紅菇多糖對(duì)小鼠肝臟衰老的抑制效果

魏 杰， 張 瀟， 張國(guó)坤， 萬冬梅， 林景峰， 孫淑華

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院， 遼寧 沈陽 110036； 2.遼寧仙人洞國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局， 遼寧 大連 116407)

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紅菇多糖對(duì)小鼠肝臟衰老的抑制效果

魏 杰1， 張 瀟1， 張國(guó)坤1， 萬冬梅1， 林景峰2， 孫淑華2

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院， 遼寧 沈陽 110036； 2.遼寧仙人洞國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局， 遼寧 大連 116407)

研究紅菇多糖對(duì)衰老昆明小鼠肝功能衰退的抑制作用。使用D -半乳糖建立衰老模型，并在此期間給予75 mg/L與150 mg/L紅菇多糖飲水。8周后斷頸處死，檢測(cè)肝指數(shù)、血清和肝組織的谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量，同時(shí)對(duì)肝組織Ca2+-ATPase活性及形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，8周內(nèi)給予紅菇多糖150 mg/L飲水時(shí)，小鼠肝指數(shù)、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性得到顯著提高，丙二醛含量顯著下降，小鼠肝功能衰退得到了顯著抑制(p<0.05)，肝臟的衰老及損傷也得到了有效抵制。

紅菇多糖； 肝臟； 抗衰老

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉柄紅菇：采自遼寧仙人洞自然保護(hù)區(qū)，選擇菌柄、傘蓋完整的粉柄紅菇。

超微量ATP酶(Ca2+-ATPase)測(cè)試盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH -Px)檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；D -半乳糖、體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇(分析純)，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S型電子精密天平，德國(guó)賽多利斯公司；DS- 1型高速組織搗碎機(jī)，無錫沃信儀器有限公司；UV- 2700型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；BCD- 218(KK22F66TI)型冰箱，德國(guó)西門子公司； CR- 22型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；SHZ- 82A型氣浴恒溫振蕩器，金壇市華城創(chuàng)威實(shí)驗(yàn)儀器廠； FE20型酸度計(jì)，梅特勒- 托利多公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅菇多糖的制備

將干燥的粉柄紅菇子實(shí)體用研磨機(jī)粉碎，過60目篩，得到粉柄紅菇干粉，稱取紅菇干粉100 g，加入500 mL圓底燒瓶中，按照液料比(mL/g)3∶1，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇在80 ℃恒溫水浴鍋中提取90 min，再抽濾去除雜質(zhì)，使用Sevage法去除蛋白，最后將濾渣放在干凈的不銹鋼托盤中，放入60 ℃烘箱中烘干備用，純度為81.3%。

1.3.2 紅菇多糖含量測(cè)定

使用硫酸- 苯酚法測(cè)定。首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：制備葡萄糖0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL具塞刻度試管中，每管用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL，加入體積分?jǐn)?shù)5%的苯酚1 mL，迅速混勻后再加入體積分?jǐn)?shù)98%的濃硫酸 5 mL，搖勻后放置至室溫。待溶液冷卻后，以蒸餾水作為空白對(duì)照調(diào)零，使用紫外分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將紅菇多糖樣品稀釋至合適倍數(shù)，吸取2.0 mL樣品稀釋液，按照上述步驟操作，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算紅菇多糖含量。

1.3.3 小鼠模型的建立與分組

參照文獻(xiàn)[13]，將52只昆明(KM)小鼠隨機(jī)均分為正常組(13只)和實(shí)驗(yàn)組(模型組、紅菇多糖75 mg/L飲水組和150 mg/L飲水組，每組13只)。實(shí)驗(yàn)組背部皮下注射D -半乳糖150 mg/(kg·d)建立衰老模型(連續(xù)8周)，每周稱量體重。其中正常組和模型組正常飲水。8周結(jié)束后，禁食12 h，稱取小鼠體重，眼球取血，處死小鼠后取肝臟稱重并分別于-80 ℃凍存，用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定。

1.3.4 小鼠肝指數(shù)的計(jì)算

肝指數(shù)即為小鼠肝臟質(zhì)量(g)與其體重(g)的比值，將每只小鼠的肝臟質(zhì)量與體重對(duì)應(yīng)，按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

肝指數(shù)=小鼠肝臟質(zhì)量/小鼠體重×100%。

(1)

