馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選鑒定及生長條件研究

馬龍，楊莉莉，馬興，賈蕊鴻，董星辰，邱慧珍*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅蘭州730070；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西楊陵712100）

病蟲防治

馬鈴薯黑痣病生防菌的篩選鑒定及生長條件研究

馬龍1，楊莉莉2，馬興1，賈蕊鴻1，董星辰1，邱慧珍1*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅蘭州730070；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西楊陵712100）

采用稀釋平板法，從馬鈴薯根際土壤中篩選到1株對馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有良好拮抗效果的生防菌株QHZ-M1，抑菌率達到59.8%；通過生理生化和16S rDNA鑒定，QHZ-M1與芽孢桿菌屬（Bacillus）同源性高達99%，且與B.axarquiensis CR-119親緣關(guān)系最近，由此將其鑒定為芽孢桿菌Bacillus axarquiensis。對其生長條件進行了研究，結(jié)果表明，菌株QHZ-M1的生長速率較快，接種20 h后就進入穩(wěn)定期，其生長最適溫度為37℃，最適pH 8，最適鹽度＜25 g/L，最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母浸粉。QHZ-M1對馬鈴薯黑痣病具有較好的防治效果，具有作為生防制劑的潛力。

馬鈴薯；黑痣病；拮抗菌；芽孢桿菌

馬鈴薯糧菜兼用，營養(yǎng)全面，適應(yīng)性廣，是繼玉米、小麥和水稻之后的世界第四大糧食作物[1]。統(tǒng)計資料顯示，2014年中國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量分別達到564.50萬hm2和9 608萬t，近50年分別增加了4.33和7.44倍[2]。馬鈴薯種植業(yè)已成為中國農(nóng)村收入來源和經(jīng)濟發(fā)展的一個重要支柱產(chǎn)業(yè)。近年來，隨著種植面積的增加，許多馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)由于無法實現(xiàn)輪作倒茬致使黑痣病的發(fā)生與危害日益嚴(yán)重，嚴(yán)重地塊的發(fā)病率可達到70%～80%，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]，使之成為制約中國馬鈴薯發(fā)展的主要因素之一。

馬鈴薯黑痣病又稱為立枯絲核菌病，是一種真菌性的土傳病害。目前，中國馬鈴薯黑痣病的最常用防治方法是播前藥劑處理和土壤消毒[5,6]，這一方法在一定程度上有效控制了土傳病害的發(fā)生。但是，多年來使用高毒農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌對農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性，因此，防治效果越來越差，同時帶來了一系列的環(huán)境污染；且農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的增加，將帶來食品安全問題[7]。因此，環(huán)境友好型的生物防治已成為當(dāng)今各類植物病害防治研究的重點[8]。

目前用生物防治方法防治植物病害已有很多研究，李衛(wèi)利等[9]篩選出1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和1株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）對黃瓜白粉病有很好的防治效果，王玲等[10]篩選出一株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）對于辣椒青枯病有很好的防治效果。目前，關(guān)于馬鈴薯黑痣病的防治報道較少，尤其是甘肅省。本研究從甘肅省白銀市連作馬鈴薯田植株周圍耕作層采集土樣，從中篩選出針對馬鈴薯黑痣病具有生防效果的菌株，旨在為甘肅白銀地區(qū)馬鈴薯黑痣病的生物防治提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集

采用隨機取樣法，每個小區(qū)選取5個點（發(fā)病植株旁邊的健康植株），采集馬鈴薯根際0～20 cm處土壤樣品，采樣時鏟去表土，將帶土植株取出，輕輕抖掉根系外圍土，再用毛刷輕刷粘附在根表面的土壤，混勻裝入自封袋中，編號，帶回實驗室，保存在-20℃冰箱中，用于拮抗微生物的分離篩選。

1.1.2 供試菌株

菌株QHZ-M1由本試驗分離獲得，立枯絲核菌由本實驗室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 2.5 g、牛肉膏3 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

