花斑副沙鰍七種同工酶的組織特異性表達(dá)

趙田田+蒲宗旺+岳興建

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳方法，對(duì)花斑副沙鰍（Parabotia fasciata Dabry）的鰓、心、肝胰臟、腸、腎、肌肉、眼、腦8種組織中的過(guò)氧化氫酶（CAT）、酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和醇脫氫酶（ADH）進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，花斑副沙鰍的7種同工酶表達(dá)具有明顯的組織特異性，8種組織中檢測(cè)出3種CAT同工酶、8種EST同工酶、4種LDH同工酶、8種MDH同工酶、10種POD同工酶、10種SOD同工酶、10種ADH同工酶表達(dá)。其中，CAT-3、EST-7僅在肝胰臟表達(dá)，LDH-4、SOD-9、ADH-3僅在腎表達(dá)。

關(guān)鍵詞：花斑副沙鰍（Parabotia fasciata Dabry）；同工酶；表達(dá)；組織特異性

中圖分類號(hào)：Q959.46+8：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）14-2736-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.035

Abstract： Seven isozymes including Catalase（CAT）， Esterase（EST）， Lactic acid hydrogen enzymes（LDH）， Malate dehydrogenase（MDH）， Peroxidase（POD）， Superoxyde dismutase（SOD）， Alcohol dehydrogenase（ADH） were examined in eight tissues （gill， heart， hepatopancreas， intestines， kidney， muscle， brain and eye） of Parabotia fasciata Dabry by vertical polyacrylamide gel gradient electrophoresis. The results showed that isozyme genes in P. fasciata apparently exhibited tissue specific expression to different degrees. The detected band number of CAT， EST， LDH， MDH， POD， SOD， ADH were 3， 8， 4， 8， 10， 10， 10， respectively. The isozyme CAT-3 and EST-7 were expressed only in hepatopancreas. The isozyme LDH-4， SOD-9 and ADH-3 were expressed only in the renal tissue.

Key words： Parabotia fasciata Dabry； isozyme； expression； tissue specificity

花斑副沙鰍（Parabotia fasciata Dabry）隸屬鯉形目（Cypriniformes）鰍科（Cobitidae）沙鰍亞科（Botiinae）副沙鰍屬（Parabotia Dabry de Thiersant），俗稱黃鰍、黃沙鰍、伍氏沙鰍，為中國(guó)特有魚(yú)類。廣泛分布于黑龍江至珠江的各水系，長(zhǎng)江上游主要分布在岷江、沱江、嘉陵江等長(zhǎng)江干流水系，是一種以水生昆蟲(chóng)和藻類為食物的小型底棲魚(yú)類[1]。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、水利工程修建、水環(huán)境污染等環(huán)境的改變，野生資源量急劇下降[2]。目前對(duì)花斑副沙鰍的研究較少，且主要集中在發(fā)育生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、年齡與生長(zhǎng)、肌肉營(yíng)養(yǎng)等方面[2-8]，未見(jiàn)關(guān)于同工酶的研究報(bào)道。試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺垂直平板電泳方法，對(duì)花斑副沙鰍的鰓、心、肝胰臟、腸、腎、肌肉、眼、腦8種組織中的過(guò)氧化氫酶（CAT）、酯酶（EST）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和醇脫氫酶（ADH）7種同工酶進(jìn)行了電泳檢測(cè)，分析花斑副沙鰍同工酶的組織表達(dá)情況，了解花斑副沙鰍的生化遺傳特性，旨在為花斑副沙鰍的種質(zhì)資源保護(hù)、人工選育、病理研究、環(huán)境生態(tài)影響評(píng)價(jià)等方面提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

