載辛伐他汀硫酸鈣對(duì)去卵巢大鼠脛骨骨缺損修復(fù)的影響

佘遠(yuǎn)時(shí) 韋敏祥 陳廣祥* 徐又佳

1．南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江蘇蘇州215002

2．蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江蘇蘇州215000)

骨折延遲愈合或骨不連是骨科醫(yī)師臨床上常常遇到的難題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約5% ～10%的骨折會(huì)發(fā)生骨折延遲愈合或骨不連接［1］，花費(fèi)巨額的醫(yī)療費(fèi)用，臨床上對(duì)于骨折不連接的治療通常是使用自體髂骨移植，然而，供區(qū)髂骨缺損及供區(qū)的疼痛是我們面臨的問(wèn)題。

BMP-2(bone morphogenetic protein-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)因其局部成骨活性，而被廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)，但是價(jià)格非常昂貴［2］，同時(shí)，BMP-2是異種蛋白，術(shù)中大劑量使用，其比較嚴(yán)重的并發(fā)癥是導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)［3］，傷口長(zhǎng)期滲出，因此，尋找不具有免疫原性同時(shí)具有成骨活性的小分子物質(zhì)是我們骨科醫(yī)生長(zhǎng)期探索的目標(biāo)。

辛伐他汀，臨床上常規(guī)使用的降血脂藥物，其作用機(jī)制是抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCoA)，從而降低肝臟膽固醇的合成［4］。Mundy 等［5］的研究首次表明，他汀類藥物具有激活成骨細(xì)胞，同時(shí)有學(xué)者［6］研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀同時(shí)也具有抑制破骨細(xì)胞作用，從而促進(jìn)骨合成代謝作用，促進(jìn)骨折愈合，而且，已有研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用辛伐他汀同樣具有上述作用，同時(shí)，由于口服辛伐他汀肝臟首過(guò)效應(yīng)明顯，生物利用度較低，僅有不到5%的藥物夠能進(jìn)入血液循環(huán)，骨骼中的濃度則更低，同時(shí)，在全身使用辛伐他汀，其副作用明顯［7］，局部應(yīng)用辛伐他汀顯得更有前景［8］。

目前使用的骨移植替代物中，硫酸鈣由于具有理想的生物相容性和骨誘導(dǎo)活性而在臨床上大量使用，同時(shí)，硫酸鈣作為理想的抗生素或生長(zhǎng)因子載體在文獻(xiàn)中也時(shí)有報(bào)道［9］。

據(jù)此，我們也嘗試將硫酸鈣作為辛伐他汀的載體，隨著硫酸鈣的吸收，辛伐他汀逐漸釋放于靶區(qū)，從而持久作用，治療骨質(zhì)疏松骨缺損模型。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)設(shè)備

硫酸鈣為Osteoset，(Wright醫(yī)療器械公司，美國(guó))，辛伐他汀(海正制藥有限公司)，10%水合氯醛，青霉素(華北制藥，中國(guó));Micro-CT機(jī)(Siemens公司，美國(guó));生物力學(xué)機(jī)(MTS公司，美國(guó))。QDR-4 500 W型雙能X線骨密度儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立及其分組:隨機(jī)分組對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2013年6月至2015年6月在蘇州大學(xué)骨科研究所完成。健康3月齡雌性SD大鼠48只(體重250～300 g)，購(gòu)自蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。質(zhì)量濃度10%的水合氯醛3.3 mL/kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥位固定、常規(guī)消毒后經(jīng)腹部正中切口進(jìn)入腹膜外，切除雙側(cè)卵巢;肌肉注射青霉素4萬(wàn)U，低鈣飲食，3個(gè)月后，隨機(jī)選取12只，使用QDR-4 500 W型雙能X線骨密度儀測(cè)量骨密度，其余隨機(jī)分為3組，分別為骨缺損組，硫酸鈣植骨組，載辛伐他汀硫酸鈣植骨組，每組12只。

