RNA干擾血管內(nèi)皮生長因子受體2基因表達(dá)提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的研究

楊平++魏建昌++陳華翠++張通++曾山崎++曹杰

[摘要] 目的 研究RNA干擾血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）基因表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用和對奧沙利鉑的化療增敏作用。 方法 構(gòu)建靶向VEGFR-2基因的小分子干擾RNA（siRNA）表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480；通過RT-PCR和Western blot方法檢測VEGFR-2 siRNA對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480 VEGFR-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；采用MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測該siRNA及協(xié)同奧沙利鉑對細(xì)胞增殖及凋亡的影響。 結(jié)果 VEGFR-2 siRNA顯著下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞VEGFR-2 mRNA和蛋白的表達(dá)（P < 0.05）。VEGFR-2 siRNA協(xié)同奧沙利鉑使結(jié)腸癌細(xì)胞的生長變得更加緩慢，增殖受到明顯抑制，細(xì)胞抑制及凋亡明顯增強（P < 0.05）。 結(jié)論 RNA干擾VEGFR-2基因表達(dá)可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖，促進(jìn)其凋亡，并能提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；血管內(nèi)皮生長因子受體2；小分子干擾RNA；奧沙利鉑

[中圖分類號] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（b）-0016-04

Study on the sensitivity of colon cancer cells for Oxaliplatin enhanced by RNA interference in the expression of vascular endothelial growth factor receptor-2

YANG Ping WEI Jianchang CHEN Huacui ZHANG Tong ZENG Shanqi CAO Jie

Department of Gastrointestinal Surgery， Guangzhou First People's Hospital Guangzhou Digestive Diseases Center， Guangzhou First People's Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To study the inhibitory effect of RNA interference in the expression of vascular endothelial growth factor receptor-2 （VEGFR-2） for the growth of human colon cancer cells and the chemosensitive effect of Oxaliplatin. Methods The expression plasmid of small interferon RNA （siRNA） targeting VEGFR-2 gene was constructed and human colon cancer cell line SW480 was transfected. The effect of VEGFR-2 siRNA for the expression of human colon cancer cells SW480 VEGFR-2 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot. The effect of siRNA or combining with Oxaliplatin for the cell proliferation and apoptosis was detected by MTT assay and flow cytometry. Results The mRNA and protein expression of VEGFR-2 were significantly down-regulated by VEGFR-2 siRNA （P < 0.05）. The combination of VEGFR-2 siRNA and Oxaliplatin could slowdown the growth of colon cancer cells， inhibit the proliferation， and significantly increase the inhibition of cell proliferation and apoptosis （P < 0.05）. Conclusion Silencing VEGFR-2 gene by the siRNA technology can inhibit the proliferation of SW480 cells， induce the apoptosis of SW480 cell， and enhance the chemotherapy sensitivity of Oxaliplatin for human colon cancer cells.

[Key words] Colon cancer； Vascular endothelial growth factor receptor-2； Small interferon RNA； Oxaliplatin

我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]，化療是結(jié)直腸癌綜合治療的重要組成部分，奧沙利鉑是結(jié)直腸癌最常用的化療藥物之一，但腫瘤患者個體間對奧沙利鉑敏感性存在著很大的差異[2]。RNA干擾技術(shù)是通過設(shè)計小分子干擾RNA（siRNA）而沉默特定基因的表達(dá)，從而提高腫瘤的化療敏感性，在腫瘤耐藥的研究中取得了一定的成效[3-4]。最近的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR-2）所介導(dǎo)的信號級聯(lián)通路不僅可以通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、存活和通透性的改變來促進(jìn)血管的新生，還可通過增強腫瘤細(xì)胞的耐藥性來影響腫瘤的生物學(xué)行為[5-6]。本研究旨在探討干擾VEGFR-2基因表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

奧沙利鉑由江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)（批號H20000337）。SiRNA轉(zhuǎn)染試劑盒siPORT Lipid Transfection Reagent購自Ambion公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測盒購自Sigma公司，ImProm-Ⅱ Reverse Transcription System購自Promega公司。Annexin V-FITC apoptosis detection kit凋亡檢測盒和Cycle Test TTM Plus DNA Reagent Kit細(xì)胞周期檢測盒均購自美國BD公司。兔抗人VEGFR2多克隆抗體購自美國Abbiotec公司。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購自美國ATCC公司，單層的貼壁生長。

