電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜預(yù)防腱周粘連的相關(guān)研究

李鵬昊，劉舒云，王亞潔，全琦，王玉，汪愛媛，彭江，許文靜，盧世璧，郭全義

電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜預(yù)防腱周粘連的相關(guān)研究

李鵬昊，劉舒云，王亞潔，全琦，王玉，汪愛媛，彭江，許文靜，盧世璧，郭全義

目的探討聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜的結(jié)構(gòu)、成分、親水性、組織相容性和細(xì)胞毒性，以及該膜對(duì)鼠 L929 成纖維細(xì)胞黏附和活性的影響，從而明確該電紡膜在預(yù)防肌腱斷裂后腱周粘連的可行性。

方法制備單純電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物膜和電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜。通過掃描電鏡、紅外光譜、接觸角檢測(cè)分析電紡膜的超微結(jié)構(gòu)、成分以及親水性能；通過溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)和 MTT 法驗(yàn)證電紡膜的組織相容性和細(xì)胞毒性；將鼠 L929 細(xì)胞種植在單純電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物膜和電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜上，體外培養(yǎng) 4 d后進(jìn)行死/活細(xì)胞染色，通過共聚焦顯微鏡觀察比較 L929細(xì)胞在兩組膜上的黏附和活性情況。

結(jié)果兩種電紡膜由納米級(jí)-微米級(jí)的纖維絲有序排列，形成致密多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。且溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，L929 細(xì)胞在電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜的 DMEM浸提液組和正常培養(yǎng)液組中的 OD570值的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；死/活細(xì)胞染色提示，鼠 L929 成纖維細(xì)胞在電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜的 I 型膠原-聚己內(nèi)酯層上第 4 天的黏附率和生存率顯著高于對(duì)照組（P ＜ 0.05），而 L929 細(xì)胞在單純電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物膜上的黏附率和生存率顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.05）。

結(jié)論電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜是由納米級(jí)-微米級(jí)有序排列的纖維絲構(gòu)成的多孔膜片，而且組織相容性良好，無明顯細(xì)胞毒性。其聚乳酸-羥基乙酸共聚物層可以有效抑制成纖維細(xì)胞的黏附和生存，I 型膠原-聚己內(nèi)酯層可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附和存活。電紡聚乳酸-羥基乙酸共聚物/I 型膠原-聚己內(nèi)酯雙層膜對(duì)預(yù)防肌腱斷裂后腱周粘連具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

組織粘連； 生物相容性材料； 膠原 I 型；肌腱斷裂； 靜電紡絲

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(4):289-296

肌腱斷裂是一種常見的運(yùn)動(dòng)損傷。由于血供較少，肌腱斷裂后很難自愈，而是趨向于形成瘢痕組織和腱周粘連[1]。瘢痕組織脆性大，很容易出現(xiàn)再斷裂；而腱周粘連減弱了肌腱的滑動(dòng)能力，極大影響了鄰近關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)。為了避免瘢痕組織和腱周粘連的發(fā)生，臨床上采取早期手術(shù)修復(fù)，并配合康復(fù)理療的治療策略，效果良好[2]。但是，很多患者需要快速回歸到以前的工作和運(yùn)動(dòng)中，不能接受長時(shí)間的康復(fù)理療。