參試花斑副沙鰍為長(zhǎng)江上游魚(yú)類資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工繁殖個(gè)體，取全長(zhǎng)130～159 mm、體長(zhǎng)110～135 mm、體質(zhì)量13.9～26.5 g、體格健壯、體表無(wú)傷個(gè)體30尾用于試驗(yàn)。取樣前清水中停餌暫養(yǎng)1 d。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 花斑副沙鰍斷鰓斷尾放血，冰浴條件下迅速摘取鰓、心、肝胰臟、腸、腎、肌肉、眼、腦8種組織，濾紙吸去血漬，預(yù)冷生理鹽水清洗組織，以樣品∶緩沖液=1∶7的比例加入0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 7.0）混合。冰浴勻漿后加入100 μL氯仿混勻；4 ℃冰箱中靜置10 min；14 000 r/min低溫離心15 min（2次），取上清液，分裝，用于電泳分析或放入-80 ℃超低溫冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳與染色 按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為7.5%。電極緩沖液為T(mén)ris-Gly（pH 8.3）。加樣前50 V電壓下預(yù)電泳30 min，預(yù)電泳結(jié)束后每個(gè)加樣孔加樣15 μL。指示劑在濃縮膠時(shí)電泳電壓為80 V，指示劑完全進(jìn)入分離膠后電壓升高至120 V，電流為15 mA；在冰柜中保持4 ℃進(jìn)行電泳。待指示劑距凝膠底端2 cm處時(shí)停止電泳。取出凝膠用預(yù)冷去離子水洗凈，放入染液進(jìn)行染色。染液現(xiàn)配現(xiàn)用，染色流程參考有關(guān)方法[10-13]，稍作改進(jìn)。

1.2.3 同工酶命名 同工酶的縮寫(xiě)、命名參照胡能書(shū)等[14]和熊全沫[15]的方法，按照從陽(yáng)極到陰極的順序依次標(biāo)記。具體為CAT（E.C.1.11.1.6）、EST（E.C.3.1.1.1）、LDH（E.C.1.1.1.27）、MDH（E.C.1.1.1.37）、POD（E.C.1.11.1.7）、SOD（E.C.1.15.1.1）和ADH（E.C.1.1.1.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAT（E.C.1.11.1.6）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里CAT同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖1，CAT同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表1。從圖1、表1可見(jiàn)，CAT同工酶在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，除肌肉中活性稍弱外，其余各組織里的活性均較強(qiáng)?；ò吒鄙出q不同組織中檢測(cè)出的CAT同工酶酶帶有3條，以肝胰臟中的酶帶最多，檢測(cè)出了3條。其中CAT-1在花斑副沙鰍8種組織中均有存在，且肝胰臟中的表達(dá)最強(qiáng)；CAT-2在鰓、心、肝胰臟和腎中存在，以肝胰臟中表達(dá)最強(qiáng)；CAT-3僅存在于肝胰臟中，說(shuō)明肝胰臟具有較強(qiáng)的組織特異性?；ò吒鄙出q不同組織里的CAT同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)楦我扰K>鰓、腎>心>腸、眼、腦>肌肉。

2.2 EST（E.C.3.1.1.1）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里EST同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖2，EST同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表2。從圖2、表2可見(jiàn)，EST同工酶在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，其中在肝胰臟里的活性最強(qiáng)?；ò吒鄙出q不同組織中檢測(cè)出的EST同工酶酶帶有8條，以肝胰臟中的酶帶最多，檢測(cè)出了8條；肌肉里酶帶最少，僅有1條。EST-1、EST-3表達(dá)相同，僅在花斑副沙鰍的鰓、肝胰臟、腸中表達(dá)，以肝胰臟里的活性表達(dá)最強(qiáng)；EST-2存在于除肌肉外的其余各組織里，以肝胰臟中的活性最強(qiáng)；EST-4存在于花斑副沙鰍8種組織中，除肌肉里的活性較弱外，其余各組織里活性均較強(qiáng)；EST-5、EST-6在肝胰臟、腸、腎中的表達(dá)相同，除此之外，EST-5在鰓中也有表達(dá)，EST-6在眼、腦中也有表達(dá)；EST-7僅在花斑副沙鰍肝胰臟中有表達(dá)，且活性較弱；EST-8在肝胰臟、眼中有表達(dá)?；ò吒鄙出q不同組織里的EST同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)楦我扰K>腸>鰓>腎>眼>心>腦>肌肉。

