闌尾周圍膿腫中檢出未分類新型鏈球菌1例

楊銳，屈平華，陳東科

(1.張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，甘肅張掖 734000；2.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州 510006；3.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

·案例分析·

闌尾周圍膿腫中檢出未分類新型鏈球菌1例

楊銳1，屈平華2，陳東科3

(1.張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，甘肅張掖 734000；2.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣州 510006；3.北京醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

闌尾；膿腫；新型鏈球菌

隨著16S rRNA基因序列分析為代表的分子生物學技術(shù)在細菌分類鑒定中的廣泛應用，鏈球菌(Streptococcus)的菌群劃分發(fā)生了很大變化。原先一些鏈球菌群先后被劃分出，獨立成屬，如腸球菌屬、孿生球菌屬、乳球菌屬、乏養(yǎng)球菌屬、顆粒鏈菌屬等；同時，一些新的菌種不斷被分離、命名和補充增加，成為鏈球菌屬的新成員[1]，如中華鏈球菌(S.sinesis)[2]、香港鏈球菌(S.hongkongensis)[3]。我們于2013年3月自1例急性化膿性闌尾炎患者闌尾周圍膿腫中分離出1株鏈球菌，經(jīng)16S rRNA基因測序，初步鑒定為一未分類的新型鏈球菌，報道如下。

1 病歷摘要

患者，男，50歲。2013年2月因右下腹疼痛，伴惡心、嘔吐數(shù)次，當?shù)蒯t(yī)院診斷為闌尾炎，輸液治療后疼痛緩解(具體藥物不詳)。2013年3月4日，右下腹疼痛再次發(fā)作，且逐漸加重，伴惡心，無嘔吐，以“慢性闌尾炎急性發(fā)作”收入本院?；颊哂新宰枞苑尾?、肺結(jié)核、肺大泡、胸膜炎、冠心病等基礎(chǔ)疾病。入院查體：體溫38.6 ℃，脈搏72次/分鐘，呼吸20次/分鐘，血壓120/80 mmHg；腹部平坦，未見腹壁靜脈曲張，未見腸型及蠕動波，腹軟，右下腹壓痛明顯，反跳痛存在，無肌緊張，未扣及包快，肝脾肋下未觸及，Murphy征陰性；肝腎區(qū)扣擊痛陰性，移動性濁音陰性，腸鳴音正常，結(jié)腸充氣試驗陰性，腰大肌試驗陰性，閉孔內(nèi)肌試驗陰性。血液常規(guī)檢查：WBC 7.5×109/L，N 77.8%，L 12.8%，M 9.4%。腹部超聲檢查提示：右下腹混合性包塊。急診在硬膜外麻醉下行闌尾切除術(shù)，術(shù)中見闌尾發(fā)黑，壞疽，周圍形成膿腫，抽吸膿液做細菌培養(yǎng)，檢出大腸埃希菌和鏈球菌各1株。術(shù)后給予頭孢吡肟抗感染治療，并止血、補液對癥治療，7 d后患者切口愈合良好出院。