1.2 細菌的分離純化

稱取土樣5 g，加入裝有45 mL無菌水的150 mL三角瓶中，加入玻璃球，30℃，180 r/min振蕩15 min。取上清液進行稀釋，取1.0×10-4，1.0×10-5和1.0× 10-6g/mL的上清液100 μL涂于細菌固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）上，每梯度重復(fù)3次，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后，篩選并挑取培養(yǎng)特征相異的單個菌落，純化培養(yǎng)后作為候選生防菌株。

1.3 拮抗菌的篩選

采用PDA平板對峙法，在平板中央點接立枯絲核菌菌餅，將已分離純化的菌株點接在距離立枯絲核菌菌餅2.5 cm處的4個點上，以只點接立枯絲核菌菌餅的作為對照，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。當(dāng)對照菌餅長滿整個培養(yǎng)皿，測定每個處理的菌落直徑，每處理4次重復(fù)。選取對立枯病病原菌有較強拮抗作用的拮抗菌株進行復(fù)篩，選擇抑制效果比較明顯的菌株[11]。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.4 拮抗菌株的鑒定

1.4.1 菌株的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征鑒定

參照《微生物學(xué)實驗》[12]的試驗方法，將所篩選的菌株接種于細菌培養(yǎng)基（LB）上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)26 h后挑去做革蘭氏染色，培養(yǎng)48 h后觀察菌落的形態(tài)。

1.4.2 拮抗菌的生理生化特征

根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]的方法，將篩選的菌株，接種到細菌液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，做生理生化的測定。

1.4.3 16S rDNA序列測定及分析

按照細菌基因組柱式提取試劑盒的方法，提取菌株的基因，以上述所有DNA按照比例稀釋至5 ng/μL作為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3'）和1492R（5'-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3'）對樣品16S rRNA基因進行擴增，引物由南京瑞真生物技術(shù)有限責(zé)任公司（Realgene Biotech，Nanjing，China）合成，按照說明書要求添加相應(yīng)的ddH2O將其配置成10 μmol/L的工作液。

PCR反應(yīng)的體系為50 μL，包含：25 μL TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye（TaKaRa，Dalian，China）、27F/1492R（10 μmol/L）引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 21 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；30 cycles（94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min）；72℃7 min；4℃Hold。每個樣品3次重復(fù)，同時做陰性對照，以確保試驗過程中不存在污染，測序結(jié)果在NCBI基因庫中進行BLAST比對，并利用MEGA5.1軟件構(gòu)成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2003作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計的分析采用SPSS 22統(tǒng)計軟件，不同處理間的差異顯著性檢驗采用Duncan's新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

通過對峙試驗獲得對馬鈴薯黑痣病病原菌生長有強烈抑制作用的細菌4株（表1），對峙培養(yǎng)3 d抑菌率分別為59.8%、51.0%、46.6%和44.5%。其中QHZ-M1抑菌效果最佳，對立枯絲核菌的抑菌帶寬度達到5.22 mm，抑菌圈半徑＞2.5 cm，抑菌率達到59.8%（圖1）。表明，菌株QHZ-M1對馬鈴薯立枯絲核菌有很好的防治效果。

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 拮抗菌的形態(tài)特征及生理生化測定

QHZ-M1在細菌培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)2 d即可出現(xiàn)明顯的菌落，其菌落呈球形、橢球形或不規(guī)則形，菌落不透明，乳白色，革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀（圖2）。

表1 對峙培養(yǎng)3 d后菌株QHZ-M1對立枯絲核菌的抑制率Table 1 Strain QHZ-M1 inhibition on Rhizoctonia solani growth after three days of confrontation training

圖1 菌株QHZ-M1對立枯絲核菌生長的影響（3 d）Figure 1 Effect of strain QHZ-M1 on Rhizoctonia solani growth