2.3 LDH（E.C.1.1.1.27）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里L(fēng)DH同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖3，LDH同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表3。從圖3、表3可見(jiàn)，LDH同工酶在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，其中在腎里活性最強(qiáng)，肝胰臟和眼中的活性最弱?；ò吒鄙出q8種組織中檢測(cè)出的LDH同工酶酶帶有4條，以腎里酶帶最多，檢測(cè)到4條。LDH-1存在于除眼以外的其余各組織里，其中以鰓、心、肌肉里的活性最強(qiáng)，腦里的活性最弱；LDH-2廣泛存在于8種組織中，除肝胰臟和眼外，其余組織里的活性均較強(qiáng)；LDH-3在鰓、心、腎、眼、腦中表達(dá)，在鰓、心、腎中優(yōu)勢(shì)表達(dá)；LDH-4僅在腎中表達(dá)，且活性極強(qiáng)，組織特異性明顯?；ò吒鄙出q不同組織里的LDH同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)槟I>鰓、心>肌肉>腸、腦>肝胰臟、眼。

2.4 MDH（E.C.1.1.1.37）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里MDH同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖4，MDH同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表4。從圖4、表4可見(jiàn)，花斑副沙鰍MDH同工酶不同于其他同工酶，只在除腸外的其余7種組織中表達(dá)，以心臟里的活性最強(qiáng)?；ò吒鄙出q不同組織中檢測(cè)出的MDH同工酶酶帶有8條，以眼中的條帶最多，檢測(cè)出8條。MDH-1在心、腎、肌肉、眼中表達(dá)，以心、腎里的活性最強(qiáng)；MDH-2在鰓、心、腎、肌肉、眼中表達(dá)，其中在心、腎中優(yōu)勢(shì)表達(dá)；MDH-3、MDH-4在除腸外的7種組織中均有表達(dá)，以心臟里的活性最強(qiáng)；MDH-5、MDH-6除活性不同外，表達(dá)相同，均在鰓、心、肝胰臟、腎、眼、腦中表達(dá)；MDH-7在心、肝胰臟、腎、眼、腦中表達(dá)，且活性均較強(qiáng)；MDH-8僅在肝胰臟、眼、腦中表達(dá)，且活性均較弱?；ò吒鄙出q不同組織里的MDH同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)樾?gt;腎>肝胰臟>眼>腦>鰓>肌肉。

2.5 POD（E.C.1.11.1.7）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里POD同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖5，POD同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表5。從圖5、表5可見(jiàn)，POD同工酶在花斑副沙鰍的8種組織里均有表達(dá)，以肌肉里的活性最強(qiáng)，腸里的活性最弱?；ò吒鄙出q不同組織中檢測(cè)出的POD同工酶酶帶有10條，其中心、肌肉里酶帶最多，都檢測(cè)出7條，但肌肉里的活性高于心。POD-1、POD-2除活性有所差異外，在鰓、心、肝胰臟和肌肉中表達(dá)相同；POD-3在心、肝胰臟、腎、肌肉和眼中表達(dá)，在腎和肌肉里活性最強(qiáng)；POD-4在鰓、心和肌肉中活性強(qiáng)，在腸和眼里活性弱；POD-5在肝胰臟、腸、肌肉和腦中表達(dá)，肌肉里活性最強(qiáng)；POD-6在心和肌肉中活性較強(qiáng)；POD-7在肝胰臟中活性強(qiáng)；POD-8、POD-9、POD-10的活性均較弱，且僅在部分組織中表達(dá)?；ò吒鄙出q不同組織里的POD同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)榧∪?gt;心>鰓>肝胰臟>腎>眼>腦>腸。