物理屏障，給肌腱斷裂患者的康復(fù)帶來新希望。一般而言，物理屏障應(yīng)該具備以下特點(diǎn)：抑制腱周組織中大量成纖維細(xì)胞在損傷的肌腱周圍自發(fā)黏附，阻斷腱周粘連的發(fā)生；有孔隙，利于腱周組織為肌腱滲透營養(yǎng)；組織相容性良好，無毒性，降解完全，而且降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無害；易彎曲，可以穩(wěn)定纏繞在肌腱斷裂處。靜電紡絲技術(shù)可以將有機(jī)高分子材料電紡成為由納米級(jí)或是微米級(jí)有序排列的纖維絲組成的多孔膜片[3]。電紡膜的性質(zhì)取決于所用的高分子材料。在組織修復(fù)方面有許多常用的醫(yī)用材料符合物理屏障的幾點(diǎn)要求。其中，聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）是單體為乳酸和羥基乙酸的共聚物，其降解速率根據(jù)兩種單體比例的不同而變化；I 型膠原是天然高分子材料，更是肌腱主要的組成成分。聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）具有良好的力學(xué)強(qiáng)度，在 I 型膠原中加入少量的 PCL，可以提高電紡膜的穩(wěn)定性[4]。為了探索電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜在肌腱斷裂后預(yù)防腱周粘連并促進(jìn)肌腱自然愈合的可行性，本實(shí)驗(yàn)將考察電紡單純PLGA 膜和以 PLGA 作為外膜，I 型膠原和少量PCL 作為內(nèi)膜的 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的一般性質(zhì)和安全性，以及鼠 L929 成纖維細(xì)胞在兩組膜上的黏附和活性情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 二氯甲烷（純度 99.9%）、六氟異丙醇（純度 99.5%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛跟腱 I 型膠原購自南京奧多福尼生物科技有限公司；PLGA（乳酸∶乙二醇 = 75∶25，Mw 66 000～107 000）、PCL（Mn 80 000）和 DMEM培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜（DMSO）、死/活細(xì)胞染色試劑盒均購自美國Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco 公司；SS 系列靜電紡絲設(shè)備購自永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器購自江蘇常州國華儀器公司；BB5060 型 CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus 公司；IX 70 型熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；S-4800 型掃描電鏡購自日本Hitachi 公司；Tensor 27 型紅外光譜儀購自德國Bruker 公司；Theta 型光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x購自芬蘭Biolin 公司；A1R-si 型共聚焦激光掃描顯微鏡購自日本 Nikon 公司；Epoch Take 3 酶標(biāo)儀購自美國 Bio-Tek 公司；ES-II 型熱原管購自日本 Wako公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，體重 100～200 g；健康新西蘭白兔 1 只，雌雄不限，體重 2.5 kg，均購自解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的制備 稱取 2.0 g PLGA，在磁力攪拌下完全溶解于20 ml 的二氯甲烷中，配成 10% 質(zhì)量體積比的PLGA 溶液；稱取 1.3 g I 型膠原完全溶解在 20 ml六氟異丙醇中，配成 4% 質(zhì)量比的 I 型膠原溶液；稱取 1.3 g PCL 完全溶解在 20 ml 六氟異丙醇中，配成 4% 質(zhì)量比的 PCL 溶液。取出 5 ml PCL 溶液與 20 ml 的 I 型膠原溶液混合，形成 80% 質(zhì)量比的 I 型膠原-PCL 混合溶液。在 18 000 r/min 高速轉(zhuǎn)動(dòng)的接收裝置外周，纏繞一層錫紙。設(shè)定電紡參數(shù)：溶液量：5 ml；電壓：15 kV；電場(chǎng)距離：15 cm；噴頭內(nèi)徑：11 mm；溶液推注速度：500 mm/min；噴頭平移速度：20 cm/min；噴頭平移范圍：5 cm。先電紡 I 型膠原-PCL 混合溶液，作為電紡膜的內(nèi)層；隨即電紡 PLGA 溶液，作為膜的外層。電紡?fù)戤吅?，所得電紡雙層膜靜置 24 h 后取下保存。在制備單純 PLGA 膜時(shí)，取用 10 ml PLGA 溶液，采用相同的參數(shù)電紡。

1.2.2 掃描電鏡觀察 使用掃描電鏡觀察電紡膜的內(nèi)表面細(xì)微結(jié)構(gòu)。經(jīng)過 75% 酒精擦拭后的單純PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜經(jīng)過剪切，形成 0.5 cm × 0.5 cm 的小塊，粘貼固定在 5 cm 的鋁架上，并進(jìn)行噴金處理。在 5000 eV和 10 mA 條件下進(jìn)行觀察。為測(cè)量電紡膜中纖維的直徑大小，通過 Image J 軟件對(duì)每種膜內(nèi)表面的5 張圖片中的 100 條纖維的直徑進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算出兩種電紡膜中纖維的直徑。

