真菌毒素免疫檢測技術(shù)的研究進展

王文珺+桑華春

真菌毒素的特性及起源

真菌毒素，又稱霉菌毒素，是指霉菌在其所污染食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，可通過進食進入人或動物體內(nèi)，引起人或動物的急性或慢性中毒，進而損害機體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織等。致癌性是真菌毒素對機體最嚴重和最普遍的危害。真菌毒素可在農(nóng)作物生長或收獲時形成，也會因貯存條件的不適宜而產(chǎn)生。濕度或溫度高的環(huán)境通常有利于糧食和飼料中霉菌的生長及其毒素的產(chǎn)生。真菌毒素最早于1960年被發(fā)現(xiàn)，當時英國有10萬只火雞死于該種疾病，后來鴨子也被波及?？茖W(xué)家很快在花生餅飼料中發(fā)現(xiàn)了“罪魁禍首”：一種真菌產(chǎn)生的毒素，隨后被命名為“Aflatoxin”。從此以后，科學(xué)家投入了大量的時間和精力研究真菌毒素，并發(fā)現(xiàn)其主要包括以下幾個特點：

①低分子化合物：真菌毒素都是分子量小于1000的小分子化合物；

②對溫度非常穩(wěn)定，即使加熱到340℃也不會被分解和破壞；

③抗化學(xué)生物制劑及物理的滅活作用；

④具有廣泛的中毒效應(yīng)；

⑤結(jié)構(gòu)特異性：分子結(jié)構(gòu)不同，毒性差異很大。例如黃曲霉毒素B1是毒性最強的真菌毒素，比砒霜毒性還強，但是僅改變其分子結(jié)構(gòu)中的一個化學(xué)鍵，它的毒性就會顯著下降。其實還有一個特點需要特別強調(diào)，就是真菌毒素在樣品中的分布是不均勻的，因此分析過程中的取樣方式和取樣量非常重要，往往能夠決定結(jié)果誤差的范圍。

目前，己確定的真菌毒素有400多種，常見毒素包括：黃曲霉毒素（AF，包括B1、B2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮/醇（ZEN）、赭曲毒素（OTA）、T2毒素、嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）、伏馬毒素（FM，包括B1、B2、B3）等。其中黃曲霉毒素B1被認為是毒性最強的真菌毒素，也是糧食和飼料監(jiān)測的重點。

真菌毒素的危害

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，每年全世界大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素污染，其中約2%因污染失去價值，引起的損失達千億美元。飼料及原料（糧食）中的真菌毒素污染對畜牧業(yè)影響巨大，美國因真菌毒素造成的損失達到14.4億美元/年，我國損失則更大，達到150億美元/年。由真菌毒素污染導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問題已經(jīng)引發(fā)社會的廣泛關(guān)注，真菌毒素是導(dǎo)致糧食和飼料污染的重要原因，如果動物食用了被真菌毒素污染的飼料，也可能造成動物源性食品的污染。例如，奶牛吃了被黃曲霉毒素B1污染的飼料，它所產(chǎn)的牛奶中就會含有黃曲霉毒素M1。不僅如此，被黃曲霉毒素污染的飼料還會影響食用動物的健康。仍以奶牛為例，真菌毒素通過改變機體的新陳代謝和行為，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，因飼喂受真菌毒素污染的飼料而造成產(chǎn)奶量減少是奶牛養(yǎng)殖場的常見現(xiàn)象。對奶牛產(chǎn)奶造成不利影響的真菌毒素主要是黃曲霉毒素和不同種類的鐮刀菌毒素。黃曲霉毒素損害奶牛的肝臟組織，破壞肝臟功能，嚴重情況下會導(dǎo)致奶牛死亡。除此之外，黃曲霉毒素對豬的胚胎致死率高，致畸性強，易導(dǎo)致胚胎早期死亡被吸收、流產(chǎn)、弱仔，從而降低繁殖率。

概括來說，真菌毒素的危害性主要具有以下特點：其一為普遍性，即在谷物生產(chǎn)、儲藏、加工階段已經(jīng)被感染，尤以玉米更為嚴重。二是隱蔽性—感官難以判斷，除非已經(jīng)發(fā)生顏色、氣味等變化，隱蔽性毒素無法用常規(guī)物理方法判斷。第三為微量性：低劑量即可導(dǎo)致畜禽或人患病。第四，蓄積性：一些真菌毒素如玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等不易排出體外，會在體內(nèi)蓄積達到中毒劑量。最后是協(xié)同性，表現(xiàn)為混合污染，協(xié)同作用，加大對人類、畜禽機體和生產(chǎn)性能的危害。

為了消除真菌毒素的危害，目前人們主要從兩個方面著手：一是建立準確、快速、靈敏、多目標物的檢測技術(shù)；二是研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素的脫毒技術(shù)的研究。