1.2.2 辛伐他汀-硫酸鈣混合物的配置:將辛伐他汀溶于75%的酒精中，并制成濃度為200 mg/mL的辛伐他汀酒精溶液，20 mg的硫酸鈣，2.5 μL的辛伐他汀溶液，和5 μL的蒸餾水充分混合，攪拌15 s，然和將混合物轉(zhuǎn)入直徑3 mm，長(zhǎng)度3 mm的模具，最后，形成的每粒辛伐他汀-硫酸鈣混合物中含辛伐他汀0.5 mg。單純硫酸鈣顆粒作為對(duì)照組。γ射線輻照滅菌備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法:質(zhì)量濃度10%水合氯醛3.3 mL/kg體重腹腔內(nèi)注射麻醉后，置于無(wú)菌37℃熱墊上，取右脛骨上段縱行切口，約2 cm，切開(kāi)脛骨骨膜，并切除3 mm骨膜，用電動(dòng)擺鋸截?cái)嗝劰?，并在骨膜剝離處截除3 mm長(zhǎng)脛骨，骨缺損組直接縫合傷口，其余各組分別植入相應(yīng)的植骨材料，克氏針?biāo)鑳?nèi)固定脛骨，縫合肌膜(不縫合骨膜)，縫合傷口，術(shù)后給予患肢克氏針縫線綁扎外固定，肌肉注射4萬(wàn)U青霉素，自由攝食，自由活動(dòng)。

1.2.4 主要觀察指標(biāo):①大體觀察:定期觀察植入后每組大鼠的切口愈合及活動(dòng)情況。②Micro-CT檢查:在植入后8周，每組隨機(jī)處死4只大鼠，進(jìn)行Micro-CT掃描，觀察骨痂生長(zhǎng)情況，③組織學(xué)檢查:于植入后4周、8周，每組隨機(jī)處死4只大鼠的標(biāo)本用10%福爾馬林固定，并用pH7.4，40%的甲酸脫鈣4周，然后石蠟包埋，矢狀位進(jìn)行標(biāo)本切片，層厚7 μm，用 HE 染色，然后用光鏡(Olympus，日本東京)進(jìn)行觀察，參照Lane-Sandhu X射線和組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組動(dòng)物骨愈合程度進(jìn)行評(píng)分。④生物力學(xué)分析:將剩余的術(shù)后12周的標(biāo)本剔除軟組織，置于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨徑20 mm，以加壓桿中點(diǎn)在骨折端逐漸施加垂直壓力(2 mm/min)至出現(xiàn)骨折，記錄載荷-變形曲線，得出其最大抗壓載荷及最大彎曲位移。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0(SPSS公司，美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

48只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。去勢(shì)后，大鼠脛骨骨密度為31.5±5.12 mg/cm2，證實(shí)造模成功。術(shù)后各組動(dòng)物進(jìn)食與活動(dòng)正常，未發(fā)生切口紅腫、滲液。術(shù)后8周，處死動(dòng)物，骨缺損組及硫酸鈣組，骨折端無(wú)骨橋形成，骨折端充滿軟骨細(xì)胞及纖維組織，骨折未愈合，而載辛伐他汀硫酸鈣組，骨折遠(yuǎn)端與近端部分連接，骨折線消失，骨折端軟骨細(xì)胞為骨細(xì)胞代替，說(shuō)明骨折愈合。

2.2 放射學(xué)檢查

應(yīng)用小動(dòng)物Micro-CT，在相同條件下對(duì)小鼠脛骨進(jìn)行三維CT掃描重建，掃描的各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下:空間分辨率 18 μm，電壓 600 kV，電流 300 μA，掃描時(shí)間900 ms。將脛骨骨折端設(shè)置為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，ROI為圓柱體型，長(zhǎng)度為 3 mm，其縱軸與脛骨縱軸平行。掃描結(jié)束后，應(yīng)用Inveon research workplace分析軟件(Version 3.0，Siemens Medical Solutions，美國(guó))，根據(jù)文獻(xiàn)介紹的方法對(duì)骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。測(cè)量指標(biāo)包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、組織骨密度(tBMD)，骨小梁數(shù)量(Tb．N)①未植骨組:植入后8周，骨折端間隙清楚，未見(jiàn)連續(xù)骨小梁，骨缺損形成。②硫酸鈣組:植入后8周，骨折線模糊，異種骨顯示不清。③載辛伐他汀硫酸鈣組:植入后8周，骨折端骨小梁連續(xù)，形成骨性融合。植入后8周，ROI區(qū)內(nèi) BV/TV，tBMD，Tb．N，載辛伐他汀組較硫酸鈣組和未植骨組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。載辛伐他汀硫酸鈣組優(yōu)于后兩組。