1.2 方法

1.2.1 VEGFR-2 siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 參照GenBank上的VEGFR-2序列（NM_002253.2），使用Ambion公司交互式軟件在線設(shè)計siRNA。BLAST分析，該siRNA片段與目的基因同源，無非特異的靶序列。采用隨機序列核酸（scramble）作為陰性對照，以鑒別非特異的基因抑制作用。所有siRNA由Ambion公司化學(xué)合成。VEGFR-2 siRNA序列的正義鏈：5'-AUUA？鄄CUUGCAGGGGACAGA-3'，反義鏈：5'-UAAUGAAC？鄄GUCCCCUGUCU-3'；psilencerTM質(zhì)粒載體由BamH1和HindⅢ雙酶切，與退火所得的雙鏈模板DNA連接后過夜。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，在含有氨芐的LB平板中進(jìn)行16 h的培養(yǎng)后，挑取其中的陽性克隆進(jìn)行細(xì)菌擴增，然后將質(zhì)粒提取純化。限制性內(nèi)切酶BamH1和HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定。確認(rèn)鑒定結(jié)果后，使用M13為正引物測序確認(rèn)序列，-20℃保存。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取2×105個SW480細(xì)胞，種于12孔板12 h后，用Opti-MEM1培養(yǎng)液洗滌1次，加入1 mL的無血清DMEM。按基因轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，靶向VEGFR-2 siRNA進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的為實驗組，采用隨機序列核酸scramble-siRNA作為陰性對照組，載體質(zhì)粒作為空白對照組。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，按1∶12的比例來稀釋細(xì)胞進(jìn)行傳代和培養(yǎng)。另48 h后，加入G418（400 mg/mL）來篩選陽性的克隆，收集細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.3 RT-PCR檢測VEGFR-2 mRNA表達(dá) 參照Trizol盒說明書行總RNA的抽提，后取5 μL RNA置于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，后用分光光度計測定RNA濃度以及純度，-70℃條件下保存。取2 μL總RNA，依照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用PCR體系：25 μL，94℃ 5 min，94℃變性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。VEGFR-2上游引物：5'-GGAACCTCACTATCCGCAGAGT-3′，下游引物：5'-CCA？鄄AGTTCGTCTTTTCCTGGGC-3，擴增產(chǎn)物長度為132 bp；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，引物上游為5'-TCACTGCCACCCAGAAGACT-3'，下游為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。取10 μL PCR產(chǎn)物電泳，紫外線照相后掃描。

1.2.4 Western blot方法確定VEGFR-2蛋白水平 提取細(xì)胞的總蛋白后，采用12%丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，10%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h。使用1∶100比例的山羊抗VEGFR-2多克隆抗體（購自美國Santa Cruz公司）為一抗，1∶1000比例的辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG為二抗。PVDF膜依次與一抗和二抗孵育2 h后，用發(fā)光試劑（ECL）顯影，膠片曝光。

1.2.5 MTT法分析奧沙利鉑敏感性 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，取1×105個細(xì)胞/孔的SW480細(xì)胞種于96孔板，分別加入0～5 μg/mL的奧沙利鉑溶液100 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用MTT法在490 nm波長處測定各組細(xì)胞吸光度值，以奧沙利鉑的藥物濃度為橫軸，細(xì)胞的存活率為縱軸，計算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.6 流式細(xì)胞儀分析 實驗干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，PBS液洗后70%冷乙醇固定重新收集，PBS液洗后加入RNA酶過夜，后加入碘化丙啶（PI）染液，流式細(xì)胞儀上機，使用488 nm波長。Modfit LT 2.0軟件來分析細(xì)胞周期及凋亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件來分析處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGFR-2 mRNA水平變化