1.2.3 紅外光譜分析 將單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜剪切后，保留平整光滑的表面來進(jìn)行紅外光譜分析。樣品處理后，放進(jìn)光譜分析儀的反應(yīng)倉中，以 1 cm-1的分辨率，在 4000～650 cm-1的吸收光譜范圍內(nèi)進(jìn)行分析，根據(jù)吸收峰所對(duì)應(yīng)的紅外線的波長來確定電紡膜中所存在的官能團(tuán)，從而確定單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜中的成分。

1.2.4 接觸角 使用光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量電紡膜表面的接觸角來反映電紡膜表面的親水性。經(jīng)過75% 酒精擦拭后的單純 PLGA 電紡膜和電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜經(jīng)過剪切，形成 1 cm× 1 cm 的小塊，通過靜滴法，水滴接觸到單純PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜平整的表面，形成接觸角。相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)可以自動(dòng)計(jì)算出每種電紡膜表面的接觸角，并求出平均值。

1.2.5 電紡膜組織相容性檢測(cè) 電紡膜的生理鹽水浸提液是依據(jù) GB/T 16812-2000 國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第 12 部分：樣品制備與參照樣品》，按照電紡膜面積（cm2）：生理鹽水體積（ml）= 6∶1 的比例制備。90 cm260Co輻照滅菌后的單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜分別浸泡在 15 ml 的 0.9%的生理鹽水中，放置在 37 ℃ 的恒溫箱中 24 h后，獲得浸提液。

分別取蒸餾水、0.9% 的生理鹽水和單純PLGA 電紡膜浸提液和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL雙層膜浸提液各 2 ml 于潔凈試管中，蒸餾水組作為陽性對(duì)照，生理鹽水組作為陰性對(duì)照，在每只試管中注入 2 滴新鮮兔耳血。在 37 ℃ 環(huán)境中靜置30 min 后，各管 1500 r/min 離心 5 min，通過管中的溶血情況來判斷電紡膜的生理鹽水浸提液是否會(huì)造成血細(xì)胞的裂解。

分別取 3 ml 單純 PLGA 電紡膜和電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的生理鹽水浸提液于新的熱原管中，充分?jǐn)噭蚝笤?37 ℃ 環(huán)境中靜置1 h，通過熱原管內(nèi)的粉末與浸提液反應(yīng)后是否出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象來判斷電紡膜的生理鹽水浸提液是否是致熱原。

用單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的生理鹽水浸提液在酒精消毒后的SD 大鼠背部皮下注射形成皮丘，每組 10 只，持續(xù) 120 min 觀察皮丘是否消失或是出現(xiàn)過敏反應(yīng)，從而判斷電紡膜生理鹽水浸提液是否是過敏原。

1.2.6 MTT 檢測(cè) 電紡膜的細(xì)胞毒性通過 MTT法檢測(cè)。電紡膜 DMEM 浸提液的制備類似于電紡膜的生理鹽水浸提液的制備方法。具體來講，分別將 15 cm260Co 輻照滅菌后的單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜浸泡在 90 ml含有 10% FBS 的 DMEM 中，在 37 ℃ 環(huán)境下浸泡 24 h 后，制得單純 PLGA 電紡膜和電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的 DMEM 浸提液。取對(duì)數(shù)生長期的鼠 L929 細(xì)胞，0.25% 胰酶消化，計(jì)數(shù)，接種于 96 孔板中，使得每孔中包含 4000 個(gè)細(xì)胞和 0.3 ml 的含有 10% FBS 的 DMEM，在37 ℃ 的 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待完全貼壁后，分別換用單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的 DMEM 浸提液，以及作為對(duì)照組的含有 10% FBS 的 DMEM。于培養(yǎng)后 1～4 d，每天取出 1 個(gè) 96 孔板，吸去每孔中培養(yǎng)液，并用 PBS 溶液漂洗 2 遍，并加入 20 μl 的 5 mg/ml的 MTT 液，37 ℃ 培養(yǎng) 4 h 后，再加入 150 μl 的DMSO，充分振蕩 10 min 后，用酶聯(lián)儀在 570 nm的波長下測(cè)定光密度（OD）。