2.3 組織學(xué)檢查

植入后4周(圖1)，8周(圖2)①未植骨組:骨折間隙存在，僅見(jiàn)纖維組織。②硫酸鈣組:新生骨逐漸成熟，但中間仍是纖維組織，硫酸鈣人工骨仍可見(jiàn)殘余;可見(jiàn)大量編織骨相互融合成片。③載辛伐他汀硫酸鈣組:硫酸鈣人工骨可見(jiàn)殘余顆粒，可見(jiàn)編織骨，硫酸鈣人工骨內(nèi)部可見(jiàn)纖維組織增生，血管長(zhǎng)入;逐漸出現(xiàn)編織骨，軟骨組織增多并開(kāi)始分化為骨組織，見(jiàn)新生骨逐漸改建，并在8周有大量編織骨相互融合成片。按照Lane-Sandhu組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，各時(shí)間點(diǎn)3組骨愈合程度組內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組間比較載辛伐他汀硫酸鈣組優(yōu)于硫酸鈣組和未植骨組。

2.4 生物力學(xué)測(cè)試

術(shù)后12周，生物力學(xué)測(cè)試顯示，三組最大載荷分別為:辛伐他汀硫酸鈣組103.96±6.32 N，硫酸鈣組81.16±6.67 N，未植骨組為9.42±5.51 N，辛伐他汀硫酸鈣組較硫酸鈣組和未植骨組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 術(shù)后4周骨折端組織學(xué)檢查(HE染色)a未植骨組;b硫酸鈣組;c載辛伐他汀硫酸鈣組Fig．1 Histological observation of fracture site in each group at 4 weeks after surgery(H＆E staining)(Non bone graft group);(Calcium sulfate group);(Simvastatin loaded calcium sulfate group)

3 討論

隨著人口的老齡化，骨折延遲愈合甚至骨不連給社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管不少促進(jìn)骨代謝的藥物得到研究并發(fā)展，但是還沒(méi)有被美國(guó)FDA允許獲得通過(guò)。辛伐他汀，作為臨床常用的降脂藥物，顯示了相當(dāng)?shù)墓谴x作用［5］。

硫酸鈣人工骨作為臨床上常用的骨移植替代材料，其應(yīng)用研究已有1個(gè)世紀(jì)之久，在骨科領(lǐng)域硫酸鈣具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):生物相容性好，其與骨界面間無(wú)明顯炎癥、異物反應(yīng)，未見(jiàn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集;可被破骨細(xì)胞吸收，體內(nèi)完全降解，其降解的時(shí)間為4～8周，與新骨形成的速度基本一致［10］。良好的空間充填作用;有一定支撐強(qiáng)度;有骨傳導(dǎo)作用和潛在的骨誘導(dǎo)活性，這可能與其降解過(guò)程中局部的微環(huán)境有關(guān)，硫酸鈣在體內(nèi)逐漸降解，局部可以形成高鈣環(huán)境，可為新生的骨組織提供鈣源，從而不同程度地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化。目前主要是作為抗生素載體和成骨因子載體［9］。Turner等［11］把含有10%硫酸妥布霉素的硫酸鈣片植入狗肱骨近端骨缺損內(nèi)，發(fā)現(xiàn)植入部位周圍組織硫酸妥布霉素濃度可以持續(xù)增高至14 d，一些動(dòng)物可以持續(xù)到28 d，4周時(shí)缺損區(qū)內(nèi)被新生骨組織填充。Beardmore等［12］成功應(yīng)用含10%硫酸妥布霉素的硫酸鈣片與脫鈣骨基質(zhì)聯(lián)合治療預(yù)防了羊脛骨近端污染骨折感染的發(fā)生，提示硫酸鈣促進(jìn)成骨但不妨礙抗生素防治感染的作用。本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后8周，影像學(xué)及組織學(xué)結(jié)果均顯示，硫酸鈣組較骨缺損組，骨痂形成量明顯增加。