轉(zhuǎn)染48 h后，陰性對照組及空白對照組VEGFR-2 mRNA呈較高的表達(dá)，分別為（0.78±0.14）、（0.82±0.18），而實驗組呈較低的表達(dá)（0.51±0.11），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖1）。

2.2 VEGFR-2蛋白表達(dá)的水平變化

轉(zhuǎn)染48 h后，VEGFR-2-siRNA組VEGFR-2蛋白表達(dá)量較陰性對照組及空白對照組明顯降低（P < 0.05）（圖2）。

VEGFR-2：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶

圖2 VEGFR-2蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3 干擾VEGFR-2表達(dá)對SW480細(xì)胞奧沙利鉑敏感性的影響

干擾VEGFR-2基因表達(dá)后，增加奧沙利鉑干預(yù)的濃度和時間，SW480細(xì)胞的抑制率有所上升。轉(zhuǎn)染48 h后，奧沙利鉑作用SW480細(xì)胞的IC50為1.98 μg/mL，空白對照組IC50為5.47 μg/mL，陰性對照組IC50為5.30 μg/mL。VEGFR-2 siRNA轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性提高了約3倍。見表1。

2.4 干擾VEGFR-2表達(dá)對SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率的影響

干擾VEGFR-2基因表達(dá)，以0.4 μg/mL濃度的奧沙利鉑干預(yù)48 h，流式結(jié)果示SW480細(xì)胞周期發(fā)生改變，實驗組G0/G1期的比例較空白對照組、陰性對照組顯著上升，G2/M期的比例較空白對照組、陰性對照組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。此外，實驗組的細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。表明干擾VEGFR-2表達(dá)后，SW480細(xì)胞出現(xiàn)S期障礙，G0/G1的停滯期細(xì)胞分布增多，細(xì)胞的凋亡率增加。見表2。

3 討論

VEGFR-2是一種Ⅲ型跨膜蛋白激酶，Terman等學(xué)者在1991年分離出來并報道[7]。人類VEGFR-2基因位于染色體4q11～q12，編碼1356個氨基酸。VEGFR-2在血管的形成中具有重要的作用，VEGFR-2信號通路促進(jìn)了一些新血管形成所需的內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)，如細(xì)胞增殖、遷移和存活[8-9]，其異常表達(dá)和活化能促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，并引起細(xì)胞化療耐藥的產(chǎn)生，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[10-11]。

目前結(jié)直腸癌的化療方案主要是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。奧沙利鉑是第三代的鉑類化合物，干擾DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，抑制和減少DNA合成，發(fā)揮細(xì)胞毒和抗腫瘤的作用。奧沙利鉑作為基礎(chǔ)藥物的FOLFOX、XELOX方案，是結(jié)直腸癌輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。但由于個體差異，結(jié)腸癌患者對該化療方案敏感性差異較大，其中腫瘤患者對奧沙利鉑的耐藥是化療失敗的重要原因[14-15]。

siRNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究[16-17]，利用siRNA使與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，從而提高結(jié)腸癌耐藥株的化療敏感性，對于提高結(jié)腸癌臨床療效具有重要指導(dǎo)意義，也可為結(jié)腸癌耐藥的逆轉(zhuǎn)提供新思路[18-19]。本研究構(gòu)建靶向VEGFR-2基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，通過MTT和流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，RNA干擾后奧沙利鉑抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用均要明顯高于對照組，這說明RNA干擾VEGFR-2基因表達(dá)能夠增強奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用和誘導(dǎo)及促進(jìn)凋亡發(fā)生的作用，從而進(jìn)一步抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和增殖。由此表明，VEGFR-2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)可能與奧沙利鉑化療耐藥有關(guān)，可能是VEGFR-2使奧沙利鉑等化療藥物不能通過核孔進(jìn)入胞核，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，影響腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[20-21]。

本研究結(jié)果顯示，RNA干擾VEGFR-2基因表達(dá)可以抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖，促進(jìn)其凋亡，并能提高結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，VEGFR-2可以成為提高奧沙利鉑療效及逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥的一個新靶點，但其中具體的作用機制仍有待進(jìn)一步的探索。

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（收稿日期：2017-03-23 本文編輯：張瑜杰）