1.2.7 死/活細(xì)胞染色 通過死/活細(xì)胞染色檢驗(yàn)L929 成纖維細(xì)胞在電紡膜上的黏附率和生存情況。無菌條件下，將單純 PLGA 電紡膜和電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜剪成直徑為 1.4 cm的圓片，貼在 24 孔板底部；24 孔板底部不貼電紡膜的一組作為空白對(duì)照組，在空白對(duì)照組、單純PLGA 電紡膜和電紡雙層膜的 I 型膠原-PCL 層接種 L929 細(xì)胞。每組設(shè) 3 復(fù)孔，60Co 輻照滅菌。用 0.25% 胰酶將鼠 L929 成纖維細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、重懸，制備密度為 5 × 104/ml 的細(xì)胞懸液，在每孔中加入 2 ml 細(xì)胞懸液。37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔 1 天更換細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)第4 天，吸去每孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 溶液清洗L929 細(xì)胞/電紡膜復(fù)合物。將 L929 細(xì)胞/電紡膜復(fù)合物用濃度為 5 × 10-3mg/ml 的二乙酸熒光素（FDA）室溫、黑暗條件下孵育 5 min；吸去 FDA，PBS 溶液清洗 2 次；隨后，使用濃度為 5 ×10-3mg/ml 的碘化丙啶（PI）在室溫、黑暗條件下孵育 5 min；吸去 PI，PBS 溶液清洗 2 次后，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 L929 細(xì)胞在各組的黏附和活性情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS ver.17.0 分析處理，以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用 t 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0.05 認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表面性質(zhì)

掃描電鏡結(jié)果顯示，通過 18 000 r/min 高速轉(zhuǎn)動(dòng)的接收裝置，可以獲得電紡纖維有序排布的單純PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜。而且，兩種電紡膜均為多孔結(jié)構(gòu)（圖 1）。計(jì)算纖維直徑發(fā)現(xiàn)，單純 PLGA 電紡膜的纖維直徑為（3.736 ± 0.878）μm，而電紡 PLGA/ I 型膠原-PCL雙層膜中 I 型膠原-PCL 層的纖維直徑為（0.462 ±0.110）μm。通過接觸角的測(cè)量，發(fā)現(xiàn)單純 PLGA 電紡膜的接觸角為 121.13° ± 6.38°，為疏水性；電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的 I 型膠原-PCL 層的接觸角是 73.87° ± 4.48°，為親水性。

2.2 成分檢測(cè)

通過紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在單純 PLGA 電紡膜中，存在兩個(gè)特征吸收峰：1748 和 1085 cm-1（圖 2A）；在電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜中，除 3307、2944、1725 和 1167 cm-1四個(gè)特征吸收峰外，還存在許多相對(duì)矮小的吸收峰（圖 2B）。

圖1 電紡膜表面的結(jié)構(gòu)和接觸角（A：?jiǎn)渭?PLGA 電紡膜；B：電紡雙層膜的 I 型膠原-PCL 層）Figure 1 The surface structure and water contact angle of the electrospun membranes (A: Pure PLGA electrospun membrane;B: The type-I collagen-PCL layer of the double-layer electrospun membrane)

2.3 溶血試驗(yàn)

體外溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過 30 min 靜置和離心后，蒸餾水組中兔血發(fā)生了溶血現(xiàn)象，血色素在浸提液中呈現(xiàn)紅色；而在 0.9% 生理鹽水組、單純 PLGA 電紡膜組和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL雙層膜組中，兔血未發(fā)生溶血，紅細(xì)胞未破碎，并沉淀在試管底部，上清液中為無色透明的浸提液，未見明顯的紅色（圖 3）。