1.3.5 小鼠血清GSH -Px、SOD活性及MDA含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14-15]，從小鼠眼球取出的血液，在4 ℃靜置1 h后，以3 500 r/min于4 ℃離心10 min，上清液即為血清。按照試劑盒操作方法測(cè)定血清中GSH -Px與SOD活性及MDA含量。

1.3.6 小鼠肝組織GSH -Px、SOD、Ca2+-ATPase活性及MDA含量的測(cè)定

取肝組織1 g，加入9 mL的生理鹽水，制成0.1 g/mL勻漿。按照試劑盒操作方法分別測(cè)定GSH -Px、SOD、Ca2+-ATPase[16]活性及MDA含量。

1.3.7 小鼠肝臟的HE染色

參照文獻(xiàn)[17]，取小鼠肝臟用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規(guī)脫水、透明、封片。用顯微鏡觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 5繪圖并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用多因素方差分析和多重比較分析，當(dāng)p<0.05時(shí)為顯著性差異，p>0.05時(shí)差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅菇多糖對(duì)小鼠肝指數(shù)的影響

肝指數(shù)可以反映肝的病變情況，若外物使肝臟受損，肝指數(shù)將會(huì)發(fā)生明顯下降[12]。正常組肝指數(shù)為正常值，表明肝臟未受損(見圖1)。模型組與正常組相比，其肝指數(shù)下降了39.24%，差異顯著(p<0.05)，說明模型組建模成功。紅菇多糖高劑量組肝指數(shù)與模型組肝指數(shù)相比，其肝指數(shù)比模型組高出37.93%，具有顯著性差異(p<0.05)，說明400 mL 150 mg/L紅菇多糖飲水能顯著地抑制小鼠肝臟衰老。而紅菇多糖低劑量組與模型組相比差異不顯著(p>0.05)。

*表示與正常組對(duì)比，#表示與模型組對(duì)比，** 和##表示p<0.05。圖1 8周后各組小鼠的肝指數(shù)Fig.1 Liver index of mice

2.2 紅菇多糖對(duì)血清和肝組織中GSH -Px活性的影響

GSH -Px是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的、一種重要的催化過氧化物分解的酶。在機(jī)體中，清除自由基和體內(nèi)抗氧化物質(zhì)與酶活性呈正相關(guān)[14]。模型組小鼠血清和肝組織中GSH -Px活性明顯低于正常組，差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)，說明D -半乳糖致使模型組小鼠清除自由基能力降低，從而使小鼠體內(nèi)GSH -Px活性降低(見圖2)。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組小鼠血清和肝組織中GSH -Px活性分別提高了48.66%，40.39%，效果顯著(p<0.05)，說明高劑量紅菇多糖可有效地激活GSH -Px，以清除體內(nèi)的自由基等氧化性物質(zhì)。而紅菇多糖低劑量組的GSH -Px活性與模型組沒有顯著性差異。

*表示與正常組對(duì)比，#表示與模型組對(duì)比，**和##表示p<0.05。圖2 紅菇多糖對(duì)小鼠血清和肝臟GSH -Px活性的影響Fig.2 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum GSH -Px contents

2.3 紅菇多糖對(duì)血清和肝組織中SOD活性的影響

*表示與正常組對(duì)比，#表示與模型組對(duì)比，**和##表示p<0.05。圖3 紅菇多糖對(duì)小鼠血清和肝臟SOD活性的影響Fig.3 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum SOD contents

2.4 紅菇多糖對(duì)血清和肝組織中MDA含量的影響

機(jī)體中的氧自由基通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成MDA等脂質(zhì)過氧化物。MDA含量的高低間接地反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，MDA含量越高，說明機(jī)體受到自由基的攻擊越嚴(yán)重[14]。模型組小鼠血清MDA含量顯著高于正常組(p<0.05)，如圖4。說明經(jīng)D -半乳糖誘導(dǎo)，小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物明顯增多。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組小鼠血清和肝中MDA含量分別降低了33.86%，37.63%，效果顯著(p<0.05)。表明紅菇多糖高劑量組能有效抑制D -半乳糖導(dǎo)致的衰老小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化。

*表示與正常組對(duì)比，#表示與模型組對(duì)比，** 和##表示p<0.05。圖4 紅菇多糖對(duì)小鼠血清和肝臟MDA含量的影響Fig.4 Effects of Russula polysaccharide on hepatic and serum MDA contents

