頻繁急性加重型慢性阻塞性肺病患者血漿血管內(nèi)皮微粒水平分析

姜敏，王晶，張洪平，田戈，伊合帕爾·吐依洪，高振，李風(fēng)森

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，新疆呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

頻繁急性加重型慢性阻塞性肺病患者血漿血管內(nèi)皮微粒水平分析

姜敏，王晶，張洪平，田戈，伊合帕爾·吐依洪，高振，李風(fēng)森

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，新疆呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

目的 探討慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)頻繁急性加重型患者血漿中血管內(nèi)皮微粒(vascular endothelial microparticles, EMPs)的變化情況。方法 納入COPD頻繁急性加重型患者59例，COPD非頻繁急性加重型患者56例，健康人對(duì)照46例。用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)無(wú)血小板血漿中血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM)、黑素瘤細(xì)胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule, MCAM)、E選擇素(E-selectin)的水平。用ELISA法檢測(cè)各組IL-8水平，用速率散射免疫比濁法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)的含量，分析其與EMPs的相關(guān)性。結(jié)果 COPD頻繁急性加重型患者和非頻繁急性加重型患者血漿中VE-cadherin、PECAM、MCAM、E-selectin微粒的數(shù)目均顯著高于健康人對(duì)照組(P均<0.01)，COPD頻繁急性加重型患者E-selectin的含量高于COPD非頻繁急性加重型(P<0.05)，且E-selectin與IL-8和CRP顯著正相關(guān)。結(jié)論 COPD頻繁急性加重型血漿中E-selectin可作為判斷COPD頻繁急性加重型的生物標(biāo)記物。

慢性阻塞性肺??；頻繁急性加重型；血管內(nèi)皮微粒

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)性疾病，呈不可逆進(jìn)行性發(fā)展[1-2]。COPD病程分期分為穩(wěn)定期和急性加重期[3]。盡管COPD的發(fā)病機(jī)制研究尚不明確，但研究表明COPD的發(fā)生和發(fā)展與肺部炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡均能導(dǎo)致肺部血管內(nèi)皮損傷，產(chǎn)生內(nèi)皮微粒(endothelial micropartieles，EMPs)，EMPs是內(nèi)皮功能紊亂的標(biāo)志物[5-6]，同時(shí)又能促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)、血管損傷和細(xì)胞凋亡[7]。EMPs根據(jù)細(xì)胞表面特異性抗原可分為血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM)、黑素瘤細(xì)胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule，MCAM)、E選擇素(E-selectin)[8]。研究顯示VE-cadherin、PECAM和E-selectin在COPD穩(wěn)定期和急性加重期較正常組升高[5]。但隨著對(duì)COPD研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)表型識(shí)別有助于反映COPD的異質(zhì)性，使得COPD的研究更趨全面和深入。COPD根據(jù)表型可分為3種表型：頻繁急性加重型、COPD-哮喘重疊型和肺氣腫-氣道高反應(yīng)型[9]。目前關(guān)于COPD頻繁急性加重型患者血漿EMPs水平檢測(cè)報(bào)道仍然較少，為此本研究檢測(cè)COPD頻繁急性加重型和COPD非急性加重型患者血漿EMPs的水平，以期評(píng)判其與COPD發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2015年11月至2016年8月門(mén)診和住院的COPD穩(wěn)定期患者，COPD診斷、分期參照WHO《慢性阻塞性肺疾病全球倡議》和中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)COPD學(xué)組《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。包括COPD頻繁急性加重型患者59例，年齡(67±8.9)歲，其中男性24例，女性35例；COPD非頻繁急性加重型患者56例，年齡(69±9.7)歲，其中男性33例，女性23例。另收集我院體檢健康人對(duì)照46例，年齡(66±6.9)歲，其中男性29例，女性17例。均填寫(xiě)基礎(chǔ)信息并記錄肺功能檢測(cè)數(shù)值，包括第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)占預(yù)計(jì)值百分比及FEV1占用力肺活量(forced vital capacity, FVC)的百分比。本項(xiàng)目通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 穩(wěn)定期指患者咳嗽、咳痰、氣短等癥狀穩(wěn)定或輕微，且近2個(gè)月無(wú)急性加重史。COPD急性加重期指呼吸困難加重、咳膿痰、痰量增加這3個(gè)主要癥狀中出現(xiàn)2個(gè)，或者一個(gè)主要癥狀合并下列非主要癥狀之一：傷風(fēng)感冒(鼻塞流涕加重)、喘息、咽喉痛、咳嗽、發(fā)熱狀態(tài)持續(xù)2 d以上。COPD頻繁急性加重型定義為每年急性發(fā)作2次或以上，且每次發(fā)作均口服糖皮質(zhì)激素和/或抗生素，或需要住院治療的患者[9，12]。COPD非頻繁急性加重型定義為上一年內(nèi)出現(xiàn)急性加重期次數(shù)<2次。