圖2 電紡膜的成分 （A：?jiǎn)渭?PLGA 電紡膜；B：電紡雙層膜）Figure 2 Ingredients of the electrospun membranes (A: Pure PLGA electrospun membrane; B: Double-layer electrospun membrane)

圖3 30 min 時(shí)溶血試驗(yàn)結(jié)果Figure 3 Results of hemolysis test at 30 min

2.4 熱原試驗(yàn)

未加入浸提液前，熱原管內(nèi)裝有熱原的檢測(cè)試劑（圖 4A）。加入單純 PLGA 電紡膜和電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜生理鹽水浸提液的熱原管在 1 h 靜置后，熱原管中試劑溶解，溶液清澈透明，未出現(xiàn)渾濁（圖 4B、C）。

2.5 致敏試驗(yàn)

分別將單純 PLGA 電紡膜和電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的生理鹽水浸提液注入鼠皮下，可見形成皮丘（圖 5A、B）。經(jīng)過 120 min 的持續(xù)觀察，并未見鼠皮膚出現(xiàn)過敏癥狀，皮丘消退完全（圖 5C、D）。

2.6 細(xì)胞毒性

圖4 1 h 時(shí)體外熱原試驗(yàn)結(jié)果（A：未使用的熱原管；B：?jiǎn)渭?PLGA 電紡膜浸提液；C：電紡雙層膜浸提液）Figure 4 Results of pyrogen test at 1 h (A: Unused pyrogen tubes; B: The leaching liquid of pure PLGA electrospun membrane; C: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane)

鼠 L929 細(xì)胞在含有 10% FBS 的 DMEM、單純 PLGA 膜的 DMEM 浸提液和 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的 DMEM 浸提液中均貼壁生長良好，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、三角形和圓形（圖 6A）。經(jīng)過MTT 處理，活細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶與MTT 反應(yīng)，形成藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，使 L929 細(xì)胞顯示出相應(yīng)顏色（圖 6B）。DMSO 溶解細(xì)胞中的甲瓚后，用酶標(biāo)儀在 570 nm 波長處測(cè)量 OD 值。結(jié)果顯示，L929 細(xì)胞在單純 PLGA 膜的 DMEM浸提液中的 OD570明顯小于 L929 細(xì)胞在含有10% FBS 的 DMEM（對(duì)照組）中的 OD570，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；L929 細(xì)胞在 PLGA/I型膠原-PCL 雙層膜浸提液中的 OD570與對(duì)照組的 OD570無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞ 0.05）（圖 6C）。

2.7 細(xì)胞黏附及活性觀察

圖5 致敏試驗(yàn)結(jié)果（A：0 min 單純 PLGA 電紡膜浸提液；B：0 min 電紡雙層膜浸提液；C：120 min PLGA 電紡膜浸提液；D：120 min 雙層膜浸提液）Figure 5 Results of sensitization test (A: The leaching liquid of PLGA electrospun membrane at 0 min; B: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane at 0 min; C: The leaching liquid of PLGA electrospun membrane at 120 min; D: The leaching liquid of double-layer electrospun membrane at 120 min)

圖6 MTT 檢驗(yàn)結(jié)果[A：鼠 L929 成纖維細(xì)胞（× 200）；B：MTT 處理后的鼠 L929 成纖維細(xì)胞（× 200）；C：MTT 處理后樣品的 OD570值（*P ＜ 0.05）]Figure 6 MTT test [(A: Murine L929 fibroblasts (× 200); B: Murine L929 fibroblasts after MTT disposing (× 200); C: The OD570values of samples after MTT dispose (*P ＜ 0.05)]