對QHZ-M1生理生化特征進行測定，其結(jié)果為葡萄糖為發(fā)酵型，丙二酸鹽、檸檬酸鹽利用為陽性，V-P試驗、接觸酶反應(yīng)、產(chǎn)氨試驗、硫化氫產(chǎn)生均為陽性，可以水解淀粉、明膠、色氨酸、酪氨酸，能夠產(chǎn)生吲哚，苯丙氨酸水解、酒石酸鹽水解、M-P試驗均為陰性（表2）。通過自動檢索數(shù)據(jù)庫對測定結(jié)果進行鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬。

圖2 菌株QHZ-M1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Figure 2 Morphological identification results of strain QHZ-M1

表2 菌株QHZ-M1生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical property results of strain QHZ-M1

2.2.2 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

PCR反應(yīng)完成后，采用1.8%瓊脂糖凝膠，0.5× TAE緩沖液條件下電泳檢測，Marker選用DL 5 000（TaKaRa，Dalian，China）。QHZ-M1的電泳條帶如圖3，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進行測序，得到QHZ-M1的16S rDNA的序列長度為1 411 bp，把菌株QHZ-M1的16S rDNA進行BLAST比對，選擇同源性不低于99%的序列，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明，QHZ-M1與芽孢桿菌屬同源性高達99%，與B.axarquiensis CR-119親緣關(guān)系最近，結(jié)合生理生化測定結(jié)果，初步確定QHZ-M1為芽孢桿菌B.axarquiensis。

2.3 菌株QHZ-M1生長特性

2.3.1 QHZ-M1的生長特征曲線

由圖5可以看出QHZ-M1菌株生長迅速，接種到LB培養(yǎng)基后，很快進入對數(shù)期，在20 h后進入穩(wěn)定期，說明該菌株生長迅速。

2.3.2 QHZ-M1的生長條件研究

從表3中可以看出，菌株QHZ-M1在pH 8時菌株生產(chǎn)量高于其他pH處理；溫度在37℃時菌株的生長量顯著高于其他溫度處理；鹽分含量在0～25 g/ L時菌株生長量顯著高于鹽分＞25 g/L的處理；氮源

是蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏的菌株生長量顯著高于其他氮源處理；碳源是蔗糖的菌株的生長量顯著高于其他碳源處理。因此，菌株生長的最適pH 8；最適溫度是37℃；最適鹽度是0～25 g/L；最適碳源和氮源分別為蔗糖和酵母浸粉。

圖3 QHZ-M1 PCR產(chǎn)物的電泳Figure 3 PCR product electrophoretogram of strain QHZ-M1

圖4 QHZ-M1的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of strain QHZ-M1

表3 QHZ-M1生長條件Table 3 Growth conditions of strain QHZ-M1

圖5 QHZ-M1生長曲線Figure 5 Growth curve of strain QHZ-M1

3 討論

利用微生物代謝產(chǎn)物和有益微生物是防治作物病害的有效防治技術(shù)和方法[14]。耕作層及植物根際土壤中具有豐富的微生物類群，土壤中不缺乏有益拮抗微生物資源。目前，植物病害的生物防治主要集中在芽胞桿菌類群，枯草芽胞桿菌（B.subtilis）、蠟狀芽胞桿菌（B.cereus）、短小芽胞桿菌（B. pumilus）、多粘芽胞桿菌（B.polymyxa）等幾個種[15]。Zhang等[16]報道，枯草芽孢桿菌B.subtilis N11可以有效防治香蕉枯萎病的發(fā)生，Cao等[17]研究表明，枯草芽孢桿菌B.subtilis SQR 9可在作物根際定植，可很好的抑制香蕉枯萎病的發(fā)生，發(fā)病幾率降低了49%～61%。孫淑琴等[18]篩選出一株菌株Bs-18，后經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，該菌株對于黃瓜白粉病有良好的防治效果，盆栽防治效率可達到82.22%。