健康人對(duì)照入組標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)吸煙史；無(wú)慢性咳嗽、咳痰、氣短史；肺功能檢查，F(xiàn)EV1/FVC>0.70及近3個(gè)月無(wú)上、下呼吸道感染。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有嚴(yán)重的心、肝、脾、腎、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、腫瘤和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病及精神病患者(因肺心病本身所引起的心腦疾病不包括在內(nèi))；支氣管擴(kuò)張癥、支氣管哮喘、肺結(jié)核纖維化病變、肺囊性纖維化以及彌漫性泛細(xì)支氣管炎等已知病因及具有特征病理表現(xiàn)的氣流受限疾??；COPD急性加重期時(shí)因呼吸衰竭需氣管插管機(jī)械通氣者。

1.3 主要試劑和儀器 4種EMPs的特異性抗體(美國(guó)BD公司)：FITC標(biāo)記抗CD144抗體(檢測(cè)VE-cadherin用)，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗CD31抗體和PE標(biāo)記抗CD41抗體(檢測(cè)PECAM用)，PE標(biāo)記抗CD146抗體(檢測(cè)MCAM用)，PE標(biāo)記抗CD62E抗體(檢測(cè)E-selectin用)；IL-8雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美公司)；C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)試劑(上?？迫A公司)。Guava 8HT流式細(xì)胞儀(美國(guó)密理博公司)，Thermo酶標(biāo)儀(賽默飛世爾公司)。

1.4 研究方法

1.4.1 標(biāo)本采集及無(wú)血小板血漿(platelets-free plasma,PFP)制備 COPD穩(wěn)定期的患者均由醫(yī)師按照指南[13]指導(dǎo)用藥治療。抽取患者的外周血備檢。5 mL肝素鈉抗凝全血1 500×g離心10 min，小心吸取上清液，13 000×g離心2 min，得到PFP樣本，分裝后-80 ℃保存。

1.4.2 EMPs檢測(cè) PFP樣本從-80 ℃取出，立即放入37 ℃水浴箱中，輕輕搖動(dòng)至全部溶解；4 ℃、120 000×g離心30 min，棄上清，剩余約100 μL，加入500 μL Hanks平衡鹽溶液(Hank′s Balanced Salt, HBSS)重懸；分別取50 μL加入4支流式管，再分別加入特異性熒光標(biāo)記抗體FITC標(biāo)記抗CD144抗體5 μL，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗CD31抗體和PE標(biāo)記抗CD41抗體各5 μL，PE標(biāo)記抗CD146抗體5 μL，PE標(biāo)記抗CD62E抗體5 μL。室溫避光溫育30 min后，加500 μL HBSS重懸后即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每支檢測(cè)的樣本流式管中加入5 μL絕對(duì)計(jì)數(shù)微球(數(shù)量大約8 000～10 000)，微球大小約10 μm。當(dāng)收集5 000個(gè)絕對(duì)計(jì)數(shù)微球后停止計(jì)數(shù)，依據(jù)絕對(duì)計(jì)數(shù)微球的濃度計(jì)算出EMPs濃度(個(gè)/μL)。將前向散射角和側(cè)向散射角設(shè)置于Log通道上，以直徑使用前向角設(shè)門(mén)，使0.8 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球位于門(mén)的右上方，使0.3 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球位于門(mén)的左下方，故門(mén)內(nèi)的微粒大小均<0.8 μm。門(mén)內(nèi)收集到的微顆粒進(jìn)行FITC和PE光強(qiáng)度的分析。本實(shí)驗(yàn)以CD144+表示VE-cadherin，CD31+/CD41-表示PECAM，以CD146+表示MCAM，以CD62E+表示E-selectin。

1.5 IL-8和CRP檢測(cè) 用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中IL-8的含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算各樣本的值。用速率散射法檢測(cè)CRP的含量。

2 結(jié)果

2.1 健康人、COPD頻繁急性加重型和COPD非頻繁急性加重型IL-8和CRP的變化 與健康人對(duì)照組比較，IL-8和CRP在COPD非頻繁急性加重型和COPD頻繁急性加重期型患者中均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-8：t非頻繁=15.22，P非頻繁<0.01，t頻繁=22.6，P頻繁<0.01；CRP：t非頻繁=33.05，P非頻繁<0.01，t頻繁=11.1，P頻繁<0.01)。COPD頻繁急性加重期型患者IL-8和CRP的含量均高于COPD非頻繁急性加重型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-8：t=8.83，P<0.01；CRP：t=11.51，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同型別COPD與對(duì)照組血清IL-8、CRP濃度比較

