次(次)對照組5026.03±3.4138.21±2.061.24±0.41輕度PE組4525.94±2.8038.04±1.971.20±0.24重度PE組3326.06±3.0438.17±2.161.31±0.34F1.0672.0441.874P>0.05>0.05>0.05

1.2酶聯(lián)免疫吸附測定

采集兩組患者靜脈血用ELISA法檢測LXA4、TNF-α水平，采用低溫高速離心機(jī)進(jìn)行離心，1000r/min(離心半徑為15cm)，獲得血清后抽取50μL樣品加入96孔板內(nèi)，采用去離子水作為陰性對照，采用50μL緩沖液作為陽性對照，平衡搖晃20s混勻，室溫下孵育2h，采用磷酸鹽緩沖液(TBST)清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡搖晃30～45s，25℃室溫下孵育40min，加入250μL終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后以空白對照為基準(zhǔn)，采用分光光度計進(jìn)行讀數(shù)。LXA4、TNF-α抗體購自羅氏檢測公司，相關(guān)配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作。

1.3免疫組化檢測

采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3mm，3%H2O2室溫孵育5min，采用去離子水沖洗3次，每次3min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL純水)封閉，室溫孵育5min，加入LXA4受體和TNF-抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，加入溴甲酚紫指示劑，顯色5min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。所用Olipics電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.4結(jié)果判斷

采用Fromowitz綜合計分法，蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，計數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞比例計分，比例<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度為無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；總分=染色強(qiáng)度得分×細(xì)胞比例得分，>2分為陽性，≤2分為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)

輕度PE組和重度PE組胎盤組織中LXA4受體蛋白陽性表達(dá)率為55.55%和60.61%，明顯低于對照組(χ2值分別為19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-α蛋白陽性表達(dá)率為80.00%和81.82%，明顯高于對照組(χ2值分別為25.688、23.035，均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 各組胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-αin placenta[n(%)]

注：a與對照組比較P<0.05。

注：A和D為對照組LXA4受體和TNF-α表達(dá)；B和E為輕度PE組LXA4受體和TNF-α表達(dá)；C和F為重度PE組LXA4受體和TNF-α表達(dá)。

圖1 免疫組化圖

Fig.1Immunohistochemistryresults

2.2各組血清LXA4、TNF-α比較

輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組(t值分別為12.163、10.476，均P<0.05)；輕度PE組和重度PE組TNF-α明顯高于對照組(t值分別為48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE組LXA4/TNF-α明顯低于對照組和輕度PE組(t值分別為25.271、16.106，均P<0.05)；輕度PE組LXA4/TNF-α明顯低于對照組(t=16.970，P<0.05)，見表3。

2.3相關(guān)性分析

輕度PE組和重度PE組血清LXA4與TNF-α呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.522、-0.413，均P<0.05)，而對照組血清LXA4與TNF-α無相關(guān)性(P>0.05)。對照組和重度PE組胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs分別為-0.344、-0.321，均P<0.05)，而輕度PE組胎盤組織LXA4受體和TNF-α表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)；LXA4/TNF-α與PE患者病情呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.412，P<0.05)。

組別例數(shù)(n)LXA4(ng/L)TNF-α(ng/mL)LXA4/TNF-α對照組5090.30±24.165.22±1.1417.30±2.64輕度PE組45176.55±43.21ab18.03±1.43a9.80±1.42ab重度PE組3391.43±20.4418.22±2.03a5.02±1.10aF43.16420.04424.107P<0.05<0.05<0.05

注：a與對照組比較P<0.05；b與重度PE組比較P<0.05。

3討論

3.1子癇前期的背景相關(guān)研究

飲食習(xí)慣的改變、遺傳易感因素及高脂血癥等，均可以促進(jìn)子癇前期的發(fā)生發(fā)展，特別是在具有高血壓家族史的患者中，子癇前期的發(fā)病率可較普通對照人群上升3～4倍[5]。子癇前期的長期發(fā)展，可以導(dǎo)致孕產(chǎn)婦妊娠中晚期發(fā)生胎盤早剝、產(chǎn)后出血及產(chǎn)褥期并發(fā)癥的發(fā)生，臨床預(yù)后不佳。解痙、降壓、肝素抗凝等綜合性治療，雖然可以在一定程度上抑制病情的進(jìn)展，但治療的總有效率不足35%，患者的病情進(jìn)展率仍然可達(dá)40%以上。而對于子癇前期發(fā)病過程中的相關(guān)機(jī)制的探討，可以為疾病的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)，從而提高子癇前期的治療效果。

3.2LXA4及TNF-α的異常表達(dá)與PE發(fā)病的潛在關(guān)系

LXA4可以通過增加胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和蛻膜組織的退行性病變，進(jìn)而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生發(fā)展。特別是對于胎盤血管的螺旋化、弓狀血管的重塑等生理過程的影響，可以導(dǎo)致胎盤血管的血流灌注阻力的增加，促進(jìn)病情的進(jìn)展[6-7]。TNF-α作為細(xì)胞炎癥因子，其可以通過激活下游單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的上調(diào)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞對于胎盤組織的浸潤[8]，加劇了胎盤血管的螺旋化病理改變、促進(jìn)血流動力學(xué)障礙，血流呈現(xiàn)明顯的高阻力、低灌注表現(xiàn)，從而影響血壓波動[9-10]。已有研究探討了LXA4及TNF-α的異常表達(dá)，但多數(shù)研究局限于血清學(xué)資料的對比研究，缺乏對胎盤組織中相關(guān)蛋白水平的表達(dá)研究。