本試驗篩選出了1株對于馬鈴薯黑痣病有拮抗效果相對最好的菌株QHZ-M1，鑒定為芽孢桿菌（B.axarquiensis），目前關(guān)于芽孢桿菌（Bacillus axarquiensis）的報道較少。2012年謝永麗等[19]分離得到的菌株中有1株是芽孢桿菌，該菌對于油菜菌核病病原真菌具有顯著的拮抗效果。楊成德等[20]篩選得到1株芽孢桿菌菌株，對馬鈴薯枯萎病的抑菌率達52.21%；曾紅和楊生強[21]篩選出的芽孢桿菌菌株，對棉花黃萎病病原菌具有較強抑菌活性，抑菌率可達到78.62%。因此，芽孢桿菌（B.axarquiensis）可作為優(yōu)秀的生物防治菌。

本試驗從馬鈴薯根際土壤中篩選得到1株QHZ-M1，對于馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌有良好的拮抗效果，抑菌率達到59.8%。通過生理生化和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，菌株QHZ-M1為芽孢桿菌（B.axarquiensis）。通過對其生長條件的研究，菌株QHZ-M1的生長速度較快，在接種20 h以后就進入穩(wěn)定期，生長的最適溫度是37℃，最適pH 8，最適鹽度是0～25 g/L，最適碳源和氮源分別是蔗糖和酵母浸粉。菌株生長的最適條件跟土壤環(huán)境條件相近。菌株QHZ-M1適應(yīng)的溫度、pH和耐鹽度范圍較廣；可利用的碳源和氮源比較廣泛。因此菌株QHZ-M1具有馬鈴薯黑痣病生物防治的潛力。

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新書書訊

由中國農(nóng)業(yè)出版社出版，金光輝、王騰、呂文河撰寫的《黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)及抗病種質(zhì)資源研究》一書于2016年11月正式出版發(fā)行，該書針對黑龍江省馬鈴薯晚疫病發(fā)生發(fā)病規(guī)律，明確菌群群體遺傳結(jié)構(gòu)，以抗源鑒定研究為重點，利用有效的抗源篩選方法鑒定出重要的馬鈴薯晚疫病抗源。該書是我國馬鈴薯晚疫病研究方面比較全面深入的專著，值得馬鈴薯研究者和生產(chǎn)者擁有和珍藏。每本定價：45元（包括郵費）。

有需購者請聯(lián)系微信號：tudou772480099，其微信名：馬鈴薯書籍。

Isolation,Identification and Growth Condition of Antagonistic Strains Against Potato Black Scurf

MA Long1,YANG Lili2,MA Xing1,JIA Ruihong1,DONG Xingchen1,QIU Huizhen1＊
(1.College of Resources and Environment,Gansu Agricultural University/Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science, Lanzhou,Gansu 730070,China;2.College of Resources and Environment,Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling,Shaanxi,712100,China)

A bio-control strain(QHZ-M1)with good antagonistic activity against Rhizoctonia solani of potato black scurf pathogenic bacteria was filtrated from potato rhizosphere soil by plate dilution method.Its inhibition percentage reached 59.8%.Based on the physiological and biochemical characteristics,and 16s rDNA identification,QHZ-M1 had 99% homology with Bacillus and had a close relationship with B.axarquiensis CR-119.Thus,it was identified as B.axarquiensis. Growth conditions of QHZ-M1 were studied and the results showed that the strain growth rate was relatively fast,and reached a stable period after 20 h.The optimal temperature for the growth was 37℃,the optimal pH was 8,the optimal salinity was＜25 g/L,and the optimal carbon and nitrogen source was sucrose and yeast extract powder,respectively. QHZ-M1 has good control effect on potato black scurf disease and potential as bio-control agent.

potato;black scurf;antagonistic bacterium;Bacillus axarquiensis

S532

A

1672－3635（2017）04-0227-07

2016-03-31

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2015CB150501）；國家自然科學(xué)基金（31360500）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103004）；白銀市白銀區(qū)科技計劃項目（2014-5N）。

馬龍（1989-），男，碩士研究生，研究方向為逆境脅迫與植物營養(yǎng)。

邱慧珍，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物營養(yǎng)與營養(yǎng)生態(tài)的教學(xué)與科研工作，E-mail:hzqiu＠gsau.edu.cn。