國內(nèi)市場真菌毒素快檢產(chǎn)品現(xiàn)狀

從“十五”起，食品質(zhì)量安全問題就已引起了國家政府的高度重視，政府的重要工作會議都強調(diào)了食品質(zhì)量安全的重要性。2015年10月1日實施的新《食品安全法》，加大了對食品質(zhì)量安全的監(jiān)管力度和懲治力度。同時，新《食品安全法》第一百一十二條規(guī)定：縣級以上人民政府食品藥品監(jiān)督管理部門在食品安全監(jiān)督管理工作中可以采用國家規(guī)定的快速檢測方法對食品進行抽查檢測。對抽查檢測結(jié)果表明可能不符合食品安全標準的食品，應(yīng)當依照本法第八十七條的規(guī)定進行檢驗。抽查檢測結(jié)果確定有關(guān)食品不符合食品安全標準的，可以作為行政處罰的依據(jù)。以上，從法律層面肯定了快檢可以作為一種執(zhí)法手段，這也就對快檢技術(shù)及產(chǎn)品提出了更高的要求。

經(jīng)過我國政府十余年的努力，國產(chǎn)食品中的化學(xué)污染和殘留已經(jīng)得到有效控制，但是真菌毒素污染問題仍較為突出。真菌毒素對糧食、飼料、奶、肉、蔬菜、水果的危害已經(jīng)到達令人觸目驚心的程度，對真菌毒素的監(jiān)測也已經(jīng)引起國家相關(guān)部門的充分重視。在國家糧食局、農(nóng)業(yè)部、國家食藥總局等部門的監(jiān)控計劃中，都把食品中真菌毒素列為監(jiān)測重點。2017年3月17日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《食品安全國家標準食品中真菌毒素的限量》（GB 2761-2017）替代了GB 2761-2011?？萍疾俊笆濉眹铱萍贾雾椖恳舶颜婢舅貦z測及脫毒技術(shù)列為資助重點，為控制真菌毒素的社會危害提供技術(shù)保障。

目前，國內(nèi)市場真菌毒素的免疫快檢方法主要包括膠體金檢測卡、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和時間分辨熒光免疫檢測卡等，相關(guān)的快檢儀器設(shè)備有酶標儀、膠體金讀卡儀和時間分辨熒光檢測儀。此外，還包括一些前處理方法和設(shè)備，如凈化柱、免疫親和柱等。國內(nèi)有上百家食品安全快檢公司能生產(chǎn)檢測真菌毒素的快檢產(chǎn)品，但產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，高質(zhì)量的產(chǎn)品相對較少，造成的現(xiàn)實情況是真菌毒素快檢產(chǎn)品在我國市場還無法完全實現(xiàn)本土化。一些權(quán)威檢測和監(jiān)管部門依然比較認同美國羅馬（Romer）公司和Charm公司的產(chǎn)品。一個普遍的觀點是，雖然國外產(chǎn)品價格比國內(nèi)產(chǎn)品高50%甚至100%，但是其產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、準確度高。事實上，國內(nèi)自主研發(fā)的產(chǎn)品在質(zhì)量上已經(jīng)有所突破，在一些官方組織的產(chǎn)品比對實驗中，甚至出現(xiàn)國產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量超過國外產(chǎn)品的情況，這可以說是國內(nèi)真菌毒素快檢行業(yè)的一大進步。但大的技術(shù)方向還是步國外技術(shù)的后塵，依然是模仿+超越的模式。其實從樣本適用性和價格的角度講，國內(nèi)產(chǎn)品應(yīng)該具有明顯的競爭優(yōu)勢。這就需要國內(nèi)的企業(yè)在質(zhì)量上把關(guān)，提高核心技術(shù)優(yōu)勢，對真菌毒素的性質(zhì)、危害及在糧食及飼料中的代謝動力學(xué)有充分了解，提早在產(chǎn)品研發(fā)上攻關(guān)，盡早完成市場培育，推動企業(yè)的核心競爭力，實現(xiàn)我國自主研發(fā)的產(chǎn)品對國內(nèi)市場的覆蓋，從而保障我國人民群眾的生命財產(chǎn)安全，實現(xiàn)對糧食、飼料、奶、肉及水果、蔬菜的有效監(jiān)管，維護我國對外貿(mào)易活動的正常進行。

真菌毒素免疫檢測的關(guān)鍵技術(shù)點

技術(shù)創(chuàng)新點

目前，國內(nèi)市場真菌毒素快檢產(chǎn)品主要是基于抗原、抗體（不排除使用受體和配體）特異性反應(yīng)的免疫快檢產(chǎn)品。產(chǎn)品研發(fā)中的重點和難點問題主要集中在原材料的質(zhì)量、產(chǎn)品的適用性、產(chǎn)品的性能、重點監(jiān)測物這4個方面。