圖2 術(shù)后8周骨折端組織學(xué)檢查(HE染色)a未植骨組;b硫酸鈣組;c載辛伐他汀硫酸鈣組Fig．2 Histological observation of fracture site in each group at 8 weeks after surgery(H＆E staining)(Nonbonegraftgroup);(Calciumsulfategroup);(Simvastatin loaded calcium sulfate group)

既往文獻(xiàn)報(bào)道，骨折端局部使用辛伐他汀對(duì)骨折愈合有促進(jìn)作用，目前比較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，辛伐他汀的促進(jìn)成骨作用與BMP-2的表達(dá)水平增加有關(guān)［5］。辛伐他汀是通過(guò)增加BMP-2啟動(dòng)因子的數(shù)量，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞合成BMP-2，BMP-2是公認(rèn)的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)因子，Sugiyama等［13］建立含人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)啟動(dòng)因子基因部分，并將其轉(zhuǎn)入人的骨肉瘤細(xì)胞，克隆培養(yǎng)，并向培養(yǎng)液中加入辛伐他汀，利用蟲(chóng)熒光素酶作媒介體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以大大增加BMP-2啟動(dòng)因子數(shù)量，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞合成BMP-2，因此認(rèn)為辛伐他汀對(duì)骨組織的作用是通過(guò)BMP-2的介導(dǎo)促進(jìn)骨生成。BMP-2具有募集間充質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)其向成軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化;同時(shí)可以協(xié)同其他調(diào)節(jié)因子參與骨組織形成［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后8周，載辛伐他汀硫酸鈣組Micro-CT片顯示骨折端骨折線較模糊，骨痂量增加，骨痂BMD明顯升高，組織學(xué)檢查鏡下編織骨已轉(zhuǎn)化為板層骨，骨小梁成熟度高，排列規(guī)整，術(shù)后12周時(shí)生物力學(xué)表現(xiàn)，載辛伐他汀硫酸鈣組，其最大載荷103.96±6.32 N，可以看出，辛伐他汀-硫酸鈣不僅可以顯著增加骨折愈合的數(shù)量和質(zhì)量，而且加速骨折愈合的速度，縮短骨折愈合時(shí)間，這為尋找用于臨床治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的他汀類藥物或擬似物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

由于辛伐他汀具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，加上硫酸鈣良好的藥物載體，局部使用可以減輕全身使用所引起的副作用，避免骨折端的感染發(fā)生，已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于局部使用辛伐他汀的用量問(wèn)題。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)0.5 mg辛伐他汀聯(lián)合膠原基質(zhì)局部應(yīng)用治療兔顱蓋骨骨缺損，術(shù)后14 d，其新骨形成較單獨(dú)使用膠原基質(zhì)組增加308%;Stein等［16］發(fā)現(xiàn)0.5 mg辛伐他汀可以產(chǎn)生最佳的骨生長(zhǎng)/炎癥比，從而認(rèn)為該量是理想的單次局部應(yīng)用劑量?；谶@些文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中，骨折端植骨使用的復(fù)合物也含0.5 mg辛伐他汀，術(shù)后，載辛伐他汀硫酸鈣組局部骨痂量增加，骨形成增加，局部最大載荷增加，說(shuō)明局部使用辛伐他汀硫酸鈣具有良好的骨形成調(diào)節(jié)作用，此外，本研究未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。

綜上所述，載辛伐他汀硫酸鈣具有與自體骨移植相似的骨修復(fù)能力，可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，促進(jìn)骨折愈合，但實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有進(jìn)行深入探討辛伐他汀在顆粒中的分布、釋放情況，這也是本次實(shí)驗(yàn)的局限性。