影響吡羅紅甲基綠染液染色效果的探究實驗

尚啟亮 黃雅婷 龔羚云

(安徽省合肥市第一中學 230601)

“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”是高中生物學教學中一個重要的實驗，人教版教材選擇口腔上皮細胞為例介紹了實驗的過程。同時，也給出了兩幅實驗結(jié)果圖，分別是口腔上皮細胞染色結(jié)果圖和洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞染色結(jié)果圖。從圖中可以看到細胞核區(qū)域為綠色，細胞質(zhì)區(qū)域為紅色。但是，在中學實驗教學中，嚴格按照教材實驗的配方和步驟操作，實驗結(jié)果并不像教材呈現(xiàn)得那么明顯。其中，細胞質(zhì)較易看到紅色，但細胞核區(qū)域并沒有出現(xiàn)教材呈現(xiàn)的綠色，而是呈現(xiàn)藍色或藍綠色。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，甲基綠和吡羅紅混合染液染色的原理主要有兩個方面：①染色與聚合程度有關(guān)，甲基綠與聚合程度高的DNA優(yōu)先結(jié)合呈綠色，吡羅紅優(yōu)先與RNA結(jié)合呈紅色；②甲基綠和吡羅紅在水中電離后都帶正電荷，但甲基綠堿性較吡羅紅要強，甲基綠易與細胞核極性吸附而染色，吡羅紅易與細胞質(zhì)吸附結(jié)合。因此，pH過低甲基綠染色效果差；pH過高吡羅紅染色效果不良[1，2]。由染色原理可知，pH對染色結(jié)果有影響，考慮到不同材料細胞內(nèi)pH可能存在差別，不同的材料對染色效果可能也存在差別。在以下探究實驗中，為了不改變pH，省略了鹽酸水解這一步驟。

1 實驗材料

1.1 試劑 取吡羅紅甲基綠粉1 g，加入100 mL蒸餾水中溶解，放入棕色瓶中保存，制成A液。取11.55 mL冰醋酸稀釋至1000 mL，制成0.2 mol/L的醋酸溶液；稱取27.2 g三水合醋酸鈉用水溶解，定容1000 mL，制成0.2 mol/L的醋酸鈉溶液，并按表1將醋酸和醋酸鈉混合，配置成不同pH的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，作為B液。

表1 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(B液)的配制

1.2 材料 本實驗采用洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞和鴨跖草(鴨跖草科，易培養(yǎng)，取材方便)葉下表皮細胞。

2 方法步驟

2.1 染液 使用前，將A液和B液(不同pH)按1:4的比例配制成不同pH的吡羅紅甲基綠染色劑。

2.2 染色 取洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞、鴨跖草葉下表皮細胞在不同pH的混合染色液中分別染色5 min、10 min和15 min。

2.3 制片 將染色過的表皮細胞放在相應(yīng)pH的緩沖液中漂洗，洗去浮色；在載玻片上滴1滴相應(yīng)pH的緩沖溶液，制成臨時裝片。

2.4 觀察 先在低倍鏡下觀察，看細胞核與細胞質(zhì)的顏色，找到細胞核呈典型綠色的細胞后移到視野中央，再換成高倍鏡繼續(xù)觀察。

3 實驗結(jié)果

3.1 pH對染色效果的影響 采用洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞作為實驗材料，染色15 min的條件下，當細胞質(zhì)在pH為3.6時，紅色最明顯。在其他pH條件下，在低倍鏡下也可明顯觀察到細胞質(zhì)呈紅色，細胞核的核仁區(qū)域也被染成紅色。當細胞核在pH值為4.8和5.2時，綠色比較明顯。在其他pH條件下，細胞核多為藍色和藍綠色。

采用鴨跖草葉下表皮細胞作為實驗材料時，當pH為4.0、4.4、4.8和5.2時，細胞核均可看到明顯的綠色。當pH為3.6和5.6時，細胞核染色偏藍。

3.2 染色時間對染色效果的影響 在pH為5.2的條件下，采用洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞作為實驗材料時，染色5 min、10 min和15 min條件下，細胞質(zhì)和細胞核的核仁區(qū)域都被染成紅色，區(qū)別不大。細胞核的著色情況存在區(qū)別，染色15 min綠色最為明顯。當染色時間延長為90 min時，洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞的細胞核區(qū)域顏色會變深，呈現(xiàn)偏藍和偏紫的情況，但對細胞質(zhì)和核仁影響不大。

采用鴨跖草葉下表皮細胞作為實驗材料時，當pH為4.0～5.2條件下，染色5 min與染色10 min、染色15 min細胞核區(qū)域均表現(xiàn)為明顯的綠色。

4 討論與建議

4.1 材料選擇對染色效果的影響 實驗表明：與洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮細胞相比，采用鴨跖草葉下表皮細胞作為實驗材料，細胞核區(qū)域更容易觀察到典型的綠色，并對緩沖溶液的pH要求不高。另外，用不同材料進行細胞核染色結(jié)果相差較大，實驗還曾選用鴨跖草科的植物飯包草、堇菜科的植物堇菜及動物材料豬肝等，發(fā)現(xiàn)鴨跖草科的鴨跖草和飯包草效果都較明顯，而其他材料效果一般。因此，在實驗前，就地多選取幾種實驗材料進行預(yù)實驗，找出較好的實驗材料進行實驗，建議可優(yōu)先考慮鴨跖草科的植物。

4.2 省略鹽酸水解，選擇適宜的pH 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH范圍有限制，若采用磷酸鹽緩沖液，當pH為2.2～3.0時，細胞核區(qū)域呈現(xiàn)明顯的藍色。8 %的鹽酸為強酸，水解后雖有漂洗，但無法將細胞內(nèi)的鹽酸徹底去除，這也可能是按教材步驟操作，細胞核區(qū)域呈現(xiàn)藍色的原因。如果在實驗操作過程中省略用8 %鹽酸水解的步驟，一方面可以節(jié)約時間，另一方面也可減少對pH的影響。pH對染色效果的影響還因材料的不同而有區(qū)別，可在實驗操作前，配置不同pH的緩沖液做預(yù)實驗，根據(jù)染色結(jié)果，選擇恰當pH的緩沖液。

4.3 合理利用染色時間 實驗表明：染色15 min結(jié)果依然較明顯。在實驗課堂上，教師可以利用這個時間間隙對實驗進行講解和引導。