注：a，與健康人對(duì)照組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；b，與COPD頻繁急性加重型比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 健康人和不同型別COPD患者血漿中EMPs的變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健康人和不同型別COPD患者血漿中EMPs的濃度，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，COPD患者血漿中VE-cadherin、PECAM、MCAM、E-selectin EMPs均有增加。與COPD非頻繁急性加重型患者相比，E-selectin在COPD頻繁急性加重型中顯著升高(t=2.36，P=0.021)。與健康對(duì)照組相比，COPD患者FEV1%和FEV1/FVC%均顯著下降，但COPD頻繁急性加重型和COPD非頻繁急性加重型患者FEV1%和FEV1/FVC%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 COPD頻繁急性加重型和COPD非頻繁急性加重型肺功能及EMPs水平比較

注：a，與健康人對(duì)照組比較,P<0.01；b，與COPD非頻繁急性加重型比較，P<0.01。

2.3 COPD頻繁急性加重型和COPD非頻繁急性加重型EMPs與IL-8、CRP的相關(guān)性分析 COPD頻繁急性加重型血漿E-selectin與IL-8、CRP呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.627、0.792) ，COPD非頻繁急性加重型血漿E-selectin與IL-8、CRP呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.293、0.436)。

3 討論

COPD以持續(xù)性氣流受限為特征，并且氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展。臨床上使用FEV1表示COPD患者氣流受限的程度[13]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EV1與COPD急性加重頻次密切相關(guān)，臨床上也常以FEV1作為評(píng)價(jià)急性加重期的金指標(biāo)[14]。盡管急性加重頻繁發(fā)作與FEV1快速下降相關(guān)，但FEV1并不能很好地區(qū)別 COPD的非頻繁急性加重型和頻繁急性加重型，加之COPD患者中、老年人居多，較難配合肺功能檢測(cè)，因此，F(xiàn)EV1并不是評(píng)判COPD急性加重頻次的唯一因素[15]。本研究結(jié)果也顯示，COPD頻繁急性加重型患者FEV1和FEV1/FVC較COPD非頻繁急性加重型患者低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺血管內(nèi)皮連續(xù)性地襯于血管腔內(nèi)面，參與許多生理和病理過(guò)程，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥因子、過(guò)氧化物和香煙煙霧等有害刺激時(shí)可引起不同表型EMPs的釋放[16]。研究表明，CD31+/CD42b-EMPs水平升高提示肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡，CD31+、CD144+EMPs在COPD急性加重期升高[16]，反之這種升高趨勢(shì)又將進(jìn)一步導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而使血漿EMPs水平進(jìn)一步升高[17]。在急性加重期癥狀消失后EMPs水平還持續(xù)升高，預(yù)示著急性加重引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷在臨床癥狀消失后仍存在。Takahashi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，COPD急性加重期患者血漿中CD144+、CD31+、CD62E+EMPs水平較穩(wěn)定期顯著升高，CD62E+EMPs基線水平的升高提示患者經(jīng)歷急性加重期的次數(shù)將增加。本研究結(jié)果顯示，COPD患者血漿中VE-cadherin、PECAM、MCAM、E-selectin水平均升高，提示COPD患者肺部存在應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，刺激產(chǎn)生大量的內(nèi)皮微粒。COPD非急性加重型和COPD急性加重型患者血漿中EMPs水平比較可知，E-selectin在COPD急性加重型患者血漿中水平升高顯著，患者血漿中高水平的E-selectin提示患者較易出現(xiàn)COPD急性加重。IL-8和CRP是近來(lái)發(fā)現(xiàn)與COPD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的炎癥因子，也是評(píng)判COPD急性加重的主要因子[18-19]。本研究結(jié)果表明，IL-8和CRP在COPD非頻繁急性加重型和COPD頻繁急性加重期型患者中均升高，COPD頻繁急性加重型患者IL-8和CRP的含量始終高于COPD非頻繁急性加重型，且E-selectin在COPD頻繁急性加重型患者血漿中水平升高顯著，并與IL-8和CRP呈正相關(guān)。結(jié)果提示，在COPD頻繁急性加重型患者中炎癥因子持續(xù)高水平表達(dá)，可能是其易發(fā)生急性加重的影響因素。

綜上所述，COPD患者血漿中EMPs的增加預(yù)示著肺內(nèi)皮細(xì)胞損傷，COPD頻繁急性加重型患者血漿中持續(xù)高水平存在E-selectin，預(yù)示患者容易出現(xiàn)急性加重，因此，血漿E-selectin可能作為判斷COPD頻繁急性加重型的生物標(biāo)記物。

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(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.09

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金(2015211C155)。

姜敏，1985年生，女，助理研究員，碩士，主要從事臨床肺病基礎(chǔ)免疫方面的研究。

李風(fēng)森，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：250579087@qq.com。

R563.9

A

2017-05-24)