泛素活化酶、端粒酶檢測在冠心病心力衰竭患者中的應用價值

崔秀琴，張勱

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泛素活化酶、端粒酶檢測在冠心病心力衰竭患者中的應用價值

崔秀琴1，張勱1

目的 分析冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┬牧λソ呋颊邫z測胸腹水細胞中泛素活化酶（UBE1）、端粒酶的應用價值。方法 選取2013年1月～2016年1月于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗科保存的57例胸腹水標本，其中30例為冠心病心力衰竭，15例為冠心?。ǚ切牧λソ?，死因為顱腦外傷或機械性損傷），12例正常對照（無心臟病史、無心臟器質(zhì)性病變、死因為顱腦外傷或機械性損傷）。免疫組化染色檢測各組UBE1和端粒酶表達情況。結(jié)果 心力衰竭組UBE1免疫組化染色陽性和強陽性比例明顯高于冠心病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與冠心病組和正常對照組比較，心力衰竭組端粒酶免疫組化染色陽性和強陽性比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。心力衰竭組UBE1和端粒酶IOD值分別為1201.14（943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～13 519.31），明顯高于冠心病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結(jié)論 冠心病心力衰竭患者胸腹水細胞中泛素活化酶、端粒酶表達明顯增強，二者在冠心病心力衰竭診斷中有潛在的應用價值。

泛素活化酶E1；端粒酶；心力衰竭；冠心病

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦怯晒跔顒用}粥樣硬化引起，動脈逐漸狹窄導致心臟缺氧和心肌功能障礙。糖尿病、高血壓、肥胖等都是該病的誘發(fā)因素，另外，冠心病的發(fā)作還與大量吸煙和飲酒，情緒激動、飽食、體力活動增加等有關(guān)。冠心病治療不當會發(fā)展成心力衰竭。目前臨床常用的心肌損傷標志物主要有心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶、腦鈉肽等，但均存在一定局限性。因此，尋找能夠早期診斷冠心病心力衰竭的生物學指標具有重要意義。研究表明[1,2]，泛素活化酶（UBE1）是廣泛存在于胸腹水細胞中的一種蛋白酶，在心力衰竭的早期即被激活，參與胸腹水細胞蛋白質(zhì)的降解過程，導致胸腹水細胞壞死。端粒酶由催化蛋白與RNA組成，也廣泛存在于胸腹水細胞中，其活性與細胞增殖及程序性死亡密切相關(guān)[3]。本研究選擇UBE1與端粒酶，觀察其在冠心病心力衰竭患者胸腹水中的表達變化，以探討其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 選取標本 選取2013年1月～2016年1月于新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗科保存的57例胸腹水標本，其中30例為冠心病心力衰竭，15例冠心?。ǚ切牧λソ?，死因為顱腦外傷或機械性損傷），12例正常對照（無心臟病史，無心臟器質(zhì)性病變，死因為顱腦外傷或機械性損傷）。

1.2 免疫組化檢測UBE1和端粒酶表達 將標本制成4 μ m的石蠟切片，置于67℃的烘箱中，脫蠟置水。高壓修復抗原后冷卻至室溫，3%H2O2處理10 min。PBS沖洗3次，每次5 min，加入相應稀釋倍數(shù)的一抗（分別用淋巴瘤和乳腺癌陽性片做梯度實驗，根據(jù)結(jié)果找出最佳稀釋濃度），放入4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加聚合物增強劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加酶標二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗4次，每次5 min。DAB鏡檢顯色35 min，自來水沖洗終止顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。UBEI以淋巴瘤陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照；端粒酶用乳腺癌陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。UBEI抗體購自百奇生物科技公司，端粒酶抗體購自北京中山生物公司，二步法試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 判斷標準 由2名檢驗科技師采用雙盲法隨機選取5個視野，對UBE1和端粒酶的表達進行評分，參照Axiotis標準[4]，陽性細胞數(shù)＜10%或染色強度不著色為0分，陽性細胞數(shù)在10%～30%或染色強度為淡黃色為1分，陽性細胞數(shù)在31%～70%或染色強度為黃色為2分，陽性細胞數(shù)超過70%或染色強度為棕黃色為3分?？偡?陽性細胞計數(shù)+染色強度得分，陰性為0～1分，弱陽性為2分，陽性為3～4分，強陽性為5～6分。圖像分析：用Olympus顯微鏡觀察各組切片，選出陽性反應區(qū)，隨機選5個視野，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對累積光密度（IOD）進行測量，減去IOD背景，剩余值即可反映選定區(qū)域蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件，偏態(tài)分布資料采用M（Q1～Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)/百分比表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE1在各組的表達比較 心力衰竭組UBE1陽性和強陽性比例明顯高于冠心病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表1）。

2.2 端粒酶在各組的表達比較 與冠心病組和正常對照組比較，心力衰竭組端粒酶陽性和強陽性比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表2）。