2.6 SOD（E.C.1.15.1.1）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里SOD同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖6，SOD同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表6。從圖6、表6可見(jiàn)，SOD同工酶在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，以肌肉里的活性最強(qiáng)，眼里的活性最弱?；ò吒鄙出q不同組織中檢測(cè)出的SOD同工酶酶帶有10條，其中鰓里的酶帶最多，檢測(cè)出8條。SOD-1存在于除肌肉和腦之外的6種組織中，心、腸和腎里的活性略強(qiáng)于其他組織；SOD-2以肌肉里的活性最強(qiáng)；SOD-3在鰓、肌肉、眼和腦中表達(dá)，以鰓里的活性最弱；SOD-4存在于8種組織中，且活性均較強(qiáng)；SOD-5在肌肉中活性強(qiáng)；SOD-6在心臟里活性強(qiáng)；SOD-7在腸和肌肉中活性強(qiáng)；SOD-8在除眼之外的7種組織中表達(dá)，其中腎、肌肉和腦里的活性優(yōu)于其他組織；SOD-9僅在腎中表達(dá)；SOD-10在鰓和肝胰臟中表達(dá)，肝胰臟里的活性高于鰓?；ò吒鄙出q不同組織里的SOD同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)榧∪?gt;鰓、腎>肝胰臟>腸>心>腦>眼。

2.7 ADH（E.C.1.1.1.1）同工酶分析

花斑副沙鰍8種組織里ADH同工酶的電泳結(jié)果及模式見(jiàn)圖7，ADH同工酶表達(dá)及活性強(qiáng)弱比較見(jiàn)表7。從圖7、表7可見(jiàn)，ADH同工酶在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，不同組織中檢測(cè)出的ADH同工酶酶帶有10條，其中肝胰臟、腎、肌肉和腦里均檢測(cè)出6條，以肌肉里的活性最強(qiáng)。ADH-1在鰓、肝胰臟、腎和肌肉中表達(dá)，且活性均較強(qiáng)；ADH-2在除腸外的7種組織中表達(dá)，除眼和腦里的活性較弱外，其余組織里的活性均較強(qiáng)；ADH-3僅存在于腎中，且活性強(qiáng)；ADH-4在8種組織中表達(dá)，活性均較強(qiáng)；ADH-5在除肌肉外的7種組織中表達(dá)，以心臟里的活性最強(qiáng)；ADH-6在心、腸和肌肉中表達(dá)，以肌肉里的活性最強(qiáng)，腸里活性最弱；ADH-7在肌肉和腦中表達(dá)，以肌肉里活性最強(qiáng)；ADH-8在肝胰臟和腎中表達(dá)；ADH-9在肌肉、眼和腦中表達(dá)，其中肌肉里的活性略強(qiáng)于眼和腦；ADH-10在肝胰臟和腦中表達(dá)，且活性均較弱?；ò吒鄙出q不同組織里的ADH同工酶活性強(qiáng)弱排序?yàn)榧∪?gt;腎>肝胰臟>鰓、心>腦>眼>腸。