圖7 死/活細(xì)胞染色結(jié)果 （A：對(duì)照組；B：?jiǎn)渭?PLGA 電紡膜；C：電紡雙層膜內(nèi)層；D：L929 細(xì)胞的黏附數(shù)量；E：L929 細(xì)胞的生存率；標(biāo)尺 = 20 μm；*P ＜ 0.05）Figure 7 Results of dead/live cells staining (A: Control group; B: Pure PLGA electrospun membrane; C: The inner layer of the double-layer electrospun membrane; D: The quantity of adhering L929 cells; E: The survival rate of L929 cells; Scale = 20 μm;*P ＜0.05)

在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察 L929 細(xì)胞在培養(yǎng)第 4 天后黏附和活性情況，可見在單純PLGA 膜上鼠 L929 成纖維細(xì)胞的黏附率和細(xì)胞生存率都明顯少于對(duì)照組（P ＜ 0.05）；黏附在電紡PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜內(nèi)層上的鼠 L929 成纖維細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），細(xì)胞貼壁形態(tài)較差，少部分已經(jīng)呈現(xiàn)梭形，但細(xì)胞生存率與對(duì)照組相比無明顯差異（P ＞ 0.05），且與單純 PLGA 電紡膜上細(xì)胞生存率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.05）（圖 7）。

3 討論

肌腱缺少血液供應(yīng)，在發(fā)生斷裂后，其自愈過程偏向于瘢痕愈合，易出現(xiàn)腱周粘連?？山到飧叻肿硬牧闲再|(zhì)多樣，有良好的組織相容性，無毒性，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用很廣。通過靜電紡絲技術(shù)加工后，可降解高分子材料的性質(zhì)被極大地豐富，也為肌腱斷裂后預(yù)防腱周粘連帶來新的希望。

通過掃描電鏡的結(jié)果證實(shí)，靜電紡絲技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)纖維絲的有序排列；纖維絲的直徑可以達(dá)到幾百納米到幾微米的范圍；纖維絲之間存在良好的孔隙[5]。有序排列的結(jié)構(gòu)有利于誘導(dǎo)細(xì)胞按照相同方向生長[6]，這與肌腱內(nèi)部結(jié)構(gòu)是相似的（同向的I 型膠原的縫隙中包繞走行相同的細(xì)胞）。纖維絲可以達(dá)到一定的致密性，提高了材料的力學(xué)性能[7]，有利于電紡膜在機(jī)體局部穩(wěn)定存在。多孔結(jié)構(gòu)的電紡膜有利于腱周組織與肌腱之間的物質(zhì)交換，促進(jìn)肌腱愈合；同時(shí)，密集的孔隙起到濾網(wǎng)的作用，抑制腱周組織中成纖維細(xì)胞黏附在肌腱上形成粘連[8]。電紡膜的接觸角結(jié)果顯示，PLGA 的接觸角大于90°，是疏水性的；I 型膠原-PCL 的接觸角小于90°，是親水性的。細(xì)胞黏附和增殖的能力隨材料表面親水性的升高而增強(qiáng)[9]，即 PLGA 可能具有抑制細(xì)胞黏附能力，而膠原可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附和生長[10]。紅外光譜結(jié)果顯示，PLGA 中存在 -C=O 和C–O–C 官能團(tuán)[11]，而 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的紅外光譜顯示，其中除了 -C=O 和 C–O–C 官能團(tuán)，還有 N–H 鍵、肽鍵，這說明 I 型膠原已經(jīng)混合到電紡雙層膜中[9]，并沒有隨著電紡過程而丟失。

電紡膜的生理鹽水浸提液在溶血試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)和致敏試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明電紡雙層膜具有良好的組織相容性。而且其 DMEM 浸提液對(duì)鼠 L929 的增殖并沒有明顯的抑制作用[12]，表明電紡雙層膜沒有明顯的細(xì)胞毒性。通過 MTT 結(jié)果說明，單純 PLGA 電紡膜由于分解產(chǎn)物中含有乳酸，具有一定的細(xì)胞毒性；但加入 I 型膠原-PCL層后，細(xì)胞毒性消失，說明 I 型膠原-PCL 層不但沒有細(xì)胞毒性，更吸收了 PLGA 降解釋放的乳酸。死/活細(xì)胞染色結(jié)果可以明確顯示細(xì)胞與材料相互作用后的黏附和生存情況[13]。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，鼠 L929 成纖維細(xì)胞在單純 PLGA 電紡膜上黏附很差，而且細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組，而在 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜中，與對(duì)照組相比，L929 細(xì)胞黏附情況較低，但生存狀況稍好。這說明 PLGA 電紡層有抑制 L929 細(xì)胞黏附、生存的能力，而 I 型膠原-PCL 電紡層可以維持并促進(jìn)L929 細(xì)胞的生存。