3.3LXA4及TNF-α的異常表達(dá)在促進(jìn)PE患者病情進(jìn)展過程中的作用

本研究發(fā)現(xiàn)，在胎盤組織中，LXA4受體的陽性表達(dá)水平較低，低于正常對照組人群，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示LXA4受體的異常表達(dá)可能促進(jìn)了子癇前期患者的病情進(jìn)展，LXA4受體數(shù)量或者敏感性的改變，可以通過影響胎盤組織的氧化應(yīng)激障礙、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等，進(jìn)而導(dǎo)致血壓的波動，促進(jìn)腎臟等多器官的損傷；在胎盤組織中，可發(fā)現(xiàn)TNF-α蛋白的陽性表達(dá)率較高，高于正常對照人群，TNF-α的高表達(dá)可以通過激活下游IL-6者IL-10等，加劇局部線粒體能量利用障礙，促進(jìn)胎盤微血管的損傷。王素梅等[11]和張俊農(nóng)[12]在探討重度子癇前期患者的發(fā)病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，TNF-α等的激活是促進(jìn)PE患者病情進(jìn)展的持續(xù)性核心因素，其中胎盤組織中TNF-α的表達(dá)陽性率可平均上升25%以上，患者的血壓控制效果越差、病情越嚴(yán)重，相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)越高。在探討血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的改變過程中發(fā)現(xiàn)，輕度PE組和重度PE組TNF-α明顯高于對照組，TNF-α在胎盤組織或者血清中均呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)趨勢[12]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)LXA4在血清中表現(xiàn)出同樣的低表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與LXA4的受體敏感性或正反饋調(diào)控障礙等有關(guān)，也可能與本研究的樣本量總量的不足有關(guān)。LXA4/TNF-α可以有效評估患者的病情，重度組患者的LXA4/TNF-α明顯低于輕度組，而輕度組LXA4/TNF-α也明顯低于對照組。相關(guān)關(guān)系分析也發(fā)現(xiàn)，LXA4與TNF-α具有密切的關(guān)系，同時LXA4/TNF-α與PE患者病情呈負(fù)相關(guān)，患者的病情越嚴(yán)重，LXA4/TNF-α的指標(biāo)越低。

3.4總結(jié)

本研究的創(chuàng)新性在于探討了LXA4受體水平的表達(dá)異常，同時揭示了胎盤組織中LXA4等因子的表達(dá)變化，相關(guān)關(guān)系分析也可以進(jìn)一步揭示不同炎癥因子的致病機(jī)制。綜上所述，PE患者血清LXA4和TNF-α，以及胎盤組織中LXA4受體和TNF-α表達(dá)異常，可能與子癇前期的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中LXA4/TNF-α比值可在一定程度上反映病情程度。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：馬良坤]

Relationship between LXA4, TNF- and LXA4/TNF- and development of PE

WANG Li1, DING Yi-ling2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Hainan Provincial People's Hospital, Hainan Haikou 570000, China; 2. Department of Obstetrics, The Second Xiangya Hospital of Central South University, Hunan Changsha 410000, China)

Objective To investigate the expression and significance of lipoxin A4 (LXA4) and tumor necrosis factor (TNF-) in preeclampsia (PE). Methods Totally 78 cases of PE delivering in Hainan Provincial People's Hospital during the period of February 2016 to February 2017 were selected, including 45 cases of mild PE (mild PE group) and 33 cases of severe PE (severe PE group). And 50 normal pregnant women were selected as control group. The expression of serum LXA4 and TNF- were detected by ELISA method, and immunohistochemistry was used to detect the placenta LXA4 receptor and TNF- expression.Results The positive expression rate of placenta LXA4 receptor in mild PE group and severe PE group was 55.55% and 60.61%, respectively, which was significantly lower than in the control group (χ2value was 19.077 and 14.246，respectively, bothP<0.05), while the positive expression rate of TNF- protein was 80.00% and 81.82%, respectively, which was significantly higher than in the control group (χ2value was 25.688 and 23.035，respectively, bothP<0.05). In mild PE group serum LXA4 was 176.55±43.21ng/L, which was significantly higher than in the control group and severe PE group (tvalue was 12.163 and 10.476，respectively, bothP<0.05). In mild PE group and severe PE group TNF- was 18.03±1.43ng/mL and 18.22±2.03ng/mL, which was significantly higher than in the control group (tvalue was 48.500 and 37.304，respectively, bothP<0.05). LXA4/TNF- in severe PE group was 5.02±1.10, and it was significantly lower than in the control group and mild PE group (tvalue was 25.271 and 16.106, respectively, bothP<0.05), while that in mild PE group was 9.80±1.42 and it was significantly lower than in the control group (t=16.970，P<0.05). In mild PE group and severe PE group serum LXA4 and TNF- were negatively correlated (rvalue was -0.522 and -0.413, respectively, bothP<0.05). Placenta LXA4 receptor was negatively correlated with TNF- in the control group and severe PE group (rsvalue was -0.344 and -0.321, respectively, bothP<0.05). LXA4/TNF-a was negatively correlated with PE patient condition (rs=-0.412,P<0.05). Conclusion The expressions of serum LXA4 and TNF- and placenta LXA4 receptor and TNF- of PE patients are abnormal, and they may be related to the occurrence and development of disease, in which LXA4/TNF- can reflect the degree of disease to some extent.

lipoxin A4 (LXA4); tumor necrosis factor (TNF-); preeclampsia (PE); correlation

2017-04-11

王 莉(1978-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事高危妊娠的研究。

丁依玲，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.006

R714.2

A

1673-5293(2017)07-0768-03