3 討論

3.1 花斑副沙鰍同工酶表達(dá)的組織特異性

試驗(yàn)結(jié)果表明，花斑副沙鰍同工酶表達(dá)呈現(xiàn)明顯的組織特異性，表現(xiàn)在不同組織同種同工酶帶型不同，表達(dá)量有差異；同種組織里各種同工酶表達(dá)量與表現(xiàn)型不同；不同組織同工酶酶譜相似，但活性不同。不同組織同工酶的特異性表達(dá)是因?yàn)闄C(jī)體在發(fā)育過(guò)程中各組織分化后，為滿足不同組織特定的生理功能而發(fā)生的基因差異性表達(dá)[16]。通過(guò)對(duì)花斑副沙鰍7種同工酶的比較，發(fā)現(xiàn)8種組織中，肝胰臟中的酶活性最強(qiáng)，腸中酶活性最弱。鰓中檢測(cè)出了7種同工酶，其中EST、SOD同工酶活性最強(qiáng)。心、眼、腦、腎中各檢測(cè)出了7種同工酶，其中均以MDH同工酶的活性最強(qiáng)。肝胰臟中檢測(cè)出了7種同工酶，其中EST活性最強(qiáng)。腸中檢測(cè)到除MDH同工酶以外的6種同工酶，其中EST同工酶活性最強(qiáng)。肌肉中檢測(cè)出了7種同工酶，其中POD、ADH同工酶活性最強(qiáng)。花斑副沙鰍的CAT、EST、LDH、MDH、POD、SOD、ADH同工酶在各組織之間存在明顯的組織特異性，其中CAT-3、EST-7只在肝胰臟中表達(dá)，這與肝胰臟作為機(jī)體代謝最旺盛的器官、具有解毒功能相符；LDH-4、SOD-9、ADH-3只在腎中表達(dá)，這與腎作為魚(yú)類機(jī)體的造血器官相符。

花斑副沙鰍同工酶的表達(dá)特點(diǎn)與目前發(fā)現(xiàn)的各種硬骨魚(yú)類多種同工酶表達(dá)具有一致的組織特異性，如鳤（Ochetobibus elongatus Kner）等20種魚(yú)類的LDH同工酶[17]，大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus Sauvag）的LDH、EST同工酶[18，19]，草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus Cuvier et Valenciennes）的LDH、ADH、MDH、G3PDH、EST、POD同工酶[20]，泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）的EST、SOD、G6PDH、ALP、ADH、POD、CAT同工酶[19，21，22]，青魚(yú)（Mylopharyngodon piceus Richardson）的α-AMY、EST、TDH、LDH、MDH、ME、POX、SOD、C6PDH同工酶[23]，黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）的EST、SOD、MDH同工酶[24]，奧尼羅非魚(yú)（Tilapia nilotica×T. aurea L.）5種組織的EST、LDH、MDH、SOD同工酶[25]，石鰈（Platichthys bicoloratus Basilewsky）的LDH、EST、SOD、PGM、SDH、GDH、G3PDH、MDH、ME、IDHP、PGDH、GPI、HK、ADH同工酶[26]，青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii Kessler）的LDH、MDH、ME、CAT、IDH、EST、ACP、POD、HK、PGM、GDH、SOD、GPI同工酶[27]，黃河高原鰍（Triplophysa pappenheimi P. W. Fang）的LDH同工酶[28]，波紋唇魚(yú)（Cheilinus undulatus Püppell）的EST、LDH、MDH、ME同工酶[29]，黑鯛（Sparus macrocephlus Basilewsky）的LDH、ADH、MDH、ME、SOD、POD、EST、GAD、FDH同工酶[16]，鯉魚(yú)（Cyprinus carpio L.）的LDH、MDH、EST、CAT、POD、G6PDH、IDH、ADH同工酶[30]。雖然上述魚(yú)種均具有組織表達(dá)特異性，但不同魚(yú)種各同工酶的組織特異性存在差異。少數(shù)魚(yú)種的部分同工酶如青魚(yú)GOT同工酶[23]、黃顙魚(yú)LDH同工酶[24]無(wú)明顯的組織差異，一些魚(yú)種的同工酶不表達(dá)，如天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）在波紋唇魚(yú)6種組織（肌肉、心臟、肝臟、腎臟、腦和脾臟）里未有表達(dá)[28]。花斑副沙鰍LDH也有明顯的組織差異，GOT和AST還未檢測(cè)出。