總之，電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜的I 型膠原-PCL 層具有維持細(xì)胞活性潛能，而PLGA 層可以抑制成纖維細(xì)胞的黏附和生存，從而預(yù)防肌腱斷裂后腱周粘連的發(fā)生。電紡 PLGA/I 型膠原-PCL 雙層膜是未來肌腱斷裂領(lǐng)域理想的預(yù)防粘連材料。但是，本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了在靜態(tài)時(shí)電紡膜的性能，在人體真實(shí)生物力學(xué)的條件下，電紡膜預(yù)防腱周粘連和促進(jìn)肌腱愈合的能力還有待研究；而且，挑選或研發(fā)性能更佳的材料，在保證組織相容性的前提下提高電紡膜的效果，是本領(lǐng)域未來發(fā)展的重要方向。

[1]Meier Bürgisser G, Calcagni M, Müller A, et al.Prevention of peritendinous adhesions using an electrospun DegraPol polymer tube:a histological, ultrasonographic, and biomechanical study in rabbits.Biomed Res Int, 2014, 2014:656240.

[2]Carvalho FA, Kamper SJ.Effects of early rehabilitation following operative repair of Achilles tendon rupture (PEDro synthesis).Br J Sports Med, 2016, 50(13):829-830.

[3]Liu S, Qin M, Hu C, et al.Tendon healing and anti-adhesion properties of electrospun fibrous membranes containing bFGF loaded nanoparticles.Biomaterials, 2013, 34(19):4690-4701.

[4]Chen CH, Chen SH, Shalumon KT, et al.Prevention of peritendinous adhesions with elec-trospun polyethylene glycol/polycaprolactone nanofibrous membranes.Colloids Surf B Biointer-faces, 2015, 133:221-230.

[5]Gao S, Yuan Z, Guo W, et al.Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2017, 71:891-900.

[6]Cristallini C, Cibrario Rocchietti E, Gagliardi M, et al.Micro- and macrostructured PLGA/gelatin scaffolds promote early cardiogenic commitment of human mesenchymal stem cells in vitro.Stem Cells Int, 2016, 2016:7176154.

[7]Chen SH, Chen CH, Fong YT, et al.Prevention of peritendinous adhesions with electrospun chitosan-grafted polycaprolactone nanofibrous membranes.Acta Biomater, 2014, 10(12):4971-4982.

[8]Jiang S, Yan H, Fan D, et al.Multi-layer electrospun membrane mimicking tendon sheath for prevention of tendon adhesions.Int J Mol Sci, 2015, 16(4):6932-6944.

[9]Qian Y, Chen H, Xu Y, et al.The preosteoblast response of electrospinning PLGA/PCL nanof-bers: effects of biomimetic architecture and collagen I.Int J Nanomedicine, 2016, 11:4157-4171.

[10]Bellini D, Cencetti C, Sacchetta AC, et al.PLA-grafting of collagen chains leading to a biomaterial with mechanical performances useful in tendon regeneration.J Mech Behav Biomed Mater, 2016, 64:151-160.

[11]Kang BS, Choi JS, Lee SE, et al.Enhancing the in vitro anticancer activity of albendazole incor-porated into chitosan-coated PLGA nanoparticles.Carbohydr Polym, 2017, 159:39-47.