2 細菌培養(yǎng)鑒定

無菌抽取膿汁接種哥倫比亞血瓊脂平板(英國Oxoid公司)和麥康凱平板(英國Oxoid公司)，其中哥倫比亞血瓊脂平板放入CO2產(chǎn)氣袋(法國生物梅里埃公司)中，35 ℃培養(yǎng)24 h后觀察到2種菌落：一種為濕潤、扁平、灰白色的直徑約2 mm的大菌落，涂片革蘭染色(珠海貝索公司)鏡檢為革蘭陰性桿菌；另一種為圓形突起、邊緣整齊、半透明、濕潤、易乳化、β溶血、菌落直徑約0.5 mm的小菌落，涂片革蘭染色為革蘭陽性球菌，呈成雙或成短鏈排列。麥康凱平板上則僅生長一種菌落，其發(fā)酵乳糖，呈桃紅色，菌落直徑和形態(tài)與哥倫比亞血瓊脂平板上生長的陰性桿菌一致。革蘭陰性桿菌經(jīng)法國生物梅里埃公司ID 32E試條鑒定為大腸埃希菌，生物編碼為54465743420，鑒定百分率99.9%，T值為0.93。革蘭陽性球菌觸酶試驗陰性、吡咯烷酮芳基酰胺酶(PYR)試驗陽性、CAMP試驗陰性、精氨酸水解試驗陽性、V-P試驗陽性、6.5%NaCl肉湯生長、桿菌肽耐藥、復方磺胺甲噁唑敏感。采用法國生物梅里埃公司Lancefield血清F群凝集，Rapid ID 32 Strep條鑒定為豕鏈球菌，生物編碼3732305110，鑒定百分率為99.9%，T值為0.7。在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基(杭州天和公司)中呈顆粒狀沉淀生長，上層澄清。采用16S rRNA基因通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′和1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增[4]。PCR產(chǎn)物送上海英駿廣州分公司進行測序，獲得>1 400 bp的有效序列(部分峰圖見圖1)。測序序列在EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon/)進行比對，結(jié)果顯示該菌與假豕鏈球菌、香港鏈球菌和豕鏈球菌的相似度較高，分別為98.0%、97.5%和97.3%。按Stackebrandt等[5]2006年修訂的16S rRNA基因低于99.2%的新分類單元標準，初步鑒定為一未分類的新菌種。

圖1 16S rRNA部分測序結(jié)果

3 討論

鏈球菌屬內(nèi)種別多、分類方法多，種間鑒別較復雜，傳統(tǒng)的鑒定方法技術(shù)復雜，影響因素多，商品化鑒定系統(tǒng)和儀器有時難以將菌種準確區(qū)分鑒定，尤其一些不常見和新型菌株，僅依靠形態(tài)學和生化反應等表型特征難以準確識別和鑒定。以16S rRNA基因測序技術(shù)為代表的分子鑒定方法是傳統(tǒng)表型鑒定方案之外的常用替代方案，特別是在臨床不常見菌、苛養(yǎng)菌和新發(fā)現(xiàn)的細菌鑒定中[6]。16S rRNA基因測序鑒定是在細菌進化和親緣關(guān)系基礎(chǔ)上對已有菌種進行的一種序列相似性分析，其相對于傳統(tǒng)表型分析方法而言更具客觀性和準確性。目前，針對臨床細菌和真菌的基因測序鑒定，美國臨床實驗室和標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已制定了相應的指南文件[7]。隨著國內(nèi)16S rRNA基因測序技術(shù)的迅速開展和普及，國內(nèi)臨床微生物室人員亦應認真對待少見的觸酶陰性革蘭陽性球菌，并結(jié)合16S rRNA基因測序技術(shù)做出正確的分類鑒定。

[1]陳東科, 孫長貴. 實用臨床微生物學檢驗圖譜[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 194-208.

[2]Woo PC, Tam DM, Leung KW,etal.Streptococcussinensissp. nov., a novel species isolated from a patient with infective endocarditis[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(3): 805-810.

[3]Lau SK, Curreem SO, Lin CC,etal.Streptococcushongkongensissp. nov.isolated from a patient with an infected puncture wound and from a marine flatfish[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2013, 63(Pt 7): 2570-2576.

[4]屈平華, 趙紅波, 黃彬, 等. 衛(wèi)生部微生物室間質(zhì)評1012菌的鑒定與放線菌屬的系統(tǒng)發(fā)生分析[J].中華檢驗醫(yī)學雜志, 2011, 34(9): 814-819.

[5]Stackebrandt E, Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards[J]. Microbiol Tod, 2006, 33(4): 152-155.

[6]陳茶, 屈平華, 顧全, 等. 基于細菌16S rRNA 基因的PCR 擴增與測序分析在臨床不常見菌鑒定中的應用[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志, 2012, 35(7): 612-619.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing. CLSI document MM18-A[S]. Wayne, PA: CLSI, 2008.

(本文編輯：周萬青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.21

楊銳，1972年生，男，副主任技師，大學本科，主要從事臨床微生物檢驗工作。

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2017-03-17)