3.2 花斑副沙鰍不同組織同工酶表達(dá)特異性與功能的相關(guān)性

3.2.1 CAT、EST、POD、SOD與機(jī)體的解毒功能密切相關(guān) CAT為二聚體酶，是一類催化H2O2分解成H2O和O2的酶，主要存在于生物體的肝細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)[27]；花斑副沙鰍肝胰臟中CAT表達(dá)量最高，其次是腎、鰓，肌肉里表達(dá)量最低，這與肝胰臟作為魚(yú)類解毒器官、腎臟作為魚(yú)類重要的造血器官、鰓作為魚(yú)類的呼吸器官而分布有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)、執(zhí)行機(jī)體的氧化解毒等功能密切相關(guān)。CAT-1廣泛分布于花斑副沙鰍的各種組織中，推測(cè)CAT-1是花斑副沙鰍CAT同工酶的基礎(chǔ)酶。EST屬于水解酶，也為二聚體酶，是一類催化酯類化合物水解的酶，在酶代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要的作用[24]，與體內(nèi)廢物、毒素的代謝相關(guān)；花斑副沙鰍肝胰臟中EST表達(dá)量最高，與肝胰臟作為消化、吸收、排毒的主要器官相關(guān)；腸道作為消化吸收的主要場(chǎng)所，EST表達(dá)量也較高；肌肉里表達(dá)量最低，且酶帶少、染色淺。EST-4在花斑副沙鰍8種組織中都有表達(dá)，可能是花斑副沙鰍維持生物膜功能結(jié)構(gòu)、解毒的EST同工酶基礎(chǔ)酶。POD是利用H2O2作為氧化供氫體的氧化酶，通過(guò)利用H2O2對(duì)酚類、胺類和嘌呤等有毒物質(zhì)氧化，以減輕對(duì)機(jī)體的損傷；花斑副沙鰍肌肉中的POD表達(dá)量最高，表明花斑副沙鰍肌肉組織是H2O2氧化及免疫代謝的主要場(chǎng)所；心臟、肝胰臟里表達(dá)量也較高，與心臟肌肉代謝水平高、肝胰臟作為解毒的主要器官有關(guān)；腸道里表達(dá)量最低，因其功能與氧化還原相關(guān)性不大。SOD也為二聚體酶類，是廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶[21]；SOD能清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基·O2-，是機(jī)體防御氧化損傷的重要酶，與機(jī)體自身免疫疾病、輻射防護(hù)、機(jī)體衰老等密切相關(guān)；花斑副沙鰍肌肉中SOD表達(dá)量最高，這與肌肉高能量代謝水平相適應(yīng)；鰓、腎中表達(dá)量也較豐富是因?yàn)轹w、腎與紅細(xì)胞密切相連，與其能清除氧自由基、防御氧化損傷的功能相符。SOD-4廣泛分布于花斑副沙鰍的8種組織中，且活性都非常強(qiáng)，可能是花斑副沙鰍免疫防御的SOD同工酶基礎(chǔ)酶。

3.2.2 LDH、ADH、MDH與機(jī)體的能量代謝密切相關(guān) LDH為四聚體酶，其4個(gè)亞基的合成分別由A基因和B基因決定[17]，LDH作為參與糖酵解的關(guān)鍵酶，參與乳酸與丙酮酸的相互轉(zhuǎn)化；花斑副沙鰍腎中的LDH表達(dá)量最高，與腎組織的造血、泌尿等代謝活動(dòng)相關(guān)[25，28]。LDH-2在花斑副沙鰍8種組織中均有表達(dá)，是花斑副沙鰍的LDH同工酶基礎(chǔ)酶。ADH為二聚體酶，廣泛分布于人和動(dòng)物的肝臟中，其存在意義就是適應(yīng)厭氧酵解的需求[30]；花斑副沙鰍肌肉中ADH表達(dá)量最高，與肌肉尤其是白肌在低氧條件下能將機(jī)體的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇、防止機(jī)體丙酮酸積累過(guò)多而中毒有關(guān)。ADH-4廣泛分布于花斑副沙鰍的8種組織中，是花斑副沙鰍的ADH同工酶基礎(chǔ)酶。MDH也為二聚體酶，是糖代謝三羧酸循環(huán)過(guò)程中的重要酶，其主要功能是使蘋(píng)果酸脫氫參與糖酵解后的有氧代謝[29]，MDH在花斑副沙鰍可檢測(cè)到8種，其中MDH1～MDH4為線粒體型（m-MDH），MDH5～MDH8為上清液型（s-MDH）[29]；花斑副沙鰍MDH表達(dá)量在心、肝胰臟、腎等組織中較為豐富，這與心臟、肝胰臟、腎臟旺盛的代謝密切相關(guān)；腸中未檢測(cè)到MDH的表達(dá)，可能是腸為主要的消化吸收?qǐng)鏊?、是非主要有氧代謝場(chǎng)所的緣故。