2.5 紅菇多糖對(duì)肝組織中Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase是細(xì)胞膜上的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其活性是反映細(xì)胞活力以及相關(guān)蛋白和機(jī)體氧化程度的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，儲(chǔ)藏過程中細(xì)胞活性不斷下降、氧化程度不斷升高，這會(huì)導(dǎo)致Ca2+-ATPase 活性下降[16]。模型組的Ca2+-ATPase活性顯著低于正常組(p<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)在小鼠Ca2+-ATPase方面建模成功(見圖5)。與模型組相比，紅菇多糖高劑量組中的Ca2+-ATPase活性分別提高了48.23%，41.17%，效果較為顯著(p<0.05)。

*表示與正常組對(duì)比，#表示與模型組對(duì)比，**和##表示p<0.05。圖5 紅菇多糖對(duì)小鼠肝臟Ca2+ -ATPase活性的影響Fig.5 Effects of Russula polysaccharide on liver Ca2+ -ATPase activities

2.6 紅菇多糖對(duì)小鼠肝臟蘇木精- 伊紅染色的影響

小鼠肝臟的蘇木精- 伊紅染色(hematoxylin -eosin staining,HE)結(jié)果表明，電鏡下正常組肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊、中央靜脈無異常；模型組肝細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核體積縮小，肝細(xì)胞之間連接松散，部分肝細(xì)胞可見輕度脂肪變性，肝竇輕度擴(kuò)張；紅菇多糖高劑量組肝細(xì)胞及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、大小及其染色未見明顯異常，個(gè)別肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見脂滴顆粒，肝竇無擴(kuò)張；紅菇多糖低劑量組肝細(xì)胞及細(xì)胞核體積增大，部分肝細(xì)胞可見脂肪變性，少量肝細(xì)胞胞漿嗜酸性增強(qiáng)，肝索結(jié)構(gòu)未見明顯異常(見圖6)。

a、b、c、d分別為正常組、模型組、紅菇多糖高劑量組、紅菇多糖低劑量組。圖6 電鏡下小鼠肝臟的HE染色圖片F(xiàn)ig.6 Representative photography of hematoxylin -eosin staining of liver in mice

3 結(jié) 論

與模型組相比，150 mg/L濃度的紅菇多糖使昆明小鼠的體重明顯增加，血清和肝中的GSH -Px、SOD活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著降低，Ca2+-ATPase活性顯著增強(qiáng)，表明紅菇多糖對(duì)小鼠肝功能衰退有顯著(p<0.05)抑制和推遲效果。

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(責(zé)任編輯：張逸群)

Inhibitory Effect ofRussulafarinipesRomell Polysaccharide on Mice Liver Senescence

WEI Jie1, ZHANG Xiao1, ZHANG Guokun1, WAN Dongmei1, LIU Jingfeng2, SUN Shuhua2

(1.SchoolofLifeScience,LiaoningUniversity,Shenyang110036,China; 2.LiaoningXianrendongNationalNatureReserveAdministrationBureau,Dalian116407,China)

Effects ofRussulapolysaccharide on mice hepatic insufficiency were investigated in this study. The senile model mice were established by D -galactose and mice were treated by 75 mg/L and 150 mg/LRussulapolysaccharide. After 8 weeks, liver index, serum and hepatic GSH -Px, SOD activity, MDA contents, Ca2+-ATPase activity and hematoxylin -eosin staining of mice were determined. The results showed that the treatment of 150 mg/LRussulapolysaccharide could increase liver index, GSH -Px and SOD activity, and decrease the MDA content, which could inhibit the aging of liver.

Russulapolysaccharide; liver; anti -aging

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.007

2095 -6002(2017)03 -0050 -05

魏杰，張瀟，張國(guó)坤，等. 紅菇多糖對(duì)小鼠肝臟衰老的抑制效果[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(3):50-54.

WEI Jie, ZHANG Xiao, ZHANG Guokun, et al. Inhibitory effect ofRussulafarinipesRomell polysaccharide on mice liver senescence[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):50-54.

2016 -09 -21

遼寧仙人洞國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)大型真菌資源調(diào)查項(xiàng)目； 遼寧省教育廳教學(xué)研究項(xiàng)目(LYB201611)； 遼寧省社會(huì)科學(xué)規(guī)劃基金資助項(xiàng)目(L15BJY029)。

魏 杰， 女， 副教授， 博士， 主要從事生物活性物質(zhì)及其功能方面的研究。

TS201.6； R151.3； S646

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