[12]Lu L, Guo QY, Yang QY, et al.Research of biological safty of porcine articular cartilage extracellular matrix derived scaffold.Chin Med Biotechnol, 2010, 5(1):19-23.(in Chinese)鹿亮, 郭全義, 楊啟友, 等.豬來源關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞支架的生物安全性研究.中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(1):19-23.

[13]Tawakoli PN, Al-Ahmad A, Hoth-Hannig W, et al.Comparison of different live/dead stainings for detection and quantification of adherent microorganisms in the initial oral biofilm.Clin Oral Investig,2013, 17(3):841-850.

The related research of the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane’s ability of preventing peritendinous adhesion

LI Peng-hao, LIU Shu-yun, WANG Ya-jie, QUAN Qi, WANG Yu, WANG Ai-yuan, PENG Jiang, XU Wen-jing, LU Shi-bi,GUO Quan-yi

ObjectiveTo study the structure, composition, hydrophile, histocompatibility and cytotoxicity of the electrospun PLGA/type-I collagen-PCL double-layer membrane, and evaulate the effect of the membrane in mouse’s L929 fibroblasts’ adhesion and activity.

MethodsPure PLGA electrospun membrane and PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane were produced via electrospinning.The membranes’ ultrastructure, ingredients and hydrophile were analyzed through scanning electron microscope,fourier transform infrared spectroscopy and water contact angle testing.The histocompatibility and cytotoxicity of the electrospinning membranes were verified through hemolysis test, pyrogen test, sensitization test and MTT test.In addition, mouse L929 fibroblasts were cultured on pure PLGA electrospun membrane and PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane for four days, and then stained with FDA/PI, and the condition of the cells’ adhesion and activity were observed and compared using confocal microscopy.

ResultsWell-ordered nano-scale to micron-scale fibers formed dense porous mesh structure in two kinds of electrospun membranes.And the results of hemolysis test, pyrogen test and sensitization test were negative.The values of OD570had no significant statistical difference between the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane’s DMEM leaching solution +L929 cells group and the normal culture solution +L929 cells group (P ＞ 0.05), determined by MTT test.In addition, on the fourth day, the mouse’s L929 fibroblasts’ proliferation and activity on the PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane was significantly higher than that of control group (P ＜ 0.05), and the mouse’s L929 fibroblasts’ proliferation and activity on the pure PLGA membrane was significantly lower than that of control group (P ＜ 0.05).

ConclusionThe PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane is made into dense porous mesh structure with abundant well-ordered nano-scale to micron-scale fibers.The electrospun membrane is histocompatible and nontoxic.Its PLGA layer could effectively inhibit the adhesion and activity of fibroblasts, and its type-I collagen-PCL layer could promote cell adhesion and survival.The PLGA/type-I collagen-PCL double-layer electrospun membrane has potential clinical application value for the prevention peritendinous adhesion after tendon rupture.

Tissue adhesions; Biocompatible materials; Collagen type I; Tendon rupture; Electrospinning

s:GUO Quan-yi, Email: doctorguo_301@163.com; LU Shi-bi, Email: shibilu301@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.001

國家自然科學(xué)基金（21134004）；國家高科技研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2012AA020502、2015AA020303）；骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2016年度科技創(chuàng)新基地培育和發(fā)展項(xiàng)目子專項(xiàng)（Z161100005016059）

300071 天津，南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院（李鵬昊、王亞潔）；100853北京，中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉舒云、全琦、王玉、汪愛媛、彭江、許文靜、盧世璧、郭全義）

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com；盧世璧，Email：shibilu301@yahoo.com.cn

2017-03-15

Author Affiliations:The College of Medicine, Nankai University, Tianjin 300071, China (LI Peng-hao, WANG Ya-jie); Institute of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital/Beijing Key Laboratory of Regenerative Medicine in Orthopaedics and Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, Beijing 100853, China (LIU Shu-yun, QUAN Qi, WANG Yu, WANG Ai-yuan, PENG Jiang, XU Wen-jing, LU Shi-bi, GUO Quan-yi)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):289-296