3.3 花斑副沙鰍EST、LDH與其他魚(yú)類同工酶的比較

同工酶組織特異性明顯，不同魚(yú)類甚至不同個(gè)體的同工酶表達(dá)存在較大差異，這是魚(yú)類物種與雜種鑒定、物種間親緣關(guān)系與系統(tǒng)進(jìn)化分析、物種倍性鑒定、基因連鎖分析與基因作圖、基因進(jìn)化、個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)與調(diào)控、群體遺傳多樣性等研究中常用的生化指標(biāo)[31-33]?；ò吒鄙出q8種組織中檢測(cè)出的EST同工酶有8條酶帶，以肝胰臟中活性最強(qiáng)，這與大多數(shù)的研究結(jié)果一致，泥鰍檢測(cè)出5條酶帶[22]，大鱗副泥鰍檢測(cè)出6條酶帶[19]，草魚(yú)檢測(cè)出7條酶帶[20]，，鱅（Aristichthys nobilis Richardson）檢測(cè)出5條酶帶、青魚(yú)檢測(cè)出6條酶帶、鰱（Hypophthalmichthys molitrix Valenciennes）檢測(cè)出6條酶帶[33]。通過(guò)與其他魚(yú)類相比，發(fā)現(xiàn)花斑副沙鰍EST同工酶酶帶多，且表型復(fù)雜，反映出EST同工酶基因表達(dá)的多樣性比較豐富；但不及烏鱧（Ophicephalus argus Cantor）的10條酶帶。

在魚(yú)類同工酶中，LDH是研究最廣泛的同工酶，其組織特異性表達(dá)還反映了不同科屬魚(yú)類的親緣關(guān)系[17，33，34]?；ò吒鄙出q檢測(cè)到4種LDH同工酶，而鰍科（Cobitidae）的高原鰍屬（Triplophysa spp.）黃河高原鰍（Triplophysa pappenheimi P. W. Fang）、葉爾羌鼓鰾鰍（T. yarkandensis Day）則表達(dá)出5種LDH同工酶[28，35]。大鱗副泥鰍LDH同工酶在發(fā)育過(guò)程中有7種先后表達(dá)[18]，通過(guò)LDH同工酶的表達(dá)，能夠從屬的水平上反映其系統(tǒng)關(guān)系；同時(shí)花斑副沙鰍LDH同工酶酶譜相對(duì)較簡(jiǎn)單，可能是因?yàn)榛ò吒鄙出qLDH同工酶基因的遺傳多樣性較低形成的。在花斑副沙鰍各組織中未檢測(cè)到大鱗副泥鰍[18]、烏鱧[36]、巖原鯉（Procypris rabaudi Tchang）[37]等魚(yú)種的LDH同工酶基因的表達(dá)；而白甲魚(yú)（Onychostoma simus Sauvage et Dabry）[38]、四川裂腹魚(yú)（Schizothorax kozlov Nikolsky）[39]中的表達(dá)條帶多，這可能與鲃亞科（Barbinae）、裂腹魚(yú)亞科（Schizothoracinae）的魚(yú)類四倍體來(lái)源有關(guān)[38-41]。

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