第一，抗原、抗體等原材料的質(zhì)量。要了解原材料的重要性，需先了解抗體制備流程。真菌毒素屬于小分子物質(zhì)（分子量<1000），其本身不具有免疫原性，需要與大蛋白偶聯(lián)才能對機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。如何將小分子的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成免疫原？首先需要合成一個帶有活性基團（一般是-COOH和-NH2）的碳鏈長臂，即半抗原。半抗原位點的選擇與抗體的特異性關(guān)系極大，其與大的蛋白結(jié)合（比如牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA等）可獲得免疫原和包被原。用免疫原免疫動物待效價和特異性達到要求，取動物抗血清獲得多克隆抗體，如果不采血而是進一步取動物脾臟細胞、融合、克隆、培養(yǎng)上清和打腹水等步驟，將獲得單克隆抗體。免疫動物的類型和免疫方法與抗體的親和力關(guān)系較大，抗體的親和性是抗體質(zhì)量的一個重要參數(shù)。本項目研究中包括但不限于以下3點要特別關(guān)注—半抗原偶聯(lián)的位點、免疫方式、單抗制備過程中的克隆和篩選。

在真菌毒素抗體制備方面，國內(nèi)一些高校、科研機構(gòu)及規(guī)模較大的食品安全檢測試劑公司都在開展相關(guān)工作，其中不乏一些高特異性（或廣譜性）、高親和性的抗體。而且一些技術(shù)申請了國內(nèi)專利，甚至有些科研機構(gòu)抗體的制備方法還申請了國外專利，并把抗體賣到了國外多個國家和地區(qū)。好的原料來源是優(yōu)質(zhì)快檢產(chǎn)品的充分必要條件，而高質(zhì)量、穩(wěn)定來源的抗原抗體是目前快檢產(chǎn)品研發(fā)公司面臨的最主要問題之一?？贵w的特異性與匹配的抗原關(guān)系極大，穩(wěn)定的抗原制備流程也是必須關(guān)注的重點。

第二，快檢產(chǎn)品的適用性。國內(nèi)真菌毒素快檢產(chǎn)品沒有覆蓋國內(nèi)市場的原因是產(chǎn)品質(zhì)量不能完全滿足檢測要求，或者說國外的產(chǎn)品能更好地滿足檢測要求（準確性、便捷性）。比如Charm的膠體金檢測卡，一條C線，兩條T線，能夠通過讀卡儀實現(xiàn)準確定量。而國內(nèi)膠體金檢查卡，基本以定性檢測為主，只有極少數(shù)廠家推出了膠體金定量檢測產(chǎn)品，并將檢測結(jié)果數(shù)據(jù)化，與食品安全的大數(shù)據(jù)管理相符合。包括北京智云達科技股份有限公司在內(nèi)的少數(shù)公司選擇了從另一個技術(shù)角度解決檢測卡的定量問題，即時間分辨熒光檢測技術(shù)。時間分辨熒光檢測卡，檢測的激發(fā)光在300～400nm之間，而發(fā)射光在600～650nm之間，受外部干擾少，所以穩(wěn)定性較好，可更高效的實現(xiàn)定量檢測。此外，熒光信號比膠體金的可見光信號更強，提高了檢測技術(shù)的靈敏度，進而簡化了前處理過程。

第三，產(chǎn)品的性能。在保證靈敏度的前提下，產(chǎn)品的性能涉及到兩方面內(nèi)容，即檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。在產(chǎn)品研發(fā)過程中，有幾個節(jié)點非常重要：第一節(jié)點是樣本的選擇，即樣本的適用性。檢測樣本是產(chǎn)品研發(fā)過程中必然要進行的一個過程，而且產(chǎn)品的最終驗證也要落實到樣本檢測上。首先，要有通過國標方法確定陰性和陽性的樣本。一些快檢試劑研發(fā)公司為了壓縮研發(fā)時間，對于樣本不愿意進行足夠的投入，把從超市買來的樣本默認為陰性樣本，姑且不說超市的樣本是否真的是陰性樣本，連樣本在存儲過程中真菌毒素的變化情況都有待確證。第二節(jié)點是檢測體系的穩(wěn)定性。國外真菌毒素快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性優(yōu)于國內(nèi)產(chǎn)品，包括檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和有效保存期內(nèi)的穩(wěn)定性。批間差是現(xiàn)有國內(nèi)免疫產(chǎn)品尤其是真菌毒素膠體金檢測卡的主要瓶頸，這是產(chǎn)品性能方面關(guān)注的第二個重要方面。