2.3 各組UBE 1和端粒酶IOD值比較 心力衰竭組UBE 1和端粒酶IOD值分別為1201.14 （943.19～1672.31）和12 643.81（11 231.07～ 13 519.31），明顯高于冠心病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（表3）。

3 討論

近年來有關(guān)心力衰竭早期診斷標記物的研究，主要有兩方面，一是胸腹水細胞內(nèi)蛋白的缺失，二是胸腹水細胞外成分在細胞內(nèi)的異常表達，但這些研究大部分來源于動物實驗，假陽性率較高[5]。急性心肌缺血可導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)迅速降解，造成細胞壞死。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是蛋白質(zhì)降解的重要方式，UBE1是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的關(guān)鍵因素，能夠與泛素相結(jié)合，從而激活級聯(lián)的反應，對蛋白質(zhì)的降解過程產(chǎn)生直接影響[6]。端粒酶能夠通過攜帶的RNA模板，合成端粒DNA添加至細胞染色體末端，填補DNA復制的缺陷，其活性水平的變化可影響細胞的增殖與死亡。大多數(shù)人體細胞端粒酶沒有活性或活性很低，而冠心病心力衰竭患者胸腹水細胞中卻高表達，提示其潛在的應用價值。我們推測UBE1與端粒酶可能參與胸腹水細胞的死亡過程，在冠心病心力衰竭中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，與冠心病組和正常對照組比較，心力衰竭組胸腹水細胞UBE1和端粒酶表達陽性和強陽性比例明顯升高，提示胸腹水UBEI和端粒酶表達水平的升高可能為早期冠心病心力衰竭的診斷提供可靠的依據(jù)。UBE1廣泛存在于胸腹水細胞中[7]，冠心病心力衰竭患者UBE1升高的機制可能為：①在心肌缺血的情況下，低氧誘導因子-1α表達增加，而泛素-蛋白酶體是其主要降解途徑，因此，相應上調(diào)[8]；②NF-κ B信號通路具有抑制細胞凋亡的作用，而泛素-蛋白酶體系統(tǒng)也參與激活NF-κ B的過程[9]。當心肌缺血導致細胞壞死時，UBE1表達水平上升，啟動泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，激活NF-κ B信號通路，抑制細胞進一步凋亡[10]。端粒酶在保持基因完整性與細胞增殖能力方面具有重要作用，我們推測，在冠心病心力衰竭初期存活的細胞開始自我修復進程，因此端粒酶被激活，促進血管內(nèi)皮細胞分裂和增殖，參與組織修復。因此，端粒酶水平升高可能是冠心病心力衰竭早期診斷的敏感指標。

表1 各組UBE1表達情況比較（n，%）

表2 各組端粒酶表達情況比較（n，%）

表3 各組UBE1和端粒酶IOD值比較

綜上所述，冠心病心力衰竭患者胸腹水細胞質(zhì)中UBE1、端粒酶表達明顯增強，提示二者均參與了冠心病心力衰竭過程，并在診斷中具有重要潛在價值。

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本文編輯：姚雪莉

Application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 and telomerase to heart failure of coronary heart disease

Cui Xiuqin*, Zhang Mai.*Department of Clinical Laboratories, First People's Hospital of Xinxiang City, Henan Province, Xinxiang 453000, China.

Objective To analyze the application values of detection of ubiquitin activating enzyme E1 (UBE1) and telomerase in pleural-peritoneal fluid cells in patients with heart failure of coronary heart disease (CHD). Methods The samples of pleural-peritoneal fluid from 57 patients saved in the Department of Clinical Laboratories of the First People’s Hospital of Xinxiang City were chosen from Jan. 2013 to Jan. 2016. All samples were divided into heart failure group (n=30) collected from the patients with grades from Ⅲ to Ⅳ coronary stenosis (excluding other death causes), CHD group (n=15) from the patients with grades from I to Ⅳ coronary stenosis (without heart failure, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury) and normal control group (n=12) from the patients without heart disease history and cardiac organic lesions, and death causes being craniocerebral trauma or mechanical injury. The expressions of UBE1 and telomerase were detected by using immunohistochemistry staining method in all groups. Results The percentages of UBE1 with positive and strongly positive immunohistochemistry staining were significantly higher in heart failure group than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). The percentages of telomerase with positive and strongly positive immunohistochemistry staining increased significantly in heart failure group compared with CHD group and normal control group (all P<0.05). The value of integral optical density (IOD) of UBE1 was 1201.14 (943.19～1672.31) and that of telomerase was 12 643.81 (11 231.07～13 519.31) in heart failure group, which were significantly higher than those in CHD group and normal control group (all P<0.05). Conclusion The expressions of UBE1 and telomerase increase significantly in pleural-peritoneal fluid cells in patients with CHD heart failure, and they have potential application values in diagnosis of CHD heart failure.

Ubiquitin activating enzyme E1; Telomerase; Heart failure; Coronary heart disease

R541.61

A

1674-4055(2017)07-0856-03

1453000 新鄉(xiāng